楚秋霞，施巧婷，魏成斌，徐照學(xué)*，丁 巖

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008；2.鄭州市動(dòng)物園，河南 鄭州 450000)

影響體細(xì)胞核移植效率的因素很多,供體細(xì)胞選擇是核移植實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。本文參考近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)方面的資料，從供體體細(xì)胞類型、細(xì)胞年齡、細(xì)胞傳代及細(xì)胞周期對(duì)克隆效率的影響進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

供體細(xì)胞；核移植；克隆效率

*通訊作者： 徐照學(xué)(1961-) ,男,陜西華縣人,研究員，博士,碩導(dǎo)，主要從事動(dòng)物胚胎工程研究。

自從1997年世界首例體細(xì)胞克隆綿羊多莉誕生以來(lái),引起了世界各國(guó)的關(guān)注。接著小鼠、牛、山羊和豬等在多個(gè)物種中陸續(xù)獲得成功。實(shí)踐證明，利用體細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物克隆的技術(shù)是可行的。因此許多研究人員致力于尋找合適的供核細(xì)胞進(jìn)行核移植試驗(yàn)。目前核移植供體核來(lái)源廣泛，種類繁多。大量研究結(jié)果表明，分化程度越低的細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚發(fā)育潛力越高。但由于未分化和低分化細(xì)胞受多種因素的影響，因此不同制備途徑獲取的體細(xì)胞在做為核供體進(jìn)行克隆過(guò)程中所獲得的移植效率也不相同。因此研究人員嘗試對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行多方面的試驗(yàn)以期望獲得適合的供體細(xì)胞，提高重構(gòu)胚的發(fā)育效率。

1 供體細(xì)胞的類型

不同類型供體細(xì)胞對(duì)核移植重構(gòu)胚的構(gòu)建效率不盡相同。Kato 等比較了顆粒細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞和皮膚等組織來(lái)源的細(xì)胞后，認(rèn)為顆粒細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞是較適宜的供體類型[1]。楊素芳等在水牛研究中采用成體成纖維細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞、胎兒皮膚細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞作為供體細(xì)胞來(lái)源用于核移植。結(jié)果顯示, 來(lái)源于卵丘/ 顆粒細(xì)胞的重構(gòu)胚,其融合率、卵裂率和囊胚發(fā)育率都高于其他類型細(xì)胞[2]。龔國(guó)春等的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，對(duì)于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，胎兒輸卵管上皮細(xì)胞所得重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率顯著高于胎兒成纖維細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、成體成纖維細(xì)胞[3,4]。對(duì)于轉(zhuǎn)GFP基因的細(xì)胞，胎兒輸卵管上皮細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的重構(gòu)胚囊胚發(fā)育率顯著高于胎兒成纖維細(xì)胞和胎兒卵巢上皮細(xì)胞，而胎兒輸卵管上皮細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的差異不顯著。通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑對(duì)不同來(lái)源的牛體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后用于核移植，發(fā)現(xiàn)胎兒成纖維細(xì)胞是最有效的轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型[5]。迄今已有胎兒、成體成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等多種體細(xì)胞被用作核供體生產(chǎn)出克隆動(dòng)物。是否所有組織的細(xì)胞都可用于克隆, 目前還不能得出系統(tǒng)的結(jié)論。通常研究人員認(rèn)為顆粒細(xì)胞DNA 能被更有效的重新程序化，利于胚胎的重構(gòu)。胎兒成纖維細(xì)胞便于基因修飾，這兩種細(xì)胞常作為供體細(xì)胞。

2 供體細(xì)胞的年齡

供體細(xì)胞的年齡對(duì)克隆技術(shù)的適用范圍至關(guān)重要?！岸嗬颉毖虻恼Q生為動(dòng)物克隆技術(shù)的研究提供了希望。但隨著多莉的成長(zhǎng), 很多問(wèn)題也隨之產(chǎn)生 ,如出現(xiàn)老化跡象等。研究證明 ,它的端粒長(zhǎng)度與供體羊相似 ,然而端粒的長(zhǎng)短又直接決定著動(dòng)物個(gè)體壽命的長(zhǎng)短[7],也就是說(shuō)從它一出生它就已經(jīng)6歲了。Kato 等在牛上出現(xiàn)類似的情況, 由于選用的是一頭10歲的公牛做為供體，觀察發(fā)現(xiàn)新生克隆小牛體表出現(xiàn)“皺紋”,骨結(jié)構(gòu)與毛質(zhì)都與供體牛相似[1]。供體細(xì)胞年齡在影響動(dòng)物壽命的同時(shí),對(duì)克隆效率的影響也是值得關(guān)注的。楊素芳等研究中發(fā)現(xiàn)成年耳部成纖維細(xì)胞的融合率、卵裂率和囊胚發(fā)育率顯著低于胎兒成纖維細(xì)胞和胎兒皮膚細(xì)胞[2]。但也有研究認(rèn)為，體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育率與供體細(xì)胞動(dòng)物的年齡無(wú)關(guān)。Hill等用同一基因型的成體成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞作供體。它們分別來(lái)自21歲齡婆羅門公牛(Barhmna)和由婆羅門公牛細(xì)胞克隆而來(lái)的40日齡的核移植胎兒。結(jié)果顯示:以這二種供體細(xì)胞進(jìn)行核移植, 它們的囊胚形成率相同[6]。目前，供體細(xì)胞年齡對(duì)重構(gòu)胚的構(gòu)建及后代的產(chǎn)生影響有多大, 還有待進(jìn)一步的研究。

