吳紹亮 劉晗 鄧俊花* 范燕茹 陸小蒙

（1.山東省臨沭縣人民醫(yī)院山東臨沭276700；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；3.天津科技大學(xué)）

動物源性中藥材甄別技術(shù)研究進(jìn)展

吳紹亮1劉晗2鄧俊花2*范燕茹2陸小蒙3

（1.山東省臨沭縣人民醫(yī)院山東臨沭276700；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；3.天津科技大學(xué)）

綜述了近年來研究人員在動物源性中藥材物理性狀、指紋圖譜鑒定、色譜、光譜分析以及DNA條形碼、PCR擴(kuò)增等技術(shù)方面的研究進(jìn)展，從而為動物源性中藥材質(zhì)量鑒別提供科學(xué)依據(jù)，保障食品安全。

動物源性中藥材；質(zhì)量；成分；鑒別

1 前言

隨著中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，穿山甲、鹿茸、熊膽、阿膠、牛黃等動物源性珍稀名貴藥材越來越受到人們的青睞。與此同時，由于利益驅(qū)使，假冒偽劣等問題日益嚴(yán)重，亟需真?zhèn)舞b別技術(shù)；此外，有效成分含量也影響著動物源性中藥材的質(zhì)量和藥效[1]。因此，為了滿足上述珍貴動物源性中藥材產(chǎn)品真?zhèn)渭捌焚|(zhì)檢驗(yàn)要求，國內(nèi)外科研人員展開了一系列的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價技術(shù)研究，本文對有關(guān)主要進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

2 動物源性中藥材甄別技術(shù)

2.1 物理性狀鑒定

物理性狀鑒定屬于傳統(tǒng)鑒別方法，主要包括感官性狀鑒定和顯微觀察等方法。對于有豐富鑒別經(jīng)驗(yàn)的鑒定工作者，特別是在野外、缺乏儀器的實(shí)驗(yàn)室、貧困地區(qū)等，物理性狀鑒定有著許多現(xiàn)代技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢，是快速鑒別藥材的主要手段。

2.1.1 感官性狀鑒定

對中藥材包括氣味、色澤、質(zhì)地以及斷面的感觀特征等外觀形態(tài)進(jìn)行主觀鑒別。

陳瑞生等（2013）[2]、劉燦黃等（2014）[3]對穿山甲鱗片研究發(fā)現(xiàn)，真品鱗片紋理不完整，常具劃痕和摩擦后的土跡，而偽品的紋理則較為干凈、完整，無摩擦后的痕跡和土跡。王慧春等（2005）[4]從性狀、色澤、氣味、口感等方面對天然牛黃和偽牛黃、駱駝黃、熊膽黃進(jìn)行了鑒別，發(fā)現(xiàn)天然牛黃體輕、質(zhì)酥脆、氣清香、味苦而后微甜、有清涼感，斷面可見細(xì)密的同心層紋；而偽品牛黃體較重、無清香氣、味苦或甜，斷面粗糙無層紋或有不自然層紋。王淑娟等（2010）[5]亦發(fā)現(xiàn)，穿山甲的新鮮斷面在365 nm波長紫外光下顯黃綠色熒光，混淆品則無熒光。

藥材經(jīng)過搗碎或磨成細(xì)粉后，原有的外表形態(tài)特征大部分消失，用肉眼較難鑒別其真?zhèn)?，因此性狀鑒定多用于初加工產(chǎn)品及現(xiàn)場快速查驗(yàn)，對儀器設(shè)備沒有特殊要求，主要依賴于操作人員的經(jīng)驗(yàn)，主觀性強(qiáng)，具有相當(dāng)?shù)木窒扌浴?/p>

2.1.2 顯微鑒別

借助顯微鏡觀察藥材的內(nèi)部組織構(gòu)造、細(xì)胞形態(tài)，從而對其質(zhì)地和成分組成進(jìn)行大致判定。

劉燦黃等（2014）[3]對穿山甲、樹穿山甲的生甲片和炮制品、塑料偽制品的顯微特征研究發(fā)現(xiàn)，樹穿山甲和中華穿山甲橫切面顯微特征差異明顯，塑料偽制品無細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

