原亞莉，賀桂芳，卞美璐

（1.北京大學醫(yī)學部，北京 100191；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

綜述

人乳頭狀瘤病毒的精準檢測與宮頸癌防治

原亞莉1，賀桂芳2?，卞美璐2

（1.北京大學醫(yī)學部，北京 100191；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

子宮頸癌是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一，在女性所有腫瘤中居第二位。在發(fā)達國家，由于定期的巴氏篩查試驗和疫苗接種，發(fā)病率下降，但是在發(fā)展中國家（包括亞洲），死亡率仍達80%[1]。高危型人乳頭狀瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）的感染與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生和發(fā)展密切相關。E6、E7基因是HPV的主要致癌基因，在大多數(shù)情況下，當HPV病毒的DNA插入人類基因組時，會觸發(fā)宮頸癌發(fā)病機理，導致E6、E7基因表達失調(diào)，使腫瘤抑制基因失活和癌基因激活，細胞不斷增殖而失去修復損傷的能力，進而導致癌癥的發(fā)生[2]，而一過性感染不一定致癌。目前人們廣泛應用HPV-DNA檢測來篩查宮頸高級別病變[3，4]，但是HPV DNA檢測并不能區(qū)分一過性感染和真正可能發(fā)展為癌的人群。因此HPV E6/E7mRNA檢測引起了很多學者的關注，它作為受感染細胞中E6/E7癌基因持續(xù)表達的標志，可能提示了病毒的活性和病變的進展程度[5]。

1 HPV檢測

HPV的基因組是一個圓形的DNA雙鏈約8 kb，主要分為3個區(qū)域包括8個早期開放讀碼框架 （E1-E8）、2個晚期讀碼框架（L1，L2）和1個非編碼長控區(qū)。早期（E）區(qū)和長控區(qū)用于編碼病毒基因表達、復制和存活的蛋白，而晚期（L）區(qū)用于編碼病毒結(jié)構蛋白。E5是第一個由HPV編碼的與各種跨膜蛋白高度相互作用的癌蛋白。E6基因編碼的E6蛋白與P53結(jié)合，影響細胞內(nèi)的多條信號途徑，從而影響細胞周期。E7基因編碼的E7蛋白主要結(jié)合Rb蛋白，使靜止的G0期細胞進入細胞周期，與E6蛋白協(xié)同作用導致細胞發(fā)生永生化。

Stoler等[6]進行了一項大型的子宮頸癌篩查臨床研究（47208例婦女參與、持續(xù)5年）發(fā)現(xiàn)，細胞學檢查漏診的高級別上皮內(nèi)瘤變中，有l(wèi)／3為HPVl6型和（或）HPVl8型陽性。細胞學檢查陰性但HPV16、18型陽性的婦女，發(fā)生CIN II及以上病變的風險分別為13.6%、7%。也有學者探討了HPV基因分型試驗結(jié)果，其中HPV-16和18聯(lián)合引起宮頸癌病例的80.79%[7]。因此，在HPV所有亞型中，16、18亞型是最常見的HPV致癌亞型[8]。全世界約70%宮頸癌是由HPV16、18亞型引起[9]。2013年ASCCP（美國陰道鏡檢查與宮頸病理學會）新版指南提出HPV16或18型陽性的，直接行陰道鏡檢查。提示在宮頸癌篩查中，檢測HPV病毒16、18分型可達到更精準的檢測，指導精準治療。

1.1 HPV DNA檢測

1.1.1 基于宮頸樣本的檢測

目前針對高危HPV病毒檢測最常用的是熒光定量PCR（如羅氏cobas 4800）和HC2-HPV-DNA。HC2-HPVDNA檢測是通過使用特異的RNA探針進行HPV定量檢測，但不能進行HPV分型。羅氏HPV-DNA檢測是美國FDA于2011年認證的針對HPV L1區(qū)域的熒光定量PCR檢測，能夠進行16、18等分型。有一項研究評估了2種檢測HR-HPV的實時PCR測定（雅培RealTime HR-HPV和羅氏Cobas HPV）與HC2相比的臨床表現(xiàn)。在總共356個宮頸拭子樣品中，雅培（Abbott）和羅氏 HPV測定與HC2的一致率分別為86.1%和89.9%。HC2在檢測HR-HPV方面的靈敏度和特異性分別為96.6%和89.1%，而Abbott為78.3%和99.2%，羅氏為91.7%和97.0%[10]。總之，雖然這2種方法在檢測HR-HPV方面的靈敏度低于HC2，但是這些測定法能提供HPV特異性基因型，因而有一定臨床應用價值。

