楚海嬌

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

玉米基因組DNA不同提取方法及提取部位的比較研究

楚海嬌

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

分別探討CTAB法和SDS法對(duì)玉米不同部位基因組DNA的提取效果。綜合比較了2種方法提取的DNA濃度、純度及完整性，結(jié)果表明SDS 法是比較適合玉米基因組DNA提取的方法；同時(shí)比較了以玉米葉片、幼根和成熟胚為材料提取的DNA質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)以新鮮葉片為材料提取的DNA濃度和純度較高，更適合用于玉米基因組DNA的提取。

玉米；基因組DNA；CTAB法；SDS法

基因組DNA是生物體所有遺傳信息的總和。植物總DNA的提取是研究植物DNA的結(jié)構(gòu)和功能，開展外源DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)的前提。玉米是重要的糧食和飼料作物[1]。目前，國(guó)內(nèi)外已開展了大量的玉米分子生物學(xué)研究和基因組學(xué)研究。研究玉米基因的結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)具有目標(biāo)性狀的基因資源，探明基因位點(diǎn)與效應(yīng)，可解決一些育種問(wèn)題；同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)基因育種的使用，可實(shí)現(xiàn)物種之間跨越[2]。

進(jìn)行玉米生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)是大量高質(zhì)量、高純度的玉米基因組DNA的提取[3]，提取的DNA濃度和質(zhì)量對(duì)后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果有較大的影響，因此合適的DNA提取方法非常重要。目前用于制備基因組DNA的方法很多，用于植物基因組提取的方法有CTAB法、SDS法及尿素法等[4]。對(duì)于玉米來(lái)講，不同部位的材料、不同提取方法，DNA的得率不同。適宜的DNA提取方法不僅能夠獲得產(chǎn)量高、純度高、完整性好的DNA，同時(shí)也應(yīng)具備操作程序簡(jiǎn)便、快速、成本低的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米材料為“吉科3536”，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院提供。玉米種植采用盆栽法，待玉米長(zhǎng)至2葉期時(shí)取不同部位，用于DNA的提取純化。

1.2 主要試劑和藥品

CTAB提取液、SDS提取液、飽和酚、氯仿、異戊醇、5M KAc、無(wú)水乙醇、TE緩沖液、5xTBE電泳緩沖液、6x凝膠上樣緩沖液、DNA Marker、核酸染料。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 CTAB法

0.3g玉米材料液氮中研磨→加入CTAB提取液800uL→65℃水浴中提取→有機(jī)溶劑抽提2次→無(wú)水乙醇沉淀DNA→70%乙醇洗滌沉淀→RE緩沖液溶解DNA。

1.3.2 SDS法

0.3g玉米材料液氮中研磨→加入SDS提取液800uL→65℃水浴中提取→有機(jī)溶劑抽提2次→無(wú)水乙醇和5mol/L KAc沉淀DNA→70%乙醇洗滌沉淀2次→RE緩沖液溶解DNA。

1.3.3 基因組DNA濃度和純度的測(cè)定

采用紫外分光光度法進(jìn)行定量分析。取1uLDNA樣品滴加于超微量紫外可見分光光度計(jì)Bionano上，測(cè)定玉米基因組DNA在260nm和280nm紫外光波長(zhǎng)下的吸光度值。由吸光度值計(jì)算核酸分子濃度的公式如下：

dsDNA濃度（ug/mL）=OD260×50ug/mL×稀釋倍數(shù)

基因組DNA純度根據(jù)OD260/OD280的比值來(lái)衡量。純凈的DNA樣品OD260/280在1.8～2.0之間，比值小于1.8，說(shuō)明蛋白質(zhì)或酚未除凈；比值大于2.0，說(shuō)明有RNA污染。

1.3.4 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因組DNA完整性的檢測(cè)

2 結(jié)果與討論

2.1 不同方法提取玉米基因組DNA的結(jié)果分析

2.1.1 DNA濃度和純度檢測(cè)

使用紫外分光光度計(jì)分別對(duì)CTAB法和SDS法提取的玉米基因組DNA樣品進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 不同方法提取玉米DNA的濃度和純度比較

由表1可知，CTAB法與SDS法相比，玉米不同部位提取的基因組DNA在純度上均無(wú)較大差別，并且DNA的OD260/280都在最佳范圍1.8～2.0之間，說(shuō)明2種方法所提取的DNA樣品純度較高，基本上無(wú)RNA、蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)存在。

圖1 CTAB法和SDS法提取DNA的濃度比較

由表1可知，CTAB法提取的玉米成熟胚、葉片及幼根的DNA濃度分別為：104.90ug/mL 、323.95ug/mL、148.20ug/mL；SDS法提取玉米葉片、幼根及成熟胚的DNA濃度分別為：152.50ug/mL、359.30ug/mL、191.45ug/mL。由圖1可直觀看出，對(duì)于相同玉米材料，采用SDS法提取的基因組DNA濃度均比CTAB法提取的濃度高，因此，SDS法更適宜用作玉米基因組DNA的提取方法。