陳代賢等（2000）[6]對商品中出現(xiàn)的11種鹿茸進(jìn)行了主要顯微組織比較觀察，發(fā)現(xiàn)麋鹿茸的血管壁有顯著的增厚，豚鹿茸的動脈血管最明顯，瓜哇鹿茸的茸毛最長，而水鹿茸的皮脂腺最大，狗茸有梭形細(xì)胞層，相關(guān)顯微特征為鑒別不同種類鹿茸提供了參考依據(jù)。

傅穎等（2012）[7]運(yùn)用顯微鑒別技術(shù)，對麝香的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，表明野生國產(chǎn)麝香、進(jìn)口俄羅斯麝香、家養(yǎng)國產(chǎn)麝香都與麝香對照藥材具有相似的顯微特征，即有大量無定型顆粒物組成的透明或半透明團(tuán)塊，內(nèi)有不規(guī)則晶體，而人工麝香和麝香偽品則不具有上述顯微特征。

藥材的同名異物比較普遍，有的藥材本身缺少顯著的專屬性鑒別特征，進(jìn)而造成顯微鑒定的復(fù)雜性[8]。因此顯微鑒別法適用于經(jīng)過初級加工、外形改變或者破碎不易感官判定的中藥材。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)鑒別手段逐漸向數(shù)字化技術(shù)發(fā)展。

2.2 中藥指紋圖譜鑒定

中藥指紋圖譜（fingerprinting）是指某種（或某產(chǎn)地）中藥材所共有的、具有特征性的某類或幾類成分的色譜或光譜圖譜，也包括波譜（質(zhì)譜-MS和核磁共振譜-NMR）及聯(lián)用技術(shù)。中藥指紋圖譜可作定性鑒別使用，能以出峰與否及峰高（或峰面積）的比值特異性體現(xiàn)化學(xué)成分的有無及相對含量。中藥指紋圖譜不僅是一種中藥質(zhì)量控制模式和技術(shù)，更可以發(fā)展成為一種中藥作用理論研究和新藥開發(fā)的模式。

2.2.1 色譜法

包括薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和高效毛細(xì)管電泳（HPCE）等技術(shù)方法。

2.2.1.1 TLC

TLC是選用適當(dāng)展開劑，對藥材提取液成分進(jìn)行分離，選取特征斑點(diǎn)進(jìn)行中藥材鑒別。對中藥材進(jìn)行簡單粉碎、消化處理后上色譜柱檢測，根據(jù)各提取液成分及含量不同對其進(jìn)行鑒別比對。此法直觀性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，且操作簡單、快速、可靠。其中比較成熟的是牛黃的鑒別，中國藥典（2015版）規(guī)定天然牛黃TCL測定膽酸含量≥4.0%，膽紅素含量≥35.0%。

郭月秋等（2000）[9]對鹿茸片、鹿茸粉和鹿角粉進(jìn)行TLC鑒別，發(fā)現(xiàn)鹿茸蠟片、粉片在與甘氨酸對照品相應(yīng)位置上均有清晰的斑點(diǎn)，而紗片及骨片此斑點(diǎn)只隱約可見或無，表明鹿茸紗片、骨片不及蠟片、粉片質(zhì)量好。葉志龍等（2014）[10]應(yīng)用TLC法對10批嶺南特色鹿茸飲片所含的氨基酸類成分進(jìn)行定性及半定量研究，結(jié)果表明飲片與鹿茸片的TLC在相同位置有相同顏色的斑點(diǎn)，但是前者顏色不及后者深，說明鹿茸薄片與鹿茸片的氨基酸類成分基本一致，但含量相對較低。程金友（1999）等[11]采用TLC對穿山甲、羊蹄甲、牛蹄甲、豬蹄甲進(jìn)行氨基酸比對，發(fā)現(xiàn)二者所含成分一致，且含量接近，因此提出可尋求穿山甲的替代品。而李寅超（2008）[12]的研究表明，豬蹄甲確實(shí)也具有穿山甲消癰排膿的作用。

2.2.1.2 HPLC

采用HPLC開展中藥成分鑒定是最先發(fā)展起來的中藥化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù)，具有很高的分離度，可把復(fù)雜的化學(xué)成分分離成一系列的色譜峰，這些色譜峰的高度和峰面積分別代表各種不同化學(xué)成分和其含量。

