荊家琦，張景亮，李曉婷，王騎鳳，翟廣玉,3*

（1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 451150；2.鄭州市外國語學(xué)校，河南 鄭州 450001；3.鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001）

鄭州地區(qū)線粒體基因突變與2型糖尿病相關(guān)性分析

荊家琦1,2，張景亮2，李曉婷2，王騎鳳2，翟廣玉2,3*

（1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 451150；2.鄭州市外國語學(xué)校，河南 鄭州 450001；3.鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001）

探討線粒體tRNALeu(UUR)基因3243位點(diǎn)和NADH脫氫酶亞單位1（ND1）3394位點(diǎn)突變在河南省鄭州地區(qū)2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）人群中的發(fā)生率及其臨床特征。隨機(jī)抽取無血緣關(guān)系的T2DM患者295例及正常對照250名，采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)進(jìn)行線粒體tRNALeu(UUR)基因3243位點(diǎn)及3394位點(diǎn)突變檢測，比較線粒體基因突變在兩組間分布的差異，并對樣本的相關(guān)生化指標(biāo)進(jìn)行測定，從而得出河南省鄭州地區(qū)2型糖尿病與線粒體基因點(diǎn)突變的相關(guān)性。2型糖尿病組中mtDNA 3243突變率為0.68%，mtDNA 3394突變率1.36%，在正常對照組未檢出mtDNA 3243位點(diǎn)突變，mtDNA 3394突變率0.80%，組間基因型差異用χ2檢驗(yàn)，各位點(diǎn)突變率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。胰島素水平和線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性指標(biāo)在有無突變組之間有明顯差別（p＜0.05）。線粒體tRNALeu(UUR)基因3243和ND1區(qū)3394位點(diǎn)突變不是河南省鄭州地區(qū)2型糖尿病的主要病因，僅為人群中線粒體DNA的基因多態(tài)性。但此位點(diǎn)突變能引起空腹胰島素水平和線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性的下降，推測其對2型糖尿病的發(fā)生的其他因素有協(xié)同作用。

2型糖尿??；線粒體；基因突變

糖尿?。―M）是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，分為1型糖尿病和2型糖尿病，其中2型糖尿病目前認(rèn)為其發(fā)病原因主要是胰島素抵抗或胰島素分泌不足，病因?yàn)檫z傳因素和環(huán)境因素的交互作用[1]，有研究表明線粒體功能障礙在胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)病機(jī)理中扮演著重要角色，線粒體基因突變與糖尿病的發(fā)病有一定的相關(guān)性[2]。20世紀(jì)90年代首次有報(bào)道稱線粒體基因突變tRNALeu(UUR)3243引起母系遺傳伴耳聾綜合癥[3]，線粒體DNA（mtDNA）突變是導(dǎo)致家族性糖尿病的重要病因之一。但有的研究也發(fā)現(xiàn)一些基因突變與2型糖尿病無關(guān)，而僅為正常的多態(tài)性[4]。本研究選擇河南省鄭州地區(qū)2型糖尿病病人，對mtDNA 3243及mtDNA 3394位點(diǎn)的突變進(jìn)行了檢測，以揭示這兩個位點(diǎn)的突變與河南省鄭州地區(qū)2型糖尿病患者的相關(guān)性。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

糖尿病組為隨機(jī)選取的河南省鄭州地區(qū)漢族人，根據(jù)1997年世界衛(wèi)生組織（WHO）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為T2DM的住院患者295例，其中男141例，女154例，年齡（58±10）歲，患者間無親緣關(guān)系；正常對照組為健康體檢者250名，其中男130例，女120例，年齡（54±11）歲，無糖尿病及家族史。2組間性別、年齡和體重指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

抽取研究對象清晨空腹外周靜脈血3～5mL，EDTA抗凝，采用基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物科技公司）從白細(xì)胞中分離提取DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增相應(yīng)基因的引物序列分別是，上游引物：5’-TACTTCACAAAGCGCCTTCC-3’，下游引物：5’-ATGA AGAATAGGGCGAAGGG-3’。在50μL反應(yīng)體系中含10×PCR緩沖液5μL，dNTP 1.5μL（各10mmol/L），引物1和引物2各1.5μL（25 pmol/μL），Taq DNA聚合酶0.5μL（5 U/μL），模板DNA 0.1μg。在PE公司geneAMP PCR system 2400型擴(kuò)增儀上95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳判斷目的DNA片段。

1.2.3 PCR產(chǎn)物酶切及檢測

取PCR產(chǎn)物配成相應(yīng)的酶切體系進(jìn)行酶切反應(yīng)。針對3243位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切體系：PCR產(chǎn)物10μL，10×RE緩沖液2μL，BSA溶液0.2μL，ApaⅠ限制性內(nèi)切酶1.0μL（10 U/μL），去離子水補(bǔ)至20μL，將上述試劑混勾，置于37℃恒溫水浴3～4 h。針對3394位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切體系：PCR產(chǎn)物10μL，10×RE緩沖液2.0μL，10%BSA溶液0.2μL，HaeⅢ限制性內(nèi)切酶1.0μL（10 U/μL），去離子水補(bǔ)至20μL，置于37℃恒溫水浴3～4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)含溴乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)電泳結(jié)果判斷基因型。

