張立蘋林鄭云肖紅衛(wèi)畢延震鄭新民*

（1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢 430415）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬育種中的應(yīng)用

張立蘋1林鄭云2肖紅衛(wèi)1畢延震1鄭新民1*

（1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢 430415）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠克服物種間的生殖隔離、賦予物種新的優(yōu)良性狀，因此動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因豬也將成為豬業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)，本文將對(duì)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬育種上的應(yīng)用作簡(jiǎn)單的介紹，同時(shí)展望其發(fā)展前景。

轉(zhuǎn)基因豬；育種；應(yīng)用

我國(guó)豬種資源豐富，地方豬種極多且特征各異，在人們不斷馴化與選育下得到的地方豬種大都具備肉質(zhì)優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)、繁殖力高等特點(diǎn)，但無(wú)法克服瘦肉率低、生長(zhǎng)速度慢、飼料轉(zhuǎn)化率低的缺點(diǎn)?，F(xiàn)如今“轉(zhuǎn)基因”已成為了熱門話題，且美國(guó)FDA于2015年11月正式批準(zhǔn)了AquaBounty Technologies公司關(guān)于轉(zhuǎn)基因鮭魚上市的申請(qǐng)[1]，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)正式開(kāi)始搬上人們的餐桌。豬肉在我國(guó)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)占有較大比重，以更高效率養(yǎng)殖生豬也是時(shí)下研究的一大熱門。

1 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過(guò)基因工程技術(shù)把某一特定基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞里，并通過(guò)整合到受體細(xì)胞的基因組中，使該動(dòng)物獲得該基因的遺傳特性，從而改造動(dòng)物品種，獲得人類所需要的特定動(dòng)物的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)的基因交流不同，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用分子生物學(xué)技術(shù)將少數(shù)或個(gè)別基因?qū)胨拗骰蚪M，而且外源基因的來(lái)源更加廣泛[2]。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種是指通過(guò)轉(zhuǎn)基因的手段，采用基因編輯技術(shù)從分子水平對(duì)動(dòng)物進(jìn)行改良，以期得到具有目標(biāo)性狀的動(dòng)物。1997年，克隆羊Dolly的誕生，開(kāi)創(chuàng)了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)的先河[3]，2005年，抗乳房炎轉(zhuǎn)基因牛誕生[4]，2006年，多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因克隆豬的培育成功[5]，標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)入了新的發(fā)展歷程。

近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化迅速發(fā)展，已成為當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域的支柱性產(chǎn)業(yè)。

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬育種中的應(yīng)用

豬是與人類生活關(guān)系極為密切的家畜之一，由于豬具有妊娠期短、繁殖力高和后代生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，因此豬也是常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；又因豬在身體組織部位結(jié)構(gòu)、生理生化等方面均與人類最為接近，所以隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和人民生活水平的提高，轉(zhuǎn)基因豬成為不可或缺的研究模型。

2.1 “環(huán)保豬”

豬在生長(zhǎng)過(guò)程中磷元素是必不可少的，但正常草料中的植物磷難以被豬有效地消化吸收，因此在豬飼料中加入磷元素來(lái)保證豬的磷元素?cái)z取量，但是這樣飼養(yǎng)的豬的糞便會(huì)殘留大量的磷元素，如糞便處理不當(dāng)會(huì)造成嚴(yán)重污染。為了解決這一問(wèn)題，研究人員將大腸桿菌肌醇六磷酸酶基因通過(guò)原核顯微注射導(dǎo)入豬的胚胎，培育出轉(zhuǎn)基因“環(huán)保豬”[6]，“環(huán)保豬”唾液腺分泌的肌醇六磷酸酶能夠有效地消化植物磷，從而不需要在詞料中額外添加磷元素，使糞便中的磷元素含量減少20%～60%，這對(duì)保護(hù)環(huán)境至關(guān)重要。

2.2 提高生長(zhǎng)速度

生長(zhǎng)激素（Growth Hormone,GH）是一種單鏈肽類激素，可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)以外的所有其他組織生長(zhǎng)，因此Hammer[7]和Pursed[8]分別將人和牛的生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)，得到的轉(zhuǎn)基因豬在飼料利用率上提高了約17%，生長(zhǎng)速度提高了10%。我國(guó)科學(xué)家也將豬生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入湖北白豬受精卵中[9]，獲得首批轉(zhuǎn)基因豬，經(jīng)幾個(gè)子代的觀察，生長(zhǎng)速度和飼料利用率分別比同窩豬提高13.4%和10%。面對(duì)中國(guó)豬肉市場(chǎng)的需求，提高生長(zhǎng)速度能夠更好地滿足市場(chǎng)需求，養(yǎng)殖戶也能得得到更多的經(jīng)濟(jì)利益。