HPLC分析在阿膠等中藥材的鑒別應(yīng)用較為廣泛。程顯隆等（2009）[13]對阿膠水解得到的氨基酸進(jìn)行衍生化后，采用HPLC法測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸4種主要氨基酸的含量，解決了阿膠中人為非法加入含氮化合物的問題。于海英等（2009）[14]采用正己烷-水-氯仿三相靜態(tài)萃取法制備東阿阿膠、龜甲膠樣品中的脂溶性成分，HPLC分析結(jié)果顯示兩種膠間存在著明顯的差異。張貴鋒等（2009）[15]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）方法對胰蛋白酶作用后的阿膠、牛皮膠及豬皮膠水解物進(jìn)行分析，證明通過HPLC-MS檢測樣品膠酶解物的特征多肽可追溯其動物來源。陳萍紅等（2013）[16]運(yùn)用柱前衍生RP-HPLC測定法對阿膠中13種氨基酸的組成及其含量進(jìn)行了分析，為阿膠的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。此外，超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法已廣泛應(yīng)用于各類中成藥中阿膠的檢測研究[17]，如阿膠補(bǔ)血顆粒[18，19]、補(bǔ)血益母丸[20]以及復(fù)方阿膠漿[21]等。

另外，HPLC在其他中藥材的成分分析和質(zhì)量檢測中也較為常用。段志紅（2003）[22]建立了熊膽丸中龍膽苦苷的HPLC檢測方法，對處方藥中龍膽的鑒別具有專屬性，故收入修訂后的熊膽丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。楊仕珉等[23]所建立的安宮牛黃丸HPLC指紋圖譜方法能夠反映安宮牛黃丸中天然牛黃的特征，可鑒別天然牛黃和培植牛黃以及含有天然牛黃和培植牛黃的安宮牛黃丸制劑，可用于安宮牛黃丸的整體質(zhì)量評價。

2.2.1.3 GC

GC是一種具有分析速度快、分離效率高且分析靈敏度高的分離分析方法，近年來應(yīng)用比較廣泛。高其品等（1993）[24]采用GC檢測了鹿茸膠中磷脂酞肌醇、磷脂酞乙醇胺、磷脂酞膽堿、溶血磷脂酞膽堿、神經(jīng)鞘磷脂的含量，并以此作為評價的指標(biāo)成分，為鹿茸的質(zhì)量評價提供了可靠的依據(jù)。池舒耀等（2014）[25]建立了頂空氣相色譜法檢測人工牛黃中的殘留溶劑，對人工牛黃的質(zhì)量檢測提供了快速有效的檢測手段。張皓冰等（2005）[26]采用GC-MS聯(lián)用確定了麝香中19種甾體成分的結(jié)構(gòu)并提出了辨別麝香真?zhèn)蔚奶卣鞣椒?。楊弘等?012）[27]采用GC-MS聯(lián)用分別對野生國產(chǎn)麝香、進(jìn)口麝香和家養(yǎng)國產(chǎn)麝香的多組分進(jìn)行分析，從23個色譜峰中鑒定出了13個化合物，為麝香質(zhì)量的優(yōu)劣提供了判斷依據(jù)。

2.2.1.4 HPCE

HPCE是近年來發(fā)展最快的分析方法之一，其以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間滴度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)液相分離分析。許重遠(yuǎn)等（2007）[28]采用HPCE法對穿山甲及其炮制品進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)二者在酸性提取液的HPCE圖譜有一定差異，因而可以用于區(qū)分。孫績巖等（2014）[29]采用HPCE與隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（HPCE-RAPD）聯(lián)用技術(shù)可用于不同鹿茸樣品的快速真?zhèn)舞b別。

2.2.2 光譜法

光譜法是基于物質(zhì)與輻射能作用時，測量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化能級之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。其中，常用于中藥材鑒別的光譜法主要有近紅外光譜法（NIR）、紫外光譜法（UVS）和X射線衍射光譜法（XRD）等。

2.2.2.1 NIR

近年來，NIR技術(shù)以其整體、快速、無損等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，其中包括中藥材的鑒別。劉姍姍等（2014）[30]基于顯微NIR技術(shù)對天然牛黃和人工牛黃進(jìn)行了鑒別研究，表明顯微NIR技術(shù)可以有效提取牛黃藥材中的多種信息，從而對人工牛黃和天然牛黃進(jìn)行快速有效的鑒別。李文龍等（2014）[31]建立的NIR可實(shí)現(xiàn)對熊膽粉的真?zhèn)舞b別，并可對摻偽品中熊膽粉的摻入比例進(jìn)行定量分析，與傳統(tǒng)的熊膽粉鑒別方法相比，具有快速，樣品無損、樣品信息反映較為完全等優(yōu)點(diǎn)，并可為其他貴重藥材的質(zhì)量鑒別提供借鑒。毛建江等[32]研究發(fā)現(xiàn)采用軟件計算樣品近紅外光譜圖之間的歐氏距離，可反映不同鹿茸樣品間的差異。