3 供體細(xì)胞的傳代

在體細(xì)胞核移植研究中,人們一直研究體細(xì)胞在多少代時(shí)能獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。多次傳代后是否會(huì)影響基因丟失和基因突變，從而給供體細(xì)胞本身和重構(gòu)胚體外培養(yǎng)帶來(lái)負(fù)面影響。在山羊成纖維細(xì)胞核移植研究中，傳代超過(guò)10代時(shí)，供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的融合率明顯下降，其可能是由于隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的逐漸增加，供體細(xì)胞表面的微絨毛逐漸增加，進(jìn)而限制其和受體細(xì)胞的進(jìn)一步融合[7]。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的倍型也有所改變。以胎兒成纖維細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞為供體進(jìn)行豬核移植，研究發(fā)現(xiàn)3種不同類型細(xì)胞所構(gòu)建的重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚的比例均明顯高于傳代7代以上的細(xì)胞[8]。然而，Kasinathan 等采用15歲牛的體細(xì)胞，傳至10～15代，甚至 18 代的細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植，并未影響核移植胚的發(fā)育潛力[9]。Arat等在克隆轉(zhuǎn)基因牛的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第 15 代的細(xì)胞核移植后，其囊胚率高于培養(yǎng)至第10、第11、第13代的細(xì)胞[10]。以上說(shuō)明核供體細(xì)胞在多次傳代后也能夠獲得好的實(shí)驗(yàn)效果，目前對(duì)于這樣的結(jié)果尚未作出合理的解釋。人們懷疑造成這種克隆研究效率不同的原因可能是不同動(dòng)物種類和細(xì)胞類型的差異造成，因?yàn)椴煌?xì)胞有各自的獨(dú)特性質(zhì),細(xì)胞自身的動(dòng)力系統(tǒng)可能會(huì)隨培養(yǎng)環(huán)境的改變而不同。在試驗(yàn)中通常選用培養(yǎng)10代之內(nèi)的細(xì)胞做為核供體細(xì)胞。

4 供體細(xì)胞的周期

體外培養(yǎng)的細(xì)胞一般都呈快速生長(zhǎng)狀態(tài)，但細(xì)胞分裂是不同步的。在體細(xì)胞克隆過(guò)程中，供體細(xì)胞和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化(synchroniZation)是影響克隆效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。研究人員常用GO/GI期的細(xì)胞做為核供體細(xì)胞[11-12]。處于 G1/G0 期的細(xì)胞, 因?yàn)镈NA未開(kāi)始復(fù)制, 其核為二倍體。Wilmut等利用G0/G1期的乳腺上皮細(xì)胞作為供體細(xì)胞獲得體細(xì)胞克隆綿羊[13]。Kasinathan 等采用接觸抑制法獲得G0/G1做為核供體細(xì)胞獲得體細(xì)胞克隆牛[9]。然而，Wakayama等研究小鼠克隆試驗(yàn)結(jié)果表明，M 期細(xì)胞做供體也能夠獲得克隆小鼠后代[14]。有研究人員利用非G0/G1期顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞做核供體也先后獲得克隆牛和克隆小鼠。然而以上試驗(yàn)結(jié)果并不能完全證明克隆后代就是來(lái)源于M期的供體細(xì)胞，上述試驗(yàn)的供體細(xì)胞中，雖然M期細(xì)胞占主要比例，但是其中也含有一定比例的G0/G1期[15]。雖然有些試驗(yàn)利用M和G2期細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行克隆研究，但是，目前比較統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)是采用 G0/G1 期細(xì)胞作為核供體可以獲得較高的核移植效率。因此在實(shí)驗(yàn)中通常采用血清饑餓和接觸抑制方法對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行周期干預(yù)，獲得高比例G0/G1 期的細(xì)胞，提供充足的供體細(xì)胞。

結(jié)束語(yǔ)：

體細(xì)胞核移植技術(shù)的出現(xiàn)不僅推動(dòng)了早期胚胎發(fā)育機(jī)制的進(jìn)一步研究，也為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研制提供了新的思路,以基因組定點(diǎn)修飾的體細(xì)胞為供體細(xì)胞，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成為可能，從而達(dá)到改良以及傳播優(yōu)良品種。

供體細(xì)胞選擇和制備操作環(huán)節(jié)多、技術(shù)難度大，任意環(huán)節(jié)都會(huì)影響克隆效率。本文從供體細(xì)胞的不同選擇方面對(duì)重構(gòu)胚的構(gòu)建及發(fā)育效率做了簡(jiǎn)單綜述，它是核移植多項(xiàng)環(huán)節(jié)中最基礎(chǔ)和關(guān)鍵的部分，也是影響克隆效率的主要因素之一。因此，為了獲得高效率克隆，我們應(yīng)根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件，從體細(xì)胞克隆的整體效率出發(fā)，優(yōu)化體細(xì)胞克隆中的各項(xiàng)環(huán)節(jié)，以期提高克隆效率，促進(jìn)體細(xì)胞克隆動(dòng)物的獲得。

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