賈曉，程艷，曾溢滔

線粒體與體細(xì)胞核移植

賈曉，程艷，曾溢滔

1996 年克隆羊“Dolly”在英國(guó)誕生。此后，體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)廣泛應(yīng)用于克隆動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究，迄今已有 10 多種不同物種的克隆動(dòng)物相繼問世。然而，克隆效率偏低以及克隆動(dòng)物表征缺陷是一直存在的問題。核質(zhì)的互作與協(xié)調(diào)是所有細(xì)胞正?；顒?dòng)的基礎(chǔ)，克隆胚重編程和正常核型的維持取決于供體核與受體卵母細(xì)胞的同步協(xié)調(diào)和相互作用[1]。作為細(xì)胞能量來源的線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一具有自身遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，其正常功能的行使受到核基因組和線粒體基因組的共同調(diào)控。在核移植實(shí)驗(yàn)中，卵母細(xì)胞的線粒體 DNA（mitochondria DNA，mtDNA）與供體細(xì)胞的核 DNA 能否有效地協(xié)同工作是影響核基因組重編程效率的一個(gè)重要因素。mtDNA 在不同物種之間、同一物種不同個(gè)體間均存在大量的核苷酸差異，這種由 mtDNA 多態(tài)性產(chǎn)生的不同mtDNA 單倍型也可導(dǎo)致種內(nèi)核－線粒體互作產(chǎn)生不同效應(yīng)。此外，克隆胚胎中，存在受體卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞兩種來源的線粒體，這兩種線粒體的相互作用影響著重構(gòu)胚的發(fā)育。本文對(duì) SCNT 中線粒體的功能與特性以及兩種來源的線粒體的異質(zhì)性及其對(duì)克隆效率和重構(gòu)胚發(fā)育的影響進(jìn)行綜述和討論。

1 SCNT 中的線粒體生物學(xué)

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量。線粒體內(nèi)膜有一系列酶組成傳遞電子并產(chǎn)生能量的結(jié)構(gòu)，即呼吸鏈酶復(fù)合體，呼吸鏈產(chǎn)生的能量供給 ADP 與無機(jī)磷酸合成 ATP，這一過程稱為氧化磷酸化。線粒體通過呼吸鏈和氧化磷酸化的偶聯(lián)來產(chǎn)生并供給能量。線粒體含有自身的遺傳物質(zhì)—— mtDNA。mtDNA 呈雙鏈環(huán)狀，大小約為 16.5 kb，共有 37 個(gè)編碼基因，呼吸鏈酶復(fù)合體中的 13 個(gè)蛋白質(zhì)亞基由 mtDNA 編碼，而其他蛋白由核基因編碼[2]。mtDNA 和核 DNA 相互協(xié)調(diào)才能保證線粒體正常供能。

在 SCNT 中，線粒體最基本的功能是為卵母細(xì)胞的成熟和克隆胚胎的發(fā)育提供能量[3]。研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi) ATP供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致發(fā)育缺陷：如染色體分離障礙[4]、細(xì)胞分裂中斷、卵母細(xì)胞成熟失敗[5]等。在核移植操作過程中，外界的機(jī)械壓力導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量升高，ROS 含量過高會(huì)誘發(fā)線粒體呼吸鏈蛋白的編碼基因發(fā)生突變，從而阻斷氧化磷酸化，使線粒體不能正常供能。已有研究報(bào)道，與正常胚胎相比，克隆胚胎中H2O2和 OH-自由基的水平較高，線粒體膜電位較低[6]。膜電位是線粒體勢(shì)能儲(chǔ)備的指標(biāo)。膜電位降低，可引起線粒體膜內(nèi)外一系列的生化變化，如誘導(dǎo)細(xì)胞色素 C 釋放，活化caspase 蛋白酶家族，呼吸鏈與氧化磷酸化失偶聯(lián)，三磷酸腺苷合成停止，線粒體膜通透性改變，釋放凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）等，引起細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。Bae 等[8]在牛核移植操作過程中用抗氧化劑處理受體細(xì)胞和重構(gòu)胚發(fā)現(xiàn) H2O2水平下降，線粒體膜電位增高，克隆胚的損傷減少，保證了后續(xù)胚胎發(fā)育的正常進(jìn)行?？寺∨咛ブ袚p傷線粒體的增多會(huì)導(dǎo)致胎盤凋亡以及凋亡基因 BCL2 和 BAX 的異常表達(dá)[9]。因此，SCNT 中線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性至關(guān)重要。