圖2 不同方法提取的玉米基因組DNA電泳圖譜

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

從圖2可以看出，采用CTAB法和SDS法提取玉米葉片基因組DNA的電泳條帶都比較清晰，說(shuō)明均獲得了一定量的DNA。SDS法提取的玉米葉片DNA條帶明亮且無(wú)拖尾痕跡，說(shuō)明DNA含量較高；CTAB法提取的玉米葉片DNA條帶雖無(wú)明顯拖尾，但條帶較弱，說(shuō)明DNA含量較低。由此得出SDS法是提取玉米基因組DNA較好的方法。

2.2 不同部位提取玉米基因組DNA的結(jié)果分析

2.2.1 DNA純度和濃度檢測(cè)

使用紫外分光光度計(jì)分別對(duì)SDS法提取的玉米成熟胚、葉片及幼根基因組DNA樣品進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 SDS法提取的玉米不同部位DNA的純度和濃度

由表2可知，玉米不同提取部位所提取的DNA含量存在一定差異。SDS法提取的玉米葉片DNA濃度為359.30ug/mL，達(dá)到分子生物學(xué)的要求高于200ug/mL。而從玉米幼根和成熟胚中所提DNA的濃度分別為191.45ug/mL 和152.50ug/mL，DNA含量相對(duì)較些，這主要是因?yàn)橛衩壮墒炫吆陀赘械牡鞍踪|(zhì)、碳水化合物、淀粉等含量比新鮮葉片中高，而在DNA提取過(guò)程中，這些物質(zhì)均被作為雜質(zhì)除去，因此會(huì)影響到DNA的提取[6]。同時(shí)玉米不同部位基因組DNA的OD260/280均在最佳范圍1.8～2.0之間，說(shuō)明所提取的DNA樣品純度較高，基本上無(wú)RNA、蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)存在。從而說(shuō)明玉米葉片較適宜作為提取玉米基因組DNA的材料。

圖3 不同部位基因組DNA電泳圖譜

2.2.2 脂糖凝膠電泳檢測(cè)

由圖3可知，以玉米葉片為材料，提取的DNA條帶清晰明亮，無(wú)拖尾痕跡，從成熟胚和幼根中提取的DNA均無(wú)拖尾痕跡，但條帶較弱，并且成熟胚中最弱，這可能是由于成熟胚中富含多糖類等儲(chǔ)藏性成分，大大增加了提取DNA的難度，同時(shí)由于成熟胚經(jīng)液氮處理后比較堅(jiān)硬，研磨時(shí)可能造成了DNA的降解。由此可見，新鮮葉片更適合作為玉米基因組DNA提取和分子生物學(xué)研究的材料。

3 結(jié)論

提取高質(zhì)量的DNA樣品是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的的關(guān)鍵步驟。本試驗(yàn)為了得到優(yōu)良的玉米基因組DNA提取方法及適宜的玉米材料，分別采用CTAB法和SDS法對(duì)玉米葉片、幼根及成熟胚3個(gè)不同部位的基因組DNA進(jìn)行提取，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SDS法提取玉米葉片基因組DNA可獲得高純度、高濃度的DNA。此認(rèn)為SDS法是提取玉米基因組DNA較好的方法，新鮮葉片更適合作為玉米基因組DNA提取的材料。在試驗(yàn)中應(yīng)將玉米DNA的不同提取方法與所用材料結(jié)合起來(lái)考慮。

為了獲得高質(zhì)量高純度DNA，在選取材料時(shí)應(yīng)盡量選取新鮮的實(shí)驗(yàn)材料，因?yàn)樾迈r材料次生代謝產(chǎn)物少、DNA含量高[7]；在加入液氮研磨時(shí)，速度要快，研磨要充分并始終保持材料的超低溫狀態(tài)，避免DNA的降解和酚類氧化；在轉(zhuǎn)移上清液時(shí)應(yīng)避免將中間層吸起，以減少雜質(zhì)的吸入量；在DNA提取過(guò)程中，所有操作均需動(dòng)作輕柔，避免劇烈振蕩使大分子DNA斷裂。本試驗(yàn)采用2種方法提取DNA時(shí)，均采用Tris飽和酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇2次抽提，得到的DNA純度較高。由此表明，此方法更能有效的去除蛋白質(zhì)。

[1]魏琦超，暢麗萍，周巖，等.一種簡(jiǎn)便實(shí)用的玉米干種子基因組DNA提取方法[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(6)：165-167.

[2]賈繼增.分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，29(4)： 1-10.

[3]陳慶山，劉春燕，呂東，等.大豆DNA提取原理的探討[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004， 35(2)：151-153.

[4]周春陽(yáng)，謝立波，李景富，等.辣椒葉片基因組DNA提取方法的研究[J].辣椒雜志，2011(3)：35-37.

[5]劉哲，劉慶平，孫霞，等.幾種基因組DNA提取方法的比較研究[J].技術(shù)論壇，2011：68-72.

[6]陳麗麗，張鵬，黃新，等.玉米基因組DNA提取及濃度測(cè)定方法評(píng)價(jià)[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011(12)：71-74.

[7]易慶平，羅正榮，張青林.植物總基因組DNA提取純化方法綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(25)：7789-7791.

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10.11974/nyyjs.20161232006