HPV DNA檢測可以幫助篩選宮頸癌的高危人群。HPV DNA分型檢測能對6種低危型（6、11、42、43、44、81）和 15種高危型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）進行檢測。其意義在于，低危型HPV感染多數(shù)引起良性病變，能自行消退，但易反復發(fā)作，如6、11型易引起尖銳濕疣等。高危型HPV感染是造成女性宮頸癌的重要原因，需結(jié)合TCT（液基細胞學技術）等其他證據(jù)，決定是否需要進一步治療。Sohrabi等[11]證明，HPV在各中心感染型別分布兩頭很穩(wěn)定，中間型別感染率差別不大：前3位的高危感染型別是16、52、58，最后2位是26、45。前3位的低危感染型別是81、61、43，最后2位是40、83?？傊３衷诘?位的始終是16型，而20～39歲/40～59歲年齡組52型高于58型，60歲以上年齡組58型略高于52型。在第十五次全國子宮頸癌協(xié)作會議上有專家建議對HPV 16/18/52/58陽性者均立即行陰道鏡檢查，但仍需一定的實驗數(shù)據(jù)來支持。

1.1.2 基于尿液樣本的HPV檢測

基于宮頸樣本的HPV檢測對宮頸癌篩查有重要意義。然而，宮頸取樣是侵入性的。因此，有必要研究一種更方便快捷的方法用于檢測HPV，如尿液樣本。Lim等[12]在國家癌癥中心通過100組宮頸和尿液樣本進行HPV DNA檢測。結(jié)果顯示，使用尿液樣本檢測任何高危HPV類型時，不同HPV DNA檢測方法之間的總體是一致的，并且?guī)缀蹩梢酝耆珯z測出HPV 16/18型（99.0%）。然而，使用尿樣的HPV DNA檢測比使用宮頸樣品的HPV DNA檢測檢出率低。但在特定條件下，使用尿樣的HPV DNA檢測顯示出與使用宮頸樣品相當?shù)母哽`敏度和特異性。如果使用全自動DNA提取和檢測系統(tǒng)，可以減少HPV檢測的變異性，并加速尿液中HPV檢測的標準化。因此，尿液樣品在未來有可能成為一個有效的替代品。

1.2 HPV E6/E7mRNA檢測

鑒于90%高危型HPV感染為一過性感染，不一定導致宮頸癌，使得HPV DNA檢測存在一定的假陽性率，在臨床上可能會導致過度治療。此外，HPV DNA檢測是基于病毒L1區(qū)域設計探針的，存在一定的假陰性率。在DNA整合過程中，L1區(qū)有時會缺失而E6/E7區(qū)一直穩(wěn)定存在?？芍呶Ｐ虷PV病毒DNA存在，不一定會導致細胞發(fā)生癌變；而E6/E7mRNA是病毒基因整合入人體并表達的標志，能更準確的篩查出可能發(fā)展為高級別宮頸病變的人群，有效降低對一過性感染的檢出率和過度治療，且不漏診，使患者潛在風險最小化，有可能成為宮頸癌篩查較理想的篩查策略。

近幾年多項研究表明，在非典型鱗狀細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）患者中，HPV E6/E7mRNA相比HPV DNA在檢測高級別宮頸病變方面顯示出更高的特異性和陽性預測值，顯著減少了陰道鏡轉(zhuǎn)診率，意味著它在ASCUS分流管理中是一個有前途的技術方式。Li等[13]研究了591例ASCUS患者接受HPV DNA篩查得出，E6/E7 mRNA在檢測高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變方面的靈敏度與HPV DNA檢測的靈敏度相似，特異性較高。Zhao等[14]研究顯示，HR-HPV E6/E7 mRNA陽性率在CIN 1中為38.6%，在CIN 2～3中為77.4%，在鱗癌中為92.5%。HPV E6/E7mRNA隨著宮頸的病變嚴重程度增加而增加，且在高級別病變中顯示出比HC-2和HPV DNA測試更高的特異性（61.4%，54.3%，55.7%）和更高的陽性預測值（75.9%，74.8%，74.6%）。低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變有可逆性，高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變與發(fā)展為浸潤型癌有關，而HPV E6/E7mRNA陽性的患者更有可能發(fā)展為高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變。Tüney等[15]進行了一項評估81例異常細胞學婦女的HPV mRNA和DNA檢測。HPV DNA的檢出率為90.1%，HPV E6/E7mRNA為55.6%。在隨訪期間對25例進行活檢，均檢測到HPV DNA，HPV E6/E7表達僅存在于CINⅠ-Ⅲ患者中。因此，E6/E7mRNA測試相比DNA測試，能更好預測宮頸病變的進展。mRNA陽性婦女向CIN2和更高等級發(fā)展的風險高于mRNA陰性婦女[16]。還有研究表明在宮頸錐切術后病灶殘留和復發(fā)的診斷中，HPV E6/E7 mRNA檢測的特異性和陽性預測值均高于HPV-DNA檢測[17]，將HPV E6/E7 mRNA檢測納入隨訪檢查內(nèi)容可及時有效預測宮頸錐切術后CIN殘留/復發(fā)風險，并能減少過度檢查及隨訪頻率。