2.3 提高瘦肉率

肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）是一種分泌蛋白，呈現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)骨骼肌生長(zhǎng)的活性因子，直接或間接地控制肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,并能控制肌肉量的增長(zhǎng)。當(dāng)其失活的時(shí)候，動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出“雙肌”性狀，在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSTN基因突變的牛、羊等，其中突變牛已被選育成新的肉牛品種，其肉質(zhì)柔軟，脂肪及膽固醇含量低，蛋白質(zhì)含量高，很受到歐洲消費(fèi)者的青睞。但自然選育中，并未發(fā)現(xiàn)MSTN基因突變的豬，為引入MSTN基因的突變，延邊大學(xué)尹熙俊教授團(tuán)隊(duì)與首爾國(guó)立大學(xué)Jin-Soo Kim團(tuán)隊(duì)合作[10]，利用基因編輯技術(shù)將豬內(nèi)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因敲除，最終得到了雙肌性狀的豬，其瘦肉率顯著提高。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所[11]也于2015年成功應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)制備豬肌肉生長(zhǎng)抑制素基因敲除細(xì)胞，并結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)培育出中國(guó)首例超級(jí)瘦肉型豬——“中超916”新品系。

2.4 改善肉質(zhì)

據(jù)報(bào)道，人體內(nèi)ω-6多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,ω-6 PUFAs）與ω-3多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,ω-3 PUFAs）的比例過(guò)高與某些疾病的高發(fā)密切相關(guān)[12]，如糖尿病[13]、冠心病[14]、乳腺癌[15]等；而哺乳動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有將ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化成ω-3 PUFAs的酶，因此需要從天然食物中獲取ω-3 PUFAs。Simopoulos[16]的研究指出，目前人類的飲食，ω-6與ω-3的比值過(guò)高且有逐年上升的趨勢(shì)，而且ω-3 PUFAs來(lái)源沒(méi)有ω-6 PUFAs豐富，因此膳食中ω-6 PUFAs和ω-3 PUFAs的含量在平衡體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常生長(zhǎng)中起著重要作用。2006年，賴良學(xué)等[17]將線蟲(chóng)的Fat-Ⅰ基因轉(zhuǎn)移到豬細(xì)胞中，最終成功獲得了轉(zhuǎn)fat-Ⅰ基因豬，這種基因編碼的蛋白質(zhì)可將豬自然產(chǎn)生的的ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFAs。2016年，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所[18]制備出優(yōu)化的人源化Fat-1基因，人源化Fat-1基因是按照人類密碼子的偏好對(duì)線蟲(chóng)Fat-1基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，部分密碼子替換成人類常用的同類編碼子，使改造后的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有更高的表達(dá)效率，并且在構(gòu)建豬細(xì)胞中高效表達(dá)的質(zhì)粒構(gòu)件pMSTN-ω-3時(shí)采用豬骨骼肌肌球蛋白輕鏈基因（Myosin light chain,Mlc）啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，能夠在肌肉細(xì)胞中高效率表達(dá)Fat-1基因，豬肌肉生長(zhǎng)抑制素基因（myostatin,MSTN）啟動(dòng)子能夠反向抑制Fat-1基因過(guò)量表達(dá)，最后采用原核顯微注射法制備出轉(zhuǎn)hFat-1基因豬。這種轉(zhuǎn)基因豬的組織中有較高含量的ω-3 PUFAs以及較低含量的ω-6 PUFAs，作為一種替代肉源時(shí)，大大提升了豬肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且通過(guò)采用豬源啟動(dòng)子、增強(qiáng)子調(diào)控基因表達(dá)和無(wú)抗生素標(biāo)記基因?qū)耄岣吡宿D(zhuǎn)基因豬人用食品的安全性。