2 SCNT 中線粒體與供體核相容性的研究

核質(zhì)的互作與協(xié)調(diào)是細(xì)胞正常活動(dòng)的基礎(chǔ)，體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚正常核型的維持和核基因組重編程的完成，同樣取決于供體核與受體卵母細(xì)胞的同步協(xié)調(diào)和相互作用。核質(zhì)互作是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，與兩者的功能狀態(tài)及其相互作用是否符合細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律有關(guān)，涉及供核細(xì)胞的類型、所處的細(xì)胞周期以及卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量和處理方式等多個(gè)因素。研究發(fā)現(xiàn)使用卵胞質(zhì)抽提物預(yù)處理供體細(xì)胞可以顯著提高核移植胚胎囊胚率，推測(cè)卵胞質(zhì)抽提物改變了供體核的結(jié)構(gòu)，增加了供體核與卵胞質(zhì)中重編程因子的相互協(xié)調(diào)作用使得受體卵母細(xì)胞更容易重編程供體核[10]。Enright 等[11]用一種組蛋白去乙?；敢种苿┕徘顾?A（TSA）處理供體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) TSA 可增加供體核的組蛋白乙?；?，促進(jìn)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，提高克隆囊胚率。

線粒體作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一具有自身遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，不僅參與能量供應(yīng)，而且可以通過 mtDNA 合成自身功能相關(guān)的部分蛋白質(zhì)，同時(shí)又受到核的調(diào)控，參與線粒體合成及功能行使的蛋白質(zhì)中，大約有 1500 種由核基因編碼[12]。線粒體正常功能的行使受到核基因組和線粒體基因組的共同調(diào)控，是研究核質(zhì)互作的良好材料。已有研究指出線粒體與核編碼產(chǎn)物不相容性可能是異種體細(xì)胞核移植失敗的重要原因。在異種體細(xì)胞核移植中，羊、猴、豬和大鼠的體細(xì)胞移植到去核牛卵母細(xì)胞中，經(jīng)融合后可以支持重構(gòu)胚的早期發(fā)育，但是移植到代孕動(dòng)物后不能著床[13]。很可能因?yàn)樵缙谥貥?gòu)胚中母源性線粒體可以暫時(shí)獨(dú)立供應(yīng)ATP，而在稍后的發(fā)育階段，不同物種的核基因組與 mtDNA不能很好地兼容，核基因組無法指導(dǎo)母源性 mtDNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，組裝新的氧化磷酸化復(fù)合物和合成 ATP，從而導(dǎo)致發(fā)育失敗。因此，供體核和受體卵胞質(zhì)的相容性對(duì)于核正確重編程和克隆胚的發(fā)育至關(guān)重要。

mtDNA 處于高氧壞境，并且缺乏 DNA 損傷修復(fù)機(jī)制，因此其突變率遠(yuǎn)高于基因組 DNA[14]。這種高突變率導(dǎo)致不同種群之間，以及同一種群的不同個(gè)體之間的 mtDNA存在多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù) mtDNA 的多態(tài)性位點(diǎn)可將其劃分為不同的單倍型。單倍型是指使用特定限制性內(nèi)切酶酶切特定 DNA 片段后產(chǎn)生的特定酶切片段格局。mtDNA 單倍型的不同，反映 mtDNA 基因組的差異，不僅能引起生物性狀包括體重、耗氧量、ATP 含量、卵子質(zhì)量、產(chǎn)奶量及生育能力[15]等差異，還會(huì)影響體外胚胎生產(chǎn)（IVP）的效率[16]，以及體細(xì)胞核移植（SCNT）的效率[17]。

