吳福芳，陳 悅，蘆廣銀，馬擴(kuò)彥，戴 亞，盛良全*

（1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)研發(fā)中心，四川 重慶400060）

HPLC-ELSD法檢測(cè)煙草秸稈中水溶性糖

吳福芳1，陳 悅1，蘆廣銀1，馬擴(kuò)彥2，戴 亞2，盛良全1*

（1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)研發(fā)中心，四川 重慶400060）

建立一種采用45%乙腈水溶液作提取溶劑于40℃下超聲萃取35 min，乙腈水溶液等度洗脫，ZORBAX Carbohydrate糖柱-HPLC-ELSD法測(cè)定煙草秸稈中水溶性糖含量的方法。水溶性糖的線性范圍：鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的實(shí)驗(yàn)線性范圍為8.0～1 000.0 mg/L，木糖、甘露糖的實(shí)驗(yàn)線性范圍為16.0～1 000.0 mg/L，麥芽糖的實(shí)驗(yàn)線性范圍為10.0～1 000.0 mg/L，且在此范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均較好。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）均小于3.73。結(jié)果表明此法準(zhǔn)確簡(jiǎn)單、易操作、靈敏度高，適用于批量煙草秸稈以及煙草制品中水溶性糖含量的定量分析與測(cè)定。

糖分析柱；高效液相色譜法；煙草秸稈；水溶性糖

我國(guó)是煙草生產(chǎn)大國(guó)，每年產(chǎn)量約占全球的42%，煙草秸稈產(chǎn)量約為450萬(wàn)噸[1]。以往對(duì)煙草秸稈處理方式主要是焚燒和丟棄，有效利用率低。煙草秸稈作為一種重要的可再生生物質(zhì)資源，它的合理開(kāi)發(fā)利用有利于兩煙產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。對(duì)煙草秸稈組成成份分析等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，是其科學(xué)、合理、有效、可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[2]。目前對(duì)煙草秸稈的成份報(bào)道不是很多，其中水溶性糖的研究較少[3]。而水溶性糖是煙草秸稈的重要組成成份，對(duì)煙草秸稈水溶性糖的合理分析關(guān)系到煙草秸稈的‘五化’利用[4]。因此，選擇合適的方法及最佳測(cè)量條件，有利于煙草秸稈進(jìn)一步應(yīng)用研究。目前國(guó)內(nèi)外農(nóng)作物秸稈中的水溶性糖研究不是很多[5-9]，其對(duì)于煙草秸稈中水溶性糖的檢測(cè)主要是按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC/T 159—2002）進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有對(duì)煙草秸稈水溶性糖進(jìn)行系統(tǒng)分析、檢測(cè)。

高效液相色譜法是近些年來(lái)檢測(cè)水溶性糖最多的方法之一，主要采用的是示差折光檢測(cè)器[10-11]和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[12-15]。相對(duì)于示差折光檢測(cè)器，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的靈敏度要高，適用范圍較廣。且比傳統(tǒng)的化學(xué)方法精確度高（能檢測(cè)單一糖的成分），耗時(shí)短，成本低。本文采用安捷倫糖分析柱為固定相、乙腈-水作流動(dòng)相、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了煙草秸稈中7種水溶性單糖和二糖的同時(shí)測(cè)定。為生物質(zhì)秸稈中水溶性糖的快速分析奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