2 HPV預防與治療

2.1 HPV疫苗

目前有3種HPV疫苗：二價（抗HPV16、18型）疫苗、四價（抗 HPV6、11、16、18型）疫苗和九價（抗 HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58）疫苗。九價疫苗的保護范圍較寬，能預防90%的宮頸癌[18]。2016年美國癌癥協(xié)會（ACS）推薦的HPV疫苗接種年齡為9～26歲，其中最佳年齡限定為11～12歲兒童，并強調(diào)在13周歲之前完成全部接種才能獲得最大保護效力[19]。有學者探討了在年齡＞25歲的女性中（無論是否具有HPV感染病史）接種HPV疫苗的情況，結(jié)果表明HPV疫苗可繼續(xù)預防相關的感染和宮頸病變[20]。

VGX-3100是一種作用于16、18型HPV的E6和E7蛋白治療性的疫苗，它被設計用來對抗現(xiàn)有的宮頸癌及控制癌前病變。該疫苗通過在患者的細胞內(nèi)插入一段編碼某種特異性蛋白的DNA而發(fā)揮作用，其作用方式類似于基因療法。在接種VGX-3100后能誘發(fā)產(chǎn)生可摧毀癌癥的被稱作CD8+T細胞的免疫細胞[21]。Bagarazzi等[22]進行的臨床試驗顯示：VGX-3100是一種有效的對抗 HPV-16和HPV-18相關的CIN2/3的治療性疫苗，可能在未來治療已經(jīng)感染HPV的患者中發(fā)揮作用。

2.2 基因治療

基因治療（gene therapy）是指將外源正?；?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，達到治療目的。從廣義上說，基因治療包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術。馬丁等[23]研究設計了HPV致癌基因的分子剪輯技術，能特異性靶向切割HPV E6、E7序列，造成E6、E7基因的框移突變，致使癌基因片段崩解，使宮頸癌前病變恢復正常，從而實現(xiàn)HPV致癌基因敲除的目的。

3 宮頸癌的精準篩查

大多數(shù)情況下，當HPV病毒發(fā)生持續(xù)感染后，病毒基因和人類基因發(fā)生整合，E6、E7基因被激活，利用宿主細胞大量轉(zhuǎn)錄mRNA、從而導致大量癌蛋白的表達，致使細胞發(fā)生高級別病變。宮頸細胞HPV E6/E7mRNA診斷可較大程度降低過度檢查和治療的可能性，診斷高級別宮頸病變的準確性較高，可降低宮頸病變的漏診率，對于宮頸病變的診斷有較高臨床應用價值。Ngo等[24]進行了一項前瞻性多中心歐洲研究，該研究計劃招募700個先前未治療的宮頸癌患者。主要目標是發(fā)現(xiàn)主要分子改變、信號途徑激活、以及可預測對治療應答或抵抗的腫瘤微環(huán)境模式。這項結(jié)果將可能支持臨床實踐指南的發(fā)展，提高宮頸癌患者的預后及生活質(zhì)量。

[1] Chung SH.Cervical cancer screening after perimenopause：how is human papillomavirus test performed?[J].Journal of Menopausal Medicine，2016，22（2）：65.

[2] Samuels S，Balint B，Leyen HVD，et al.Precision medicine in cancer：challenges and recommendations from an EU-funded cervical cancer biobanking study[J].British Journal of Cancer，2016，115（12）：1575-1583.

[3] Dillner J.Primary human papillomavirus testing in organized cervical screening[J].Current Opinion in Obstetrics&Gynecology，2013，25（1）：11-16.

[4] Castle PE，De SS，Qiao YL，et al.Introduction of human papillomavirus DNA screening in the world：15 years of experience[J].Vaccine，2012，30：F117.

[5] Pietrzak B，Mazanowska N，Ekiel AM，et al.Revalence of high-risk human papillomavirus cervical infection in female kidney graft recipients：an observational study[J].Virology Journal，2012，9（1）：117.

[6] Stoler MH，Wright TC Jr，et al.ATHENA HPV study group. high-risk human papillomavirus testing in women with ASC-US cytology：results from the ATHENA HPV study[J]. American Journal of Clinical Pathology，2011，135（3）：468-475.

