牛亞運(yùn)，董玉茹，吳士文

抗肌萎縮蛋白亞型Dp140的研究進(jìn)展

牛亞運(yùn)，董玉茹，吳士文

Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良是由抗肌萎縮蛋白基因缺陷所導(dǎo)致肌營(yíng)養(yǎng)不良，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中至少存在6種抗肌萎縮蛋白亞型。Dp140主要在腦中表達(dá)，與認(rèn)知功能損害密切相關(guān)。本文概述Dp140的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)、抗肌萎縮蛋白基因定位、檢測(cè)方法及功能等。

Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良；抗肌萎縮蛋白；Dp140；綜述

[本文著錄格式]牛亞運(yùn)，董玉茹，吳士文.抗肌萎縮蛋白亞型Dp140的研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(3): 308-310.

CITED AS:Niu YY,Dong YR,Wu SW.Progress of dystrophin isoform Dp140(review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017, 23(3):308-310.

Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一種X連鎖隱性遺傳性肌病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性肢體力弱、認(rèn)知功能損害，晚期往往因?yàn)檠h(huán)及呼吸功能衰竭而死亡[1]。

DMD是由抗肌萎縮蛋白基因突變所致。抗肌萎縮蛋白基因位于Xp21，是人類最大的基因之一，長(zhǎng)度超過(guò)2.5 Mbp，占整個(gè)人類基因的0.1%。該基因有79個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白。

抗肌萎縮蛋白由三個(gè)部分組成：N端為肌動(dòng)蛋白結(jié)合域，中段為棒狀區(qū)——24個(gè)血影蛋白樣三螺旋結(jié)構(gòu)，C端為半胱氨酸富集區(qū)。C端作為橋梁使抗肌萎縮蛋白和一組分別位于細(xì)胞外(α-dystroglycan)、細(xì)胞膜(sarcoglycan和β-dystroglycan)及細(xì)胞質(zhì)(syntrophin和dystrobrevin)的蛋白組成抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合體(dystrophin-associated protein complex,DAPC)。DAPC將細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架連接在一起，使肌細(xì)胞膜在肌肉收縮時(shí)保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并能調(diào)節(jié)質(zhì)膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?？辜∥s蛋白基因突變引起抗肌萎縮蛋白缺乏，導(dǎo)致DAPC結(jié)構(gòu)殘缺而被破壞，最終引起進(jìn)展性肌肉無(wú)力[2]。

抗肌萎縮蛋白基因的表達(dá)由至少7個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控，其中3個(gè)上游啟動(dòng)子可調(diào)控表達(dá)全長(zhǎng)的抗肌萎縮蛋白亞型Dp427(主要分布于肌肉，在腦中也有表達(dá))，4個(gè)內(nèi)部啟動(dòng)子可調(diào)控表達(dá)較小的亞型，根據(jù)分子量分別命名為Dp260(主要在視網(wǎng)膜表達(dá))、Dp140(主要在腦、腎和視網(wǎng)膜表達(dá))、Dp116(主要在嬰兒腦和成人的周圍神經(jīng)表達(dá))、Dp71(除了肌肉，在各組織中廣泛表達(dá))和Dp40(在腦中表達(dá))[1,3-8]。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Dp140缺乏與認(rèn)知功能損害相關(guān)，Dp140在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用受到人們更多的重視。

1 Dp140的發(fā)現(xiàn)

1995 年，Lidov等利用多克隆親和純化抗體對(duì)B10小鼠(抗肌萎縮蛋白正常表達(dá))和mdx小鼠(exon23發(fā)生點(diǎn)突變致Dp427表達(dá)缺陷，而所有較小的抗肌萎縮蛋白亞型正常表達(dá))的腦組織進(jìn)行免疫印記分析，均發(fā)現(xiàn)一長(zhǎng)度為140 kDa的蛋白；另外在腎臟中也發(fā)現(xiàn)了這一蛋白，而在骨骼肌、心肌、肺、肝和脾中未發(fā)現(xiàn)。這些研究者對(duì)mdx 3cv小鼠(exon65/66發(fā)生剪接突變導(dǎo)致所有抗肌萎縮蛋白亞型表達(dá)缺陷)的腦組織進(jìn)行Western blotting分析，這一長(zhǎng)度140 kDa的蛋白在嗅球和海馬都缺乏，表明該蛋白是抗肌萎縮蛋白亞型，而非交叉反應(yīng)產(chǎn)生的蛋白，并將其命名為Dp140[4]。1997年，Rodius等[9]確認(rèn)Dp140在視網(wǎng)膜中也有表達(dá)。