實(shí)驗(yàn)所用煙草秸稈來(lái)自阜陽(yáng)當(dāng)?shù)厥崭?。YL9100高效液相色譜系統(tǒng)、YL9181蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)（托摩根生物科技有限公司）；微量進(jìn)樣器（0.1mL）；分析天平（0.000 1 g）（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；0.22μm水系微孔濾膜、0.22μm有機(jī)系微孔濾膜，SPE-C18固相萃取小柱（BOJIN），全自動(dòng)固相萃取儀（SPE-8上海本昂科學(xué)儀器有限公司）；DZX-1型（6050B）真空干燥箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、YB-500A型高速多功能粉碎機(jī)（永康市速鋒工貿(mào)有限公司）、SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；UP型超聲純水機(jī)（優(yōu)普儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取已烘至恒重的煙草秸稈粉末0.5 g，精確至0.000 1 g，置于25mL容量瓶中，加入10mL 45%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液，于40℃下超聲波輔助提取35 min，抽濾，濾液用45%乙腈水溶液定容至25mL。樣液用預(yù)活化好的SPE-C18固相萃取小柱[16-18]（活化方法：先用15mL甲醇活化，再用30mL超純水平衡）處理后，再經(jīng)0.22μm有機(jī)過(guò)濾膜過(guò)濾，置于離心管中，待進(jìn)樣分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Carbohydrate（4.6mm×250mm，5μm）（南昌捷島科學(xué)儀器有限公司）；流動(dòng)相：乙腈/水（V/V）=75∶25，流速為1.0mL/min，恒溫器溫度：25℃；ELSD Spray Chamber溫度：30℃，Drift Tube溫度：60℃；載氣：高純氮（≥99.999%），壓力：0.5 MPa；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)烘干的鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖各0.1 g，甘露糖0.2 g，精確至0.000 1 g，均置于100mL小燒杯中，加適量45%乙腈水溶液，攪拌加速溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)中所用工作液濃度為儲(chǔ)備液的0.5倍。準(zhǔn)確移取5mL糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用45%乙腈水溶液定容至刻度，搖勻即得到標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2. 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

用乙腈和水作為高效液相色譜分析的流動(dòng)相，在固定流速為1.0mL/min，恒溫器溫度為25℃，ELSD Spray Chamber溫度為30℃，Drift Tube溫度為60℃，N2壓力維持在0.5 MPa，分別在乙腈-水溶液體積比為70∶30、75∶25、80∶20時(shí)，進(jìn)樣20μL分析各組分糖的分離情況。數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：乙腈在流動(dòng)相中比例增大，有利于各組分峰的基線分離，但是乙腈比例增大也會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間延長(zhǎng)。在乙腈體積比為70%時(shí)，木糖與果糖，甘露糖與葡萄糖未分開(kāi)，其它糖已達(dá)到完全分離；在乙腈體積比為75%時(shí)，只有木糖與果糖分離度R＜1.5，其余各峰間分離度值R≥1.5，即各糖分峰基本分離；在乙腈體積比為80%時(shí)，各峰間分離度值R＞1.5，各組分糖完全分離，但分析時(shí)間較長(zhǎng)，但各糖分的峰展寬較嚴(yán)重，尤其是蔗糖和麥芽糖的峰較寬。綜合考慮分析時(shí)間、分離效果、峰展寬情況等因素，此次分析選擇乙腈∶水=75∶25的體系作為流動(dòng)相。

流速對(duì)分離效果也具有一定的影響，流速增大可以縮短保留時(shí)間，但流速過(guò)大分離不完全，而流速過(guò)小又會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間長(zhǎng)且峰形變寬。在乙腈∶水=75∶25條件下，進(jìn)一步分析不同流速（0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min）對(duì)分離效果的影響，對(duì)譜圖進(jìn)行分析后得數(shù)據(jù)表2。流速為1.0和1.2mL/min時(shí)，各峰間的分離度R≥1.3，各組分基本分離，且半峰寬也相差不大，在1.2mL/min時(shí)壓力較大，故選擇流速為1.0mL/min。

表1 不同流動(dòng)相下各組分糖的分離度

表2 不同流動(dòng)速度下各組分糖的分離度

2.1.2 ELSD參數(shù)設(shè)定

載氣流速，漂移管溫度與恒溫器溫度是ELSD調(diào)節(jié)的主要參數(shù)。載氣的流量決定霧化時(shí)液滴形成的大小。氣體流量越高形成的液滴越小，容易蒸發(fā)，散射光的強(qiáng)度較弱，產(chǎn)生的信號(hào)較小。但若載氣流速過(guò)小，流動(dòng)相不能完全蒸發(fā)，背景噪音大。漂移管溫度的高低也同樣存在信噪比和背景噪音的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)在N2壓力維持在0.5 MPa，漂移管溫度在60℃下，色譜圖分離情況較佳。