2.5 加強(qiáng)抗病能力

我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)主要面對(duì)的兩種病毒性疾病為豬口蹄疫[19]和豬繁殖與呼吸障礙綜合征（藍(lán)耳病）[20]，這兩種病毒可以造成大規(guī)模感染，嚴(yán)重制約著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。近年來(lái)RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)為此類疾病的解決提供了新的途徑。石河子大學(xué)人畜共患病研究團(tuán)隊(duì)[21]2015年成功制備了抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因豬，其研究成果受到國(guó)際生命科學(xué)頂尖雜志《eLife》高度評(píng)價(jià)，認(rèn)為“該研究成果將RNAi技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)結(jié)合，在國(guó)際上首次成功制備了靶向FMDV的siRNA轉(zhuǎn)基因克隆豬，證實(shí)轉(zhuǎn)基因克隆豬具有抑制口蹄疫病毒復(fù)制的能力，為口蹄疫的防控提供了新途徑、新方法”。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，羅碧平等[22]在成功構(gòu)建特異性靶向PRRSV基因組的高效表達(dá)shRNA質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,將RNAi與轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)結(jié)合,體外生產(chǎn)豬轉(zhuǎn)shRNA基因克隆胚胎，對(duì)豬藍(lán)耳病也有一定的抗性。這些研究進(jìn)展都為抗病轉(zhuǎn)基因豬打下良好的基礎(chǔ)，且具有良好的應(yīng)用前景。

2.6 器官移植

豬的器官大小、形態(tài)與人相似，可以利用基因修飾豬克服物種間的免疫排斥反應(yīng)作為器官移植的供體器官來(lái)源[23]。美國(guó)Revivicor公司已經(jīng)制備了敲除α-1,3-半乳糖苷酶基因（Gal）及轉(zhuǎn)入人類基因（CD46）的轉(zhuǎn)基因敲除豬（GalsafeTMpig），這種豬的細(xì)胞免疫原性更接近人類細(xì)胞，免疫排斥反應(yīng)小，為異種動(dòng)物間器官移植的可行性研究奠定了良好基礎(chǔ)。

2.7 生物反應(yīng)器

轉(zhuǎn)基因豬作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)主要有乳腺系統(tǒng)和血液系統(tǒng)，美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)Willam等[24]成功構(gòu)建在乳腺中特異表達(dá)人蛋白C的轉(zhuǎn)基因豬，其表達(dá)量是正常人血含量的200倍。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所鄭新民等[25]采用顯微注射法，使含有豬血清白蛋白側(cè)翼序列的微小人血清白蛋白基因?qū)胴i的基因組中，成功制備出轉(zhuǎn)人血清白蛋白（HSA）轉(zhuǎn)基因豬，其血液中表達(dá)量高達(dá)20.3 mg/mL[26]，且豬的血漿蛋白質(zhì)再生速度很快，提取表達(dá)的外源蛋白量將非?？捎^，因此利用轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)醫(yī)用蛋白潛力十分巨大。

3 展望

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展的今天，轉(zhuǎn)基因技術(shù)愈加成熟可靠，并與新的基因編輯技術(shù)、胚胎克隆、體細(xì)胞克隆等前沿技術(shù)手段緊密結(jié)合起來(lái)，在不斷改進(jìn)豬的品種為人們帶來(lái)經(jīng)濟(jì)上的利益的同時(shí)，豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)代謝、血液生化指標(biāo)值及疾病發(fā)生機(jī)理等方面與人類極其相似，相比靈長(zhǎng)類動(dòng)物沒(méi)有倫理道德和動(dòng)物保護(hù)方面的限制，加上成本較低，豬已然成為一種理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，目前廣泛用于消化系統(tǒng)、糖尿病、皮膚科、血液病、新藥評(píng)價(jià)等多個(gè)方面，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的動(dòng)物模型能在分子機(jī)制上模擬疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，比傳統(tǒng)的自發(fā)或誘發(fā)性疾病動(dòng)物模型更具有優(yōu)勢(shì)，可以為人們的各種疾病帶來(lái)新的研究途徑，能夠在醫(yī)學(xué)上展現(xiàn)自己的用途。轉(zhuǎn)基因豬作為生物反應(yīng)器，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)賦予豬新的穩(wěn)定遺傳的性狀為人類生產(chǎn)需要的蛋白質(zhì)、藥品原料等，也具有非常好的應(yīng)用前景。

[1]何超.全球首例批準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 [J].湖南農(nóng)業(yè),2016 (9):37.

[2]劉紅林.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)[J].中國(guó)豬業(yè),2016(4):60-61.