在實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常將紅外光譜法與其他分析技術(shù)相結(jié)合，對中藥材進(jìn)行區(qū)別鑒定。如許長華等（2005）[33]人證實(shí)可以采用傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）和二維相關(guān)紅外光譜技術(shù)（2D-IR）對偽阿膠、黃明膠和阿膠進(jìn)行區(qū)分。袁丹等（2010）[34]采用FT-IR法測定熊膽粉、牛膽、豬膽和羊膽IR光譜，研究表明動物膽類藥材具有IR鑒別特征。唐慧英等（2009）[35]研究采用FT-IR結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)技術(shù)根據(jù)特征峰來確定不同等級鹿茸中所含的主要成分，進(jìn)而快速、準(zhǔn)確有效地實(shí)現(xiàn)了對不同商品等級鹿茸的品質(zhì)評價。

2.2.2.2 UVS

采用紫外分光光度法對一些中藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別，簡便易行、可靠性高、重現(xiàn)性好。張思巨等（1998）[36]采用直接紫外分光光度法進(jìn)行光譜分析，發(fā)現(xiàn)商品阿膠、鹿角膠、龜甲膠的光譜圖相似，而自制的鹿角膠、龜甲膠樣品與阿膠有較大區(qū)別。

將UVS與層析法聯(lián)用，也可以對部分中藥材的品質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。王淑娟等（2010）[5]將薄層層析與紫外聯(lián)用對穿山甲鱗片混淆品進(jìn)行色譜分析，發(fā)現(xiàn)在色譜Rf值約0.6的位置上缺少一個斑點(diǎn)，說明穿山甲與混淆品有區(qū)別。

2.2.2.3 X射線衍射Fourier指紋圖譜

呂揚(yáng)等（2000）[37]在粉末X射線衍射Fourier指紋圖譜技術(shù)鑒別中藥材方面做了大量研究，其中對天然牛黃的研究中獲得了天然牛黃X衍射Fourier圖譜（幾何拓?fù)鋱D形與特征標(biāo)記峰值），可用于鑒別正品天然牛黃與人工培植牛黃。張麗等（2005）[38]也應(yīng)用該技術(shù)對1個梅花鹿茸和3個馬鹿茸進(jìn)行分析鑒定，獲得了兩種鹿茸的X射線衍射Fourier指紋圖譜及其特征標(biāo)記峰值，分析發(fā)現(xiàn)兩種來源的鹿茸具有共同的組分性質(zhì)，根據(jù)圖譜不僅可以鑒別不同種屬來源的鹿茸，而且還可以鑒別鹿茸的來源部位（根部、中部或尖部）。大量研究表明，X射線衍射Fourier指紋圖譜技術(shù)在分析鑒別同種中藥材的不同來源方面有著更為廣闊的發(fā)展前景。

2.3 現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，DNA分子技術(shù)越來越多地應(yīng)用于中藥材的鑒別研究，并有準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。DNA分子技術(shù)主要包括DNA條形碼技術(shù)和PCR擴(kuò)增技術(shù)等。

2.3.1 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段。DNA條形碼技術(shù)是一種對物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)，正在逐步應(yīng)用于中藥材的鑒定。陳士林等（2013）[39]通過對大量中藥材樣本進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定研究，確立了以COI為主、ITS2為輔的動物類藥材DNA條形碼鑒定體系。張蓉等（2011）[40]建立的鹿茸藥材DNA條形碼鑒別方法，可用于正品鹿茸馬鹿和梅花鹿及其混偽品的準(zhǔn)確鑒定；進(jìn)而又采用線粒體COI基因，設(shè)計了一對鹿類DNA條形碼通用引物，結(jié)果證明除馬鹿、梅花鹿的個別樣本外，DNA條形碼鑒別方法可有效地鑒定90%的鹿茸樣本，包括鹿茸粉[41]。同樣賈靜等（2014）[42]也利用COI序列作為DNA條形碼對藥材穿山甲及其混偽品進(jìn)行鑒定。類似的左華麗等（2014）[43]基于DNA條形碼，針對馬和驢的線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基I設(shè)計特異性引物，建立PCR方法，用于鑒別阿膠真?zhèn)我约皠游锲しN溯源。市場上麝香中摻入的偽品，如麝鼠香、雞血塊、羊糞便、豬等組織及分泌物，也可以借助COI條形碼進(jìn)行鑒定區(qū)別[44]。