在確定的流動(dòng)相和流速下，ELSD Spray Chamber溫度為30℃，Drift Tube溫度為60℃，N2壓力維持在0.5 MPa，進(jìn)樣量為20μL，恒溫器溫度分別設(shè)置為20℃、25℃、30℃，進(jìn)行進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，恒溫器溫度對(duì)保留時(shí)間、峰形的影響都不大，在實(shí)驗(yàn)中不同柱溫時(shí)，各糖分已達(dá)基本分離。25℃與室溫較接近，溫差小。故選擇了25℃作為ELSD工作溫度。條件優(yōu)化后，7個(gè)糖組份都得到較好的分離，如圖1。

2.2 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑比例的選擇

依據(jù)文獻(xiàn)[15]，選用乙腈水溶液作為萃取劑，分別用0、35、40、45、50、55、60%乙腈水溶液10mL，平行做2組。相對(duì)于純水，乙腈水溶液提取時(shí)甘露糖、蔗糖和麥芽糖影響不大，但其它糖分提取效果較好。萃取劑乙腈比例在45%時(shí)，鼠李糖提取量略低于乙腈比例為40%的，但是其它各組分糖提取量較其他條件下比較好，故選擇45%乙腈水溶液作為萃取劑。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表3，表中為平行實(shí)驗(yàn)萃取平均值。

2.2.2 萃取劑體積的選擇

分別考察了萃取劑為4、6、8、10、12、14mL時(shí)萃取的結(jié)果見(jiàn)表4。分析數(shù)據(jù)結(jié)果可知，萃取劑體積在10mL時(shí)，樣品中糖分提取相對(duì)較完全。

圖1 7種水溶性糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC-ELSD色譜圖

表3 乙腈與水不同濃度比例與水溶性糖的萃取關(guān)系

表4 不同萃取劑體積與水溶性糖的萃取關(guān)系

2.2.3 萃取時(shí)間的選擇

于40℃下超聲波輔助提取不同時(shí)間，分別為10、20、30、40、50、60 min，平行做2組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，超聲萃取大概35 min時(shí)，樣品中糖提取量最高。隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分糖提取量基本不變。故選擇超聲輔助提取35 min。

表5 不同萃取時(shí)間與水溶性糖的萃取關(guān)系

2.2.4 萃取溫度的選擇

在上述選定的條件下，于30、35、40、45、50、55、60℃下超聲波輔助提取，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表6，溫度升高有利于糖分溶出。隨著溫度的升高，糖分提取量也增加，但是溫度超過(guò)40℃時(shí)，總糖量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。所以樣品處理溫度選擇為40℃。

2.3 方法評(píng)價(jià)和應(yīng)用

2.3.1 線性范圍與檢出限

量取配制的糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.08、0.10、0.25、 0.50、1.00、2.00、5.00、8.00、10.00mL，分別置于10mL容量瓶中，用45%乙腈水溶液定容，得系列濃度的糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，濃度由低到高依次進(jìn)樣。并以各糖的峰面積（mV·S）的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mg/L）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，即可得到線性回歸方程。同時(shí)，處理煙草秸稈樣品20份，0.01 g/份，進(jìn)行二十組空白實(shí)驗(yàn)，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限。表7為7種水溶性糖的雙對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表6 不同萃取溫度與水溶性糖的萃取關(guān)系

表7 7種水溶性糖類(lèi)化合物的雙對(duì)數(shù)線性方程

水溶性糖的線性范圍：鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的實(shí)驗(yàn)線性范圍為8.0～1 000.0 mg/L，木糖、甘露糖的實(shí)驗(yàn)線性范圍為16.0～1 000.0 mg/L，麥芽糖的實(shí)驗(yàn)線性范圍為10.0～1 000.0 mg/L，且在此范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均較好。