據(jù)此，我們團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用 PCR-RFLP 技術(shù)分析牛 mtDNA的多態(tài)性，建立了線粒體分型標(biāo)準(zhǔn)，將牛群區(qū)分成 4 種主要的單倍型[17]。我們通過活體采卵（oocyte pick up，OPU）技術(shù)，獲得單倍型確定的牛卵母細(xì)胞，用作受體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同單倍型的卵母細(xì)胞具有不同的發(fā)育潛能，并影響克隆的效率。當(dāng)采用 A 型卵母細(xì)胞作核移植的受體細(xì)胞時(shí)，其融合率和囊胚率均顯著高于使用B 型卵母細(xì)胞[17]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) A 型線粒體單倍型的牛卵母細(xì)胞中 mtDNA 拷貝數(shù)和 ATP 的含量以及 mtDNA編碼基因的表達(dá)水平均明顯高于 B 型單倍型的卵母細(xì)胞，這可能就是產(chǎn)生上述不同克隆效果的原因[17]。

在體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)中，供體細(xì)胞核與卵母細(xì)胞來自同一個(gè)體的，稱之為“同體克隆”；而兩者來自不同個(gè)體的，稱之為“異體克隆”[18]。我們?cè)缙诘难芯堪l(fā)現(xiàn)同體克隆的效率要明顯高于異體克隆，尤其是在 8 細(xì)胞以后的發(fā)育階段，同體克隆的囊胚率（38%）明顯高于異體克?。?2%）[18]。分析“同體克隆”和“異體克隆”兩者的區(qū)別：前者的供體細(xì)胞和卵母細(xì)胞的線粒體單倍型是相同的，或者說是相容的，而后者就不一定相同或相容。為了進(jìn)一步研究在核移植中供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞線粒體的相容性對(duì)克隆效率的影響，我們按照牛卵母細(xì)胞和供核細(xì)胞的單倍型來配型進(jìn)行核移植試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同型組（卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞的線粒體單倍型相同，即 A-A 或 B-B）的克隆效率，包括囊胚率、懷孕率和活產(chǎn)率均明顯高于異型組（A-B 或 B-A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，同型克隆組重構(gòu)胚中的表觀遺傳修飾，包括組蛋白H3K9 甲基化模式以及重要的胚胎發(fā)育相關(guān)基因 Oct4、Nanog 和 Sox2 的啟動(dòng)子的甲基化，更接近于正常胚胎發(fā)育的水平[19]。

此外，在牛同種內(nèi)（荷斯坦奶牛或魯西黃牛）核移植實(shí)驗(yàn)中，觀察到上述的線粒體單倍型和配型對(duì)克隆效率的影響，在亞種間（荷斯坦牛與黃牛之間）核移植中也同樣觀察到[20]。以上結(jié)果說明，卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞線粒體的相容性一方面促進(jìn)供體細(xì)胞核的重編程，另一方面讓供體核編碼的線粒體相關(guān)蛋白及調(diào)控因子能夠更好地參與卵母細(xì)胞胞質(zhì)中線粒體的組成和調(diào)控，從而更好地支持重構(gòu)胚的發(fā)育。

3 SCNT 重構(gòu)胚中線粒體異質(zhì)性的研究

哺乳動(dòng)物通過受精獲得的正常胚胎中線粒體具有同質(zhì)性，即只有卵母細(xì)胞來源的線粒體，而精子線粒體在進(jìn)入卵母細(xì)胞之前被一種蛋白水解肽-泛素標(biāo)記，進(jìn)入卵母細(xì)胞后被卵母細(xì)胞中的泛素蛋白酶系統(tǒng)識(shí)別并降解[21]。然而，也有報(bào)道在小鼠[22]和人類[23]等多個(gè)物種中也存在精子線粒體滲漏事件，若后代中精卵兩種線粒體的單倍型不同便會(huì)造成線粒體的異質(zhì)性，可能導(dǎo)致自發(fā)或選擇性流產(chǎn)。

和正常受精產(chǎn)生的胚胎不同，克隆胚胎是通過核移植操作獲得的。哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植主要有兩種操作方法：一種是胞質(zhì)內(nèi)注射，即將供體核連帶部分細(xì)胞質(zhì)注入去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)中；另一種是透明帶下注射，即將供體細(xì)胞直接注入去核卵母細(xì)胞的透明帶下。無論采用哪種操作方法都不可避免地會(huì)將供體細(xì)胞的線粒體帶入受體卵胞質(zhì)中，從而使重構(gòu)胚中存在兩種來源的線粒體，導(dǎo)致克隆后代中全部細(xì)胞或部分細(xì)胞同時(shí)存在兩種來源的線粒體，形成線粒體異質(zhì)性[24]。