2 結(jié)構(gòu)及基因定位

Koenig等[10]對(duì)抗肌萎縮蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在中間棒狀區(qū)的24個(gè)重復(fù)區(qū)段(24個(gè)血影蛋白樣三螺旋結(jié)構(gòu))中，散在分布著4個(gè)非重復(fù)區(qū)段(即鉸鏈)，其中區(qū)段1(75aa)位于N端區(qū)和第1重復(fù)區(qū)段之間，區(qū)段4(72aa)位于第24重復(fù)區(qū)段與半胱氨酸富集區(qū)之間，區(qū)段2(50aa)位于第3和第4重復(fù)區(qū)段之間，區(qū)段3(47aa)位于第19和第20重復(fù)區(qū)段之間。Dp140缺乏結(jié)合肌動(dòng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域及棒狀區(qū)的近段部分，但包含靠近遠(yuǎn)端的5個(gè)重復(fù)區(qū)段及抗肌萎縮蛋白的C端區(qū)域，其中含有一段完整的鉸鏈區(qū)域。

Lidov等利用鼠嗅球cDNA庫(kù)和互補(bǔ)探針雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Dp140 cDNA的5'端部分序列與抗肌萎縮蛋白基因的exon45相同，且Dp140的第一外顯子與exon45毗鄰。通過(guò)對(duì)exon44缺失的患者進(jìn)行基因序列分析，推測(cè)Dp140的第一外顯子位于intron44[4]。這一假設(shè)在后續(xù)的研究中得以證實(shí)。通過(guò)對(duì)Dp140第一外顯子5'端一長(zhǎng)度為3.4 kb序列測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，這一序列包含2個(gè)多態(tài)CA重復(fù)區(qū)段及一側(cè)翼序列，最終將Dp140的第一外顯子定位于intron44[11]。

Dp140的第一外顯子和exon45之間沒(méi)有蛋氨酸密碼子，Dp140的翻譯起始位點(diǎn)出現(xiàn)在第19和第20重復(fù)區(qū)段之間的鉸鏈3區(qū)域；而后進(jìn)一步確定Dp140第一個(gè)框內(nèi)ATG翻譯起始位點(diǎn)出現(xiàn)在exon51[4]。

3 檢測(cè)方法

人們對(duì)Dp140的研究由來(lái)已久，在應(yīng)用二代測(cè)序確定抗肌萎縮蛋白基因的突變情況后進(jìn)一步對(duì)Dp140進(jìn)行確認(rèn)。然而，對(duì)于Dp140表達(dá)是否存在缺陷的評(píng)定尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前常用的檢測(cè)方法如下。

3.1檢測(cè)Dp140第一外顯子

Lidov等[4]利用針對(duì)Dp140第一外顯子的正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)確定Dp140第一外顯子存在與否。Moizard等應(yīng)用同樣的方法對(duì)49例DMD患者進(jìn)行檢測(cè)，在一例exon18-44缺失和一例exon44缺失的患者中，未檢測(cè)到Dp140第一外顯子的存在[12]。

3.2檢測(cè)Dp140啟動(dòng)子區(qū)域的完整性

Kochling等[13]應(yīng)用微衛(wèi)星IVS44SK21和IVS44SK12檢測(cè)Dp140啟動(dòng)子區(qū)域的完整性。Bardoni等[14]應(yīng)用這一方法對(duì)斷裂點(diǎn)發(fā)生在exon44 3'端，同時(shí)Dp140第一外顯子仍然保留的患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些患者均保留Dp140的啟動(dòng)子區(qū)域。

3.3利用抗肌萎縮蛋白基因突變位置預(yù)測(cè)