2.3.2 精密度

準(zhǔn)確稱取6份已烘至恒重的煙草秸稈樣品，0.500 0 g/份。預(yù)處理后在選定的色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)6次重復(fù)測(cè)定，記錄各組分糖的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。煙草秸稈中水溶性糖的精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表8。除鼠李糖外，其余各糖分RSD＜3.73，表明該方法的精密度良好。

表8 煙草秸稈中水溶性糖的精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）

2.3.3 回收率和穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取3份已烘至恒重的煙草秸稈樣品，0.500 0 g/份。樣品1不加混合母液，其他2份分別加入不同等級(jí)濃度的混合母液，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。平行做6組，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。對(duì)樣品1在0、40、60、100、140、260 min后，進(jìn)樣測(cè)定分析。計(jì)算于室溫下放置不同時(shí)間后糖分的濃度，判斷樣液的穩(wěn)定性。

煙草秸稈中水溶性糖的回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理結(jié)果見(jiàn)表9，各糖回收率為70.5%～141.2%。煙草秸稈中水溶性糖的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表10。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 h內(nèi)，樣液中水溶性糖濃度變化不大，所以最好在樣液提取后1 h內(nèi)進(jìn)樣檢測(cè)分析。

表9 煙草秸稈中水溶性糖的回收率實(shí)驗(yàn)（n=6）

表10 煙草秸稈中水溶性糖的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用45%乙腈水溶液于40℃下超聲波輔助提取35 min，經(jīng)過(guò)抽濾、定容，再用預(yù)活化好的SPE-C18固相萃取小柱處理，最后經(jīng)0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾，ZORBAX Carbohydrate糖柱-高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)，建立一種煙草秸稈中水溶性糖含量測(cè)定的方法。在不同添加水平下，回收率為70.5%～141.2%，精密度（RSD）為0.77%～3.73%（n=6）。該方法準(zhǔn)確簡(jiǎn)單、易操作、靈敏度高、線性范圍寬，適用于批量煙草秸稈以及煙草制品中水溶性糖含量的常規(guī)檢測(cè)。

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Determination of water-soluble sugar in tobacco straw by HPLC-ELSD

WU Fu-fang1，CHEN Yue1，LU Guang-yin1，MAKuo-yan2，DAI Ya2，SHENG Liang-quan1*
(1.School of Chemistry and Materials Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;2.Technology R&D Center,China Tobacco Chongqing Industrial Co.,Chongqing Sichuan400060,China)

A method for determination of water-soluble sugar in tobacco straw was developed.The water-soluble sugar was extracted by using 45%acetonitrile water solution under ultrasonic,and was analyzed by HPLC-ELSD using ZORBAX Carbohydrate sugar column.The linear range of rhamnose,fructose,glucose and sucrose was 8.0～1 000.0 mg/L;the linear range of xylose and mannose was 16.0～1 000.0 mg/L;and the linear range of maltose was 10.0～1 000.0 mg/L,and the correlation coefficient is better in this range.Relative standard deviation(RSD)(n=6)was all less than 3.73.The method for determination of water-soluble sugar in tobacco straw is simple,easy to operate,accurate,sensitive and suitable for quantitative analysis and determination of water-soluble sugar in tobacco and tobacco products.

sugar analysis column;high performance liquid chromatography;tobacco straw;water-soluble sugar

TS49

：A

：1004-4329（2016）04-037-07

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2016)04-037-07

2016-09-22

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2016A548）；安徽省省級(jí)學(xué)科建設(shè)重大項(xiàng)目（皖教秘科[2014]28號(hào)）；卷煙減害降焦四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（hx2015005）資助。

吳福芳（1985- ），女，博士，講師，研究方向：藥物合成。

盛良全(1965- ），男，博士，教授，研究方向：生物無(wú)機(jī)及分析化學(xué)。Email：shenglq@fync.edu.cn。