1.2.4 患者臨床生化資料采集

記錄病例組和對照組人群的民族、年齡、性別、病程、家族史等情況，測量身高、體重計(jì)算患者的體重指數(shù)（BMI）。檢測空腹血糖水平（FBG）、餐后2小時(shí)血糖水平（P2BG）、空腹胰島素水平（FINS）、糖基化血紅蛋白（HbA1C）、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性（NADH）等生化指標(biāo)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在SPSS17.0軟件中建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)量資料采用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA片段PCR結(jié)果

利用合成的引物分別對病例組和對照組樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后預(yù)期目的片段大小為303 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小相符，且沒有非特異性條帶的出現(xiàn)，如圖1所示。

圖1 mtDNA基因片段PCR的結(jié)果M：ladder；1、2：PCR產(chǎn)物

2.2 酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶ApaⅠ和HaeⅢ的酶切后，A3243G突變可產(chǎn)生限制酶ApaⅠ的酶切位點(diǎn)（GGGCC↓C），酶切產(chǎn)物為123 bp、180 bp的2條片段，而未突變基因片段不被酶切，只顯示1條條帶。而野生型沒有ApaⅠ的酶切位點(diǎn)，故電泳只能看到長度為303 bp的1條片段。T3394C突變會使HaeⅢ的酶切位點(diǎn)（GG↓CC）增加，野生型有2個HaeⅢ的酶切位點(diǎn)，電泳理論上應(yīng)見178 bp、97 bp、28 bp 3條片段；T3394C突變使HaeⅢ酶切位點(diǎn)增加了1個，電泳應(yīng)見178 bp、78 bp、28 bp、19 bp 4條片段。但由于瓊脂糖凝膠的分辨率有限，小于50 bp就不能很好的顯示，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們可以根據(jù)出現(xiàn)特異性的78 bp片段判斷為T3394C突變，如圖2所示。根據(jù)酶切結(jié)果發(fā)現(xiàn)2型糖尿病組中mtDNA 3243突變2例，mtDNA 3394突變4例，在正常對照組未檢出mtDNA 3243突變，mtDNA 3394突變2例。同時(shí)分析兩個基因位點(diǎn)突變在2型糖尿病組及正常對照組之間的差異，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，其中mtDNA 3243位點(diǎn)突變在T2DM與正常對照組之間p=0.246，mtDNA 3394位點(diǎn)突變在T2DM與正常對照組之間p=0.375。對比發(fā)現(xiàn)二者的發(fā)生率在兩組之間差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 mtDNA基因3243位點(diǎn)和3394位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果圖。M：ladder；1：PCR產(chǎn)物；2，3：3394T/C突變型酶切片段；4，5：3243A/G突變型酶切片段

2.3 臨床生化資料統(tǒng)計(jì)

對所有的研究對象進(jìn)行了相關(guān)臨床資料的收集，將檢測到突變標(biāo)本的臨床資料進(jìn)行整理分析，并將突變陽性患者與無突變患者及正常組的主要臨床資料進(jìn)行了比較，如表1所示，其中胰島素指標(biāo)在有、無突變組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)結(jié)果表明線粒體位點(diǎn)突變使空腹胰島素水平明顯下降。

表1 突變陽性患者與無突變患者及正常組臨床資料的比較

3 討論

隨著對線粒體疾病認(rèn)識的不斷深入，線粒體基因突變被認(rèn)為是導(dǎo)致糖尿病的一種新的遺傳缺陷。目前已報(bào)道與糖尿病發(fā)生有關(guān)的mtDNA突變達(dá)20余種[4]，其中有明確致病作用的是tRNA 3243 A→G點(diǎn)突變，是目前公認(rèn)的線粒體糖尿病致病點(diǎn)突變，也是國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道最多的基因糖尿病突變位[5]。mtDNA3243基因突變降低了編碼蛋白的穩(wěn)定性和相應(yīng)氨基酸與其tRNA的結(jié)合力，同時(shí)突變還導(dǎo)致與轉(zhuǎn)錄終止因子的結(jié)合障礙，使相鄰rRNA生成減少，從而影響線粒體中氧化磷酸化酶的合成及活性，導(dǎo)致ATP生成不足[6]。目前已有多個地區(qū)進(jìn)行了多種族有關(guān)線粒體突變糖尿病的研究。文獻(xiàn)報(bào)道，全球糖尿病人群中線粒體基因突變發(fā)生率約為1.5%，tRNA Leu（UUR）突變引起的占60%左右[7]。我們對河南省鄭州地區(qū)隨機(jī)抽取的225例T2DM患者的基因檢測發(fā)現(xiàn)，鄭州地區(qū)T2DM患者中mtDNA 3243的突變率為0.68%，研究數(shù)據(jù)表明此位點(diǎn)可能只是線粒體基因的溫和性病理突變，也可能是在其因素的協(xié)同作用下引發(fā)線粒體糖尿病。