Wingeier等[15]的研究以intron44中的啟動(dòng)子區(qū)域和/或編碼區(qū)域(從exon51起始的遠(yuǎn)端序列為編碼區(qū))任何部分缺失，判定Dp140表達(dá)受到影響，Dp140的5'端非編碼區(qū)發(fā)生缺失突變也判定為Dp140表達(dá)受到影響。但D'angelo等[16]將突變發(fā)生在或擴(kuò)展至exon45-55認(rèn)定為影響Dp140表達(dá)，而突變發(fā)生在exon44上游則被認(rèn)定Dp140表達(dá)未受影響。Doorenweerd等[16]將突變發(fā)生在intron44的上游認(rèn)定為Dp140表達(dá)，突變涉及exon51或其下游則被認(rèn)為Dp140不能表達(dá)?？辜∥s蛋白基因缺失位置的3'端斷裂點(diǎn)發(fā)生在Dp140啟動(dòng)子及第一外顯子的上游認(rèn)定為Dp140表達(dá)，斷裂點(diǎn)發(fā)生在intron44與exon51之間，認(rèn)定其間序列為Dp140 5'端非編碼區(qū)，無(wú)法確定Dp140是否表達(dá)[8]。

4 功能

4.1在腦中的作用

Dp140主要在腦中表達(dá)。目前對(duì)Dp140在腦中的作用主要集中在Dp140與認(rèn)知功能損害關(guān)系的研究上。在DMD患者中，約1/3存在非進(jìn)展性認(rèn)知功能損害，這些患者的平均智商較年齡匹配的正常人平均約低1~1.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[17]。一項(xiàng)721例DMD患者的Meta分析顯示[16]，DMD患者平均總智商(full scale intelligence quotient,FSIQ)為82，其中19%~35%低于70，3%低于50。

4.1.1認(rèn)知功能

1992 年，Bushby等[18]發(fā)現(xiàn)抗肌萎縮蛋白基因3'端缺失較5'端更易出現(xiàn)智能缺陷。Tokarz等[19]發(fā)現(xiàn)Dp140在胎兒腦中表達(dá)，推測(cè)Dp140表達(dá)缺乏可能與DMD認(rèn)知功能損害有關(guān)。Moizard等[12]對(duì)49例DMD患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變影響Dp140表達(dá)的患者認(rèn)知功能評(píng)分偏低。Bardoni等[13-14]的研究表明，Dp140啟動(dòng)子區(qū)域或編碼區(qū)的突變與認(rèn)知功能損害明顯相關(guān)，強(qiáng)調(diào)Dp140在DMD相關(guān)性認(rèn)知功能損害中的潛在作用。Taylor等[7]對(duì)62例DMD患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與突變發(fā)生在Dp140非編碼區(qū)的患者相比，在Dp140啟動(dòng)子和或編碼區(qū)突變患者的認(rèn)知功能損害更加明顯。

4.1.2語(yǔ)言智商(verbal intelligence quotient,VIQ)

許多研究將VIQ和操作智商(performance intelligence quotient,PIQ)進(jìn)行對(duì)比，大多數(shù)研究表明[20]，DMD患者VIQ損害較PIQ更為明顯。Moizard等[12]發(fā)現(xiàn)，突變分別發(fā)生在抗肌萎縮蛋白基因的近端和遠(yuǎn)端患者的PIQ無(wú)顯著性差別，在VIQ< 70的患者中，絕大部分突變位置發(fā)生在遠(yuǎn)端。但D'angelo等[16]的研究顯示，突變分別發(fā)生在抗肌萎縮蛋白基因近端和遠(yuǎn)端患者的VIQ均較低，遠(yuǎn)端突變患者的PIQ較近端低。更加詳細(xì)的神經(jīng)心理評(píng)定表明，遠(yuǎn)端部分突變患者存在更為明顯的口語(yǔ)短時(shí)記憶、視覺(jué)記憶、視空間結(jié)構(gòu)、邏輯順序、句法處理等障礙，認(rèn)為Dp140表達(dá)缺乏與總體語(yǔ)言功能缺陷明顯相關(guān)，并推測(cè)這與視空間能力、口語(yǔ)與視覺(jué)記憶能力、句法處理能力方面的缺陷有關(guān)。