克隆胚中線粒體的異質(zhì)性程度與核移植實(shí)驗(yàn)的操作方法、供體細(xì)胞類型、供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞的親緣關(guān)系等多種因素有關(guān)。從已有的研究報(bào)道來看，在同種內(nèi)的核移植中，大多后代的線粒體主要來源于核受體[25-27]。這可能由于供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞在遺傳上親緣關(guān)系較近，核基因編碼線粒體復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的因子能有效地支持受體卵母細(xì)胞來源的線粒體的發(fā)育，核供體來源的線粒體則經(jīng)類似泛素化途徑得到降解。而在遠(yuǎn)緣異種核移植的研究中存在兩種不同的結(jié)果。Lanza 等[28]和 Loi 等[29]分別通過異種核移植獲得了 3 頭克隆野牛和 1 頭克隆盤羊，在 3 頭克隆野牛的11 種不同組織以及盤羊的血液中均只檢測(cè)到受體卵母細(xì)胞來源的線粒體。我國(guó)科學(xué)家陳大元等在大熊貓與兔子的異種核移植研究中得到相反的結(jié)果。他們將大熊貓的體細(xì)胞移入去核兔卵母細(xì)胞中，采用大熊貓和兔線粒體 D-LOOP 區(qū)特異的引物擴(kuò)增植入前囊胚和妊娠后胎兒中的 mtDNA，結(jié)果顯示克隆囊胚中大熊貓及兔來源的線粒體共存，而著床后的胎兒中線粒體主要來源于供體大熊貓[30]。這可能由于早期的胚胎編碼線粒體復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的因子也同時(shí)表達(dá)；而隨著胚胎發(fā)育，當(dāng)核供體與核受體在遺傳上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，核基因編碼的因子只能支持核供體來源的線粒體的發(fā)育。

不管造成克隆胚線粒體異質(zhì)性的原因如何，已有的資料表明，克隆胚中線粒體的異質(zhì)性可能是克隆效率低下，克隆胚胎流產(chǎn)率高，后代存活率低的重要原因之一。Lee 等[31]用綿羊成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞，培養(yǎng)到第四代時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加 50 ng/ml 的溴化乙錠去除 mtDNA，待供核細(xì)胞培養(yǎng)到第十代，mtDNA 的含量下降至初始含量的1.05%。以此細(xì)胞作為核移植的供核細(xì)胞獲得的 SCNT 胚胎中只有受體卵母細(xì)胞 mtDNA，克隆后代存活率顯著提高。這也很好地解釋了為什么同體克隆效率明顯高于異體克隆。

4 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞核移植技術(shù)具有重大的理論意義和實(shí)際價(jià)值，它不但是研究探索動(dòng)物發(fā)育規(guī)律的一種重要技術(shù)手段，同時(shí)也已廣泛應(yīng)用到農(nóng)牧和生物醫(yī)藥的各個(gè)領(lǐng)域。然而，體細(xì)胞核移植目前還存在不少問題，如核移植成功的總體效率仍較低、核移植的胚胎流產(chǎn)率仍然較高以及胚胎發(fā)育異常如“巨胎癥”等問題?？寺∨咛サ陌l(fā)育依賴于供體核和受體卵母細(xì)胞的相互作用，近年來的研究表明線粒體在體細(xì)胞核移植中發(fā)揮重要的作用，線粒體基因組的多態(tài)性，核基因組與線粒體基因組相容性以及重構(gòu)胚中線粒體的異質(zhì)性對(duì)克隆效率及克隆后代發(fā)育有重要影響。細(xì)胞核移植技術(shù)應(yīng)用廣泛，如在保護(hù)瀕危物種、繁育優(yōu)良畜種以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥等；另外，在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域，核移植技術(shù)使干細(xì)胞和組織工程在疾病治療中的應(yīng)用展現(xiàn)出廣闊的前景。相信隨著相關(guān)研究的不斷深入，科學(xué)家們將進(jìn)一步揭示核質(zhì)互作的分子機(jī)制，有效地提高克隆的效率，讓克隆技術(shù)更好地應(yīng)用于醫(yī)、藥、農(nóng)、研等多個(gè)領(lǐng)域。

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“兒童安全用藥促進(jìn)計(jì)劃”項(xiàng)目啟動(dòng)