2.3.2 PCR擴(kuò)增

利用PCR擴(kuò)增的方法對物種來源進(jìn)行鑒定在鹿茸方面的研究實(shí)例比較多見，如王學(xué)勇等（2009）[45]根據(jù)鹿科鹿屬種動物Cytb全序列比對分析，設(shè)計1對特異性引物，能準(zhǔn)確鑒別正品鹿茸（包括梅花鹿和馬鹿）和其他近源種鹿茸，能鑒別區(qū)分正品鹿茸與其他近源種鹿茸藥材。涂劍鋒等（2009）[46]根據(jù)鹿科動物線粒體DNA的Cytb基因序列設(shè)計特異性引物1對，可對真?zhèn)温谷走M(jìn)行鑒別。張敏等（2006）[47]對4種茸鹿的SRY基因進(jìn)行擴(kuò)增，從擴(kuò)增的圖象可以準(zhǔn)確地對這4種鹿茸進(jìn)行區(qū)別。白根本等（2006）[48]從馬鹿、梅花鹿等國內(nèi)11種鹿的鹿血和鹿茸中提取DNA，用通用引物L(fēng)1091和H1478調(diào)取細(xì)胞線粒體12S rRNA基因片段，結(jié)果12S rRNA基因片段能較好地在種的水平上將不同的種區(qū)分開來，特異引物對（EP-1/H 1478和EP-2/H 1478）PCR可準(zhǔn)確地鑒定出馬鹿和梅花鹿等。李波等（2006）[49]運(yùn)用細(xì)胞色素b基因（Cytb）和12S核糖體RNA（12S rRNA）基因鑒別梅花鹿和馬鹿。

3 展望

中藥材在中醫(yī)臨床上有著廣泛的應(yīng)用，藥理藥用方面的開發(fā)研究越來越受到重視。由于珍貴動物藥材具有療效高、活性強(qiáng)、應(yīng)用廣、潛力大的特點(diǎn)，故越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。然而市場上動物源性中藥材的偽品繁多且復(fù)雜，嚴(yán)重影響了藥材的質(zhì)量和市場，以往的質(zhì)量控制還僅僅停留在傳統(tǒng)性狀、顯微等經(jīng)驗(yàn)鑒別上，這種狀況嚴(yán)重制約了動物類中藥材的市場發(fā)展，因此改進(jìn)和提高中藥材的鑒別方法非常必要。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和儀器分析水平的快速發(fā)展，動物中藥材的質(zhì)量控制水平也得到了質(zhì)的提高，可以采用光譜、氣/液色譜、質(zhì)譜以及相關(guān)聯(lián)用技術(shù)，研究地道動物源性珍貴中藥材的特異性圖譜鑒別特征；同時，借助日新月異的譜學(xué)技術(shù)以及DNA條形碼、PCR擴(kuò)增等新興分子生物學(xué)檢測技術(shù)，開展特異性功能成分的定性鑒別鑒定乃至定量研究，改進(jìn)動物中藥材標(biāo)準(zhǔn)相對落后的局面，造福食品安全及人類健康。

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Research Progress on the Identification Technology of Animal-Origin Chinese Medicines

WU Shaoliang1，LIU Han2，DENG Junhua2*，F(xiàn)AN Yanru2，LU Xiaomeng3
（1.People’s Hospital of Linshu County，Linshu，Shandong，276700；
2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine；3.Tianjin University of Science&Technology）

To provide research foundation for the scientific distinguishing animal-origin Chinese medicine products from the fakes and inferior products，at the same time，to further protect consumers health，the recent research progress on their physical characterizations，the fingerprinting identification，chromatographic andspectroscopicanalysis，DNAamplification，barcodingandsequencingidentifyingtechnologiesare reviewed in this article.

Animal-Origin Chinese Medicine；Quality；Ingredients；Identification

R282

E-mail：sqwu@sina.com；*通訊作者E-mail：dengqifei-198825@163.com

國家科技支撐計劃項(xiàng)目（2012BAK11B04）

2016-12-01