4.1.3其他

Doorenweerd等[8]對(duì)30例DMD患者進(jìn)行頭顱磁共振彌散張量成像研究，發(fā)現(xiàn)Dp140表達(dá)缺乏患者的部分各向異性指數(shù)(fractional anisotropy,FA)較低，徑向彌散系數(shù)(radial diffusivity, RD)較高，提示Dp140在腦發(fā)育中的重要作用。他們[21]又對(duì)33例DMD患者進(jìn)行腦血流分析發(fā)現(xiàn)，Dp140表達(dá)缺乏患者的腦血流明顯偏低。由于Dp140在與周細(xì)胞相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞終腳和微血管表達(dá)[22]，而周細(xì)胞與血管舒張有關(guān)[23]，提示Dp140在調(diào)節(jié)血管舒張中發(fā)揮一定作用。

4.2在視網(wǎng)膜中的作用

除了Dp116，所有抗肌萎縮蛋白亞型在視網(wǎng)膜中均有表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，Dp427、Dp260和Dp140在光感受器中表達(dá)，Dp71在Müller膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。最近的研究又將Dp427、Dp260和Dp140的表達(dá)精確到視網(wǎng)膜的內(nèi)核層細(xì)胞[24]，其中Dp427在視錐細(xì)胞中的表達(dá)較視桿細(xì)胞多，在雙極細(xì)胞和無(wú)長(zhǎng)突神經(jīng)細(xì)胞中也有所表達(dá)。

Barboni等[25]對(duì)19例DMD患者和7名攜帶者，應(yīng)用全視野視網(wǎng)膜電流圖(full-field flash electroretinogram,ERG)檢查視網(wǎng)膜功能，發(fā)現(xiàn)exon30下游序列發(fā)生突變時(shí)，引起Dp427、Dp260和Dp140表達(dá)異常，進(jìn)而導(dǎo)致暗適應(yīng)(視桿細(xì)胞發(fā)揮作用)ERG發(fā)生改變，而exon30上游序列發(fā)生突變時(shí)，將會(huì)引起明適應(yīng)(視錐細(xì)胞發(fā)揮作用)ERG改變。

關(guān)于Dp140缺乏對(duì)視網(wǎng)膜的影響，許多研究探索的是Dp140及其他一種或幾種抗肌萎縮蛋白亞型均缺乏時(shí)，視網(wǎng)膜發(fā)生的電生理變化。雖未進(jìn)行專門(mén)的探討，但是我們可以推測(cè)Dp140表達(dá)改變可能與視網(wǎng)膜電生理相關(guān)。

Dp140的基礎(chǔ)研究集中在早期，近年來(lái)的研究偏重于臨床。根據(jù)患者抗肌萎縮蛋白基因突變位置，預(yù)測(cè)Dp140表達(dá)，為評(píng)估患者認(rèn)知功能及神經(jīng)心理發(fā)育可能出現(xiàn)的問(wèn)題提供依據(jù)，指導(dǎo)患者的生活及學(xué)習(xí)，改善生活質(zhì)量。

對(duì)Dp140表達(dá)準(zhǔn)確而簡(jiǎn)捷的評(píng)估方法有待進(jìn)一步研究，以便應(yīng)用于臨床。Dp140表達(dá)缺乏對(duì)神經(jīng)心理的影響，也需要深入探討。

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Progress of Dystrophin Isoform Dp140(review)

NIU Ya-yun,DONG Yu-ru,WU Shi-wen
General Hospital of ChineseArmed Police Forces,Beijing 100039,China

WU Shi-wen.E-mail:wu_shiwen@yahoo.com

Duchenne muscular dystrophy is the most prevalent muscular dystrophy caused by dystrophin gene mutations.In the central nervous systerm,there are at least six dystrophin isoforms,in which Dp140 is closely associated with cognitive impairment.This paper reviewed the discovery,structure,gene location,detection methods and function of Dp140.

Duchenne muscular dystrophy;dystrophin;Dp140;review

R746.2

A

1006-9771(2017)03-0308-03

2016-12-19

2017-02-21)

首都臨床特色應(yīng)用研究與成果推廣項(xiàng)目(No.Z151100004015025)。

中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院，北京市100039。作者簡(jiǎn)介：牛亞運(yùn)(1990-)，女，漢族，山東萊州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)肌肉病。通訊作者：吳士文(1970-)，男，漢族，江蘇泗陽(yáng)市人，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)肌肉病和熱射病。E-mail:wu_shiwen@yahoo.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.012