“兒童安全用藥促進(jìn)計(jì)劃”由藥品安全合作聯(lián)盟（PSM）、北京藥盾公益基金會(huì)共同主辦，通過開展兒童安全用藥關(guān)鍵技術(shù)研究，對(duì)臨床醫(yī)務(wù)工作者進(jìn)行兒童安全用藥相關(guān)技能培訓(xùn)，廣泛開展兒童安全用藥知識(shí)的宣傳和普及活動(dòng)，促進(jìn)我國(guó)兒童用藥安全，提升公眾安全用藥科學(xué)素質(zhì)，為“藥品安全”規(guī)劃和“健康中國(guó)”戰(zhàn)略服務(wù)。2016 年該項(xiàng)目納入國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局“全國(guó)安全用藥月”活動(dòng)。

2017 年，項(xiàng)目繼續(xù)分為兩個(gè)組（研究組和活動(dòng)組）實(shí)施。研究組由北京兒童醫(yī)院牽頭，攜同有關(guān)專家設(shè)立“中國(guó)兒童家庭用藥科普干預(yù)研究”課題；活動(dòng)組由 PSM 五個(gè)地區(qū)志愿者團(tuán)隊(duì)牽頭走進(jìn) 50 家幼兒園，開展“安全用藥 娃娃抓起”科普宣傳活動(dòng)，活動(dòng)以專家講座的形式進(jìn)行兒童安全用藥科學(xué)知識(shí)普及。向幼兒家長(zhǎng)發(fā)放《中國(guó)兒童家庭用藥情況調(diào)研問卷》進(jìn)行兒童用藥情況調(diào)查。并向活動(dòng)幼兒園贈(zèng)送安全用藥科普?qǐng)D書《媽咪藥師談兒童合理用藥》，對(duì)幼兒園老師和家長(zhǎng)進(jìn)行用藥指導(dǎo)，以增強(qiáng)安全用藥意識(shí)。我會(huì)是 PSM 的副理事長(zhǎng)單位，作為管理辦公室負(fù)責(zé)項(xiàng)目的日常管理工作。

北京醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)于2017年4月27日在北京成立

北京醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)是由北京市民政局批準(zhǔn)成立的具有非企業(yè)獨(dú)立法人資格的學(xué)術(shù)團(tuán)體，于 2017年 4 月 27 日在北京成立。學(xué)會(huì)的宗旨為“提高首都檢驗(yàn)檢測(cè)能力，搭建多學(xué)科交流平臺(tái)”。該學(xué)會(huì)是由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院、解放軍總醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院、北京廣安門醫(yī)院、中國(guó)藥品生物制品檢定研究院、中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院等單位專家共同發(fā)起成立，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科康熙雄教授任首屆會(huì)長(zhǎng)。

隨著表觀遺傳學(xué)、基因工程與蛋白工程等新技術(shù)的發(fā)展，對(duì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)提出了更高、更迫切的要求，學(xué)會(huì)初期擬下設(shè)八個(gè)分委會(huì)：醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室與診斷產(chǎn)品質(zhì)量管理專業(yè)委員會(huì)；生物組學(xué)專業(yè)委員會(huì)；測(cè)試評(píng)價(jià)專業(yè)委員會(huì)；生物化學(xué)免疫專業(yè)委員會(huì)；微生物與感染專業(yè)委員會(huì)；體液和血液學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)委員會(huì)；體外診斷系統(tǒng)工程技術(shù)專業(yè)委員會(huì)；臨床輸血專業(yè)委員會(huì)。根據(jù)國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作中存在的問題與實(shí)際需要將陸續(xù)成立相關(guān)的分委會(huì)，共同推動(dòng)各專業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展。

學(xué)會(huì)將以北京為中心，輻射京津冀開展學(xué)術(shù)交流；以學(xué)會(huì)為單位申報(bào)各類科研項(xiàng)目，協(xié)調(diào)開展多中心科學(xué)研究；加強(qiáng)科普宣傳教育和義診等公益活動(dòng)，推動(dòng)京津冀檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的學(xué)科發(fā)展。

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.011

中國(guó)工程院咨詢研究項(xiàng)目（2016XY36）

200040 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)胚胎與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海市胚胎與生殖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

曾溢滔，Email：ytzeng@stn.sh.cn

2017-04-11