此位點(diǎn)突變在與鄭州地區(qū)2型糖尿病患者的發(fā)生率相關(guān)性較低。

1996年，Hirai等[8]發(fā)現(xiàn)日本糖尿病患者群存在mtDNA T3394C突變，其突變率為4.9%，正常人群為1.3%。目前研究認(rèn)為mtDNA3394點(diǎn)突變可使一個中性酪氨酸被親水性組氨酸取代，改變了ND1空間構(gòu)型進(jìn)而影響NADH脫氫酶活性，導(dǎo)致ATP合成減少、胰島B細(xì)胞能量供應(yīng)不足、影響胰島素分泌，從而參與T2DM的發(fā)生[9]。而本研究在糖尿病人群中發(fā)現(xiàn)了mtDNA 3394位點(diǎn)1.78%的突變率，且在正常對照中也發(fā)現(xiàn)了1.10%的突變率，從突變陽性組與突變陰性組的臨床資料比較中可以看出，mtDNA 3394突變沒有影響到患者的平均發(fā)病年齡、體重指數(shù)及血糖水平。因此我們推斷mtDNA 3394突變可能僅為mtDNA的基因多態(tài)性，目前還不能證實(shí)該突變與糖尿病的發(fā)病有直接關(guān)系，還有待于通過以后的研究來證實(shí)mtDNA3394突變是否具有致病性。

線粒體基因突變DM患者的臨床表型多樣化，與其致病原因之間并非簡單的對應(yīng)關(guān)系[10]。本研究因樣本含量有限，對線粒體基因突變與2型糖尿病的相關(guān)性研究還不夠完善。在今后的研究中可以通過增加病例數(shù)，提高標(biāo)本來源的特異性來提高線粒體突變DM的陽性診斷率；同時(shí)對于可能導(dǎo)致線粒體功能異常的核基因缺陷進(jìn)行研究，從而幫助我們逐步了解線粒體基因突變DM的發(fā)病機(jī)理，并為將來的針對性治療提供可能。

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Correlation analysis on mitochondrial DNA gene mutation in type 2 diabetes mellitus in Zhengzhou

JING Jia-qi1,ZHANG Jing-liang2,LI Xiao-ting2,WANG Qi-feng2,ZHAI Guan-yu2,3*
(1.Zhengzhou Foreign Language School,Zhengzhou Henan451100,China;2.College of Medicine,Zhengzhou University of Industrial Technology,Zhengzhou Henan451100,China;3.College of Medicine,Zhengzhou University,Zhengzhou Henan450001,China)

To investigate the prevalence and the clinical characteristics of mitochondrial DNA(mtDNA)dot mutation at position tRNALeu(UUR)3243 and NADH dehydronase subunt 3394 in patients with type 2 diabetes mellitus in Zhengzhou area.Methods 295 cases of T2DM patients in Zhengzhou area were selected randomly and 250 individuals were healthy controls.The presence of mtDNA 3243 and mtDNA 3394 mutations was determined by PLC-RFLP technique.To compare the differences in the distribution of mitochondrial mutation between the two groups,and to determine the biochemical parameters of the samples,so as to obtain the correlation between type 2 diabetes mellitus and mitochondrial gene point mutations in Zhengzhou area,Henan province.The frequency of mtDNA 3243A mutation was 0.68%in T2DM group and 0 in healthy control group,and the frequency of mtDNA 3394 mutation was 1.36%in T2DM group and 0.80%in healthy control group.No statistical differences in the fre-quency of the two mutations were found between these two groups.Insulin levels and mitochondrial respiratory chain enzyme complex I activity indexes were significantly different between the groups with and without mutation.Mutations of mitochondrial gene tRNALeu(UUR)3243 and ND1 region 3394 are not the main causes of type 2 diabetes mellitus in Zhengzhou area of Henan Province,and only the genetic polymorphism of mitochondrial DNA in the population.But the mutations can cause the decrease of fasting insulin level and mitochondrial respiratory chain enzyme complex I activity,it is speculated that they have a synergistic effect on the other factors of type 2 diabetes.

type 2 diabetes mellitus;mitochondrial;gene mutation

R394.3

代碼：A

：1004-4329（2016）04-058-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2016)04-058-04

2016-06-13

河南省科技廳項(xiàng)目（142102310151）；河南省教育廳項(xiàng)目（14A310028）；鄭州市地方高校生化藥學(xué)名師工作室（鄭教高[2015]70號）資助。

翟廣玉（1954- ），男，學(xué)士，教授，研究方向：生化藥學(xué)。Email：Zhaiguangyu1@sina.com。