[7] Cao D，Zhang S，Zhang Q，et al.Prevalence of high risk human papillomavirus infection among women in shaanxi province of china：A hospital-based investigation[J].Journal of Medical Virology，2016，9999：1-6.

[8] Tjalma WA，F(xiàn)iander A，Reich O，et al.Differences in human papillomavirus type distribution in high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer in Europe[J].International Journal of Cancer，2013，132 （4）：854-867.

[9] Lees BF，Erickson BK，Huh WK.Cervical cancer screening：evidence behind the guidelines[J].American Journal of Obstetrics&Gynecology，2015，214（4）：438-443.

[10] Park Y，Lee E，Choi J，et al.Comparison of the Abbott realtime high-risk human papillomavirus（HPV），Roche cobas HPV，and hybrid capture 2 assays to direct sequencing and genotyping of HPV DNA[J].Journal of Clinical Microbiology，2012，50（7）：2359.

[11] Sohrabi A.Is incidence of multiple HPV genotypes rising in genital infections?[J].J Infect Public Health，2017，18（17）：30041-30042.

[12] Lim MC，Lee DH，Hwang SH，et al.Comparison of the abbott realTime high risk HPV test and the roche cobas 4800 HPV test using urine samples[J].Journal of Virological Methods，2017，243：74-79.

[13] Li Y，Rong S，Zhi Y，et al.Detection of cervical intraepithelial neoplasia with HPVE6/E7 mRNA among women with atypical squamous cells of unknown significance[J].International Journal of Gynaecology& Obstetrics the Official Organ of the International Federation of Gynaecology& Obstetrics，2017，137（2）：145-149.

[14] 趙旭曄，崔勇，姜淑芳，等.高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌篩查中的意義[J].中華醫(yī)學雜志，2014，94（43）：3432-3435.

[15] Tüney I，Altay A，Ergünay K，et al.HPV types and E6 E7 mRNA expression in cervical samples from Turkish women with abnormal cytology in Ankara，Turkey[J].Turkish Journal of Medical Sciences，2017，47（1）：194.

[16] Rossi PG，Benevolo M，Vocaturo A，et al.Prognostic value of HPV E6/E7 mRNA assay in women with negative colposcopy or CIN1 histology result：A follow-up study[J].Plos One，2013，8（2）：e57600.

[17] 趙花，邵華江.HPVE6/E7mRNA檢測對宮頸錐切術后病灶殘留和復發(fā)的診斷價值 [J].中南大學學報 （醫(yī)學版），2016，41（6）：606-611.

[18] Vesikari T，Brodszki N，Van DP，et al.A randomized dubleblind phase III study of the immunogenicity and safety of a 9-valent human papillomavirus L1 virus-like particle vaccine（V503）versus gardasil in 9-15-year-old girls[J].Pediatric Infectious Disease Journal，2015，34（9）：992.

[19] Saslow D，Andrews KS，Manassaram BD，et al.Human papillomavirus vaccination guideline update：American cancer society guideline endorsement[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians，2016，66（5）：375-385.

[20] Wheeler CM，Skinner SR，Del Rosario-Raymundo M，et al. Efficacy safety and immunogenicity of the human papillomavirus 16/18AS04-adjuvantedvaccine in women older than 25 years：7-year follow-up of the phase 3，doubleblind，randomised controlled VIVIANE study[J].Lancet Infect Dis，2016，16（10）：1154-1168.

[21] Trimble CL，Morrow MP，Kraynyak KA，et al.Safety efficacy，and immunogenicity of VGX-3100，a therapeutic synthetic DNA vaccine targeting human papillomavirus 16 and 18 E6 and E7 proteins for cervical intraepithelial neoplasia 2/3：a randomised，double-blind，placebo-controlled phase 2b trial[J].Lancet，2011，386（10008）：2078-2088.

[22] Bagarazzi ML，Yan J，Morrow MP，et al.Immunotherapy A-gainst HPV16/18 generates potent TH1 and cytotoxic cellular immune responses[J].Science Translational Medicine，2012，4（155）：155-161.

[23] 馬丁.宮頸癌防治理念新探索[J].中華醫(yī)學信息導報，2016，31（6）：17.

[24] Ngo C，Samuels S，Bagrintseva K，et al.From prospective biobanking to precision medicine：BIO-RAIDs-an EU study protocol in cervical cancer[J].BMC Cancer，2015，15（1）：1-9.

R711.74

A

1001-0025（2017）03-0179-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.03.015

國家自然科學基金（編號81202966）

2* 本文通訊作者。

原亞莉（1991-），女，碩士研究生。

2017-03-27

2017-04-22