[3]Wilmut I,Schnieke AE,Mc Whir J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature,1997, 385(6619):810-813.

[4]Donovan DM,Kerr DE,Wall RJ.Engineering disease resistant cattle[J].Transgenic Res,2005,14(5):563-567.

[5]Lai L,Kang JX,Li R,et al.Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids[J].Nat Biotechnol,2006, 24(4):435-436.

[6]Golovan SP,Meidinger RG,Ajakaiye A,et al.Pigsexpressing salivary phytase produce low-phosphorus manure[J]. Nat Biotcchnol,2001,19(8):741-745.

[7]Hammer RE,Purse VG,Rexroad CE,et al.Production of transgenic rabbits,sheep and pigs bymicroinjection[J].Nature, 1985,35(6021):680-683．

[8]Purxel VG,Pinkert CA,Miller KF,et al.Genetic engineering of Iivestock[J].Science,1989,244(4910):1281-1288.

[9]譚波,鄒孝順.轉(zhuǎn)基因豬的研究進(jìn)展 [J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘, 2016(7):53.

[10]David Cyranoski.Super-muscly pigs created by small genetic tweak[J].Nature,2015,523(2):13-14.

[11]華文君,畢延震,劉西梅,等.CRISPR/Cas9技術(shù)制備豬肌肉生長(zhǎng)抑制素基因敲除細(xì)胞 [J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015(5): 945-949.

[12]伍金華,周克元.調(diào)節(jié)食物中ω-6和ω-3脂肪酸合適比例研究的進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)),2006(2):70-73.

[13]Thorsdottir I,Hill J,Ramel A.Omega-3 fatty from milk associates with lower type 2 diabetes in men and acid coronary heart disease in women[J].Prev Med,2004,39(3):630-634.

[14]Iribarren C,Markovitz JH,Jacobs DRJ,et al.Dietary intake of n-3,n-6 fatty acids and fish:Relationship with hostility in young adults,the CARDIA study[J].Euro J Clin Nutr,2004,58(1): 24-31.

[15]Leitanann MF,Stampfer MJ,Michaud DS,et al.Dietary intake of n-3 and n-6 fatty acids and the risk of prostate cancer [J].Am J Clin Nutr,2004,80(1):204-216.

[16]Simopoulos AP.Importance of the ratio of omega-6/ omeega-3 essential fatty acids:evolutionary aspects[J].World Rev Nutr Diet,2003(92):1-22.

[17]Lai LX,Kang JX,Li RF,et al.Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids [J].Nature Biotechnology,2006,24(4):435-436.

[18]華文君,畢延震,鄭新民,等.轉(zhuǎn)Fat-1基因豬的制備和整合檢測(cè)[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2016.

[19]龔杰.豬口蹄疫的危害與防控措施[J].當(dāng)代畜牧,2015(29): 68-69.

[20]許利琴,王華敏.豬藍(lán)耳病的危害與防控[J].上海農(nóng)業(yè)科技, 2015(4):70,118.

[21]石河子大學(xué)成功制備抗口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因豬[J].豬業(yè)觀察, 2015(4):12.

[22]羅碧平,劇世強(qiáng),馬汝鈞,等.豬靶向PRRS病毒shRNA轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的重編程發(fā)育機(jī)理研究[A].見(jiàn):中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì).中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].北京:中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì).2014.

[23]劉文杰,趙杰,許建香,等.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2014(2):48-55.

[24]Velander WH,Lubon H,Drohan WN.Transgenic livestockas drug factories[J].Scientific American,1997,276(1): 70-74.

[25]鄭新民,魏慶信,喬憲鳳,等.表達(dá)人血清白蛋白轉(zhuǎn)基因豬的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003(1):119-121.

[26]鄭新民,喬憲鳳,楊在清,等.轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因豬的表達(dá)分析[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2002(2):24-26.

S813；Q789

A

1673-4645(2017)04-0026-04

2017-01-18

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2016ZX08006001-005）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心（2017-620-004-001）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金（2016NKYJJ19）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競(jìng)爭(zhēng)性項(xiàng)目（2016jzxjh013）；湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)重大項(xiàng)目（2016ABA117）

張立蘋（1982-），女，河北邢臺(tái)人，主要從事生物技術(shù)研究，E-mail:chzlp1982@163.com

*通訊作者：鄭新民，研究員，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究，E-mail：anbit20@163.com