管志遠 鄭慧萍 萬峰 張喆

綜 述

犬心衰動物模型制作現(xiàn)況及進展

管志遠 鄭慧萍 萬峰 張喆

心力衰竭； 犬； 模型

心力衰竭是心臟泵血功能衰竭，無法滿足全身組織代謝需求的一種病理生理狀態(tài)及臨床綜合征。隨著老齡化的到來，心力衰竭的發(fā)病率逐年增加并對人類健康產(chǎn)生嚴重威脅。國外流行病學資料表明，發(fā)達國家成人人群心衰總發(fā)病率為1%～2%，在年齡＞70歲的人群中升高至10%以上[1]。國內(nèi)最新的流行病學研究發(fā)現(xiàn)，中國35～74歲的人群中有400萬慢性心衰患者，發(fā)病率為0.9%，住院30 d內(nèi)死亡率為5.4%[2]。心衰的病理生理特征與血流動力學、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、腫瘤壞死因子及腎素-血管緊張素系統(tǒng)密切相關[3-8]。心衰模型可模擬心衰病理生理發(fā)展過程，從而為心衰發(fā)生、發(fā)展、治療及預后提供良好平臺。但目前任何一個研究模型均不能完全重現(xiàn)人類心衰發(fā)展過程，而且不同類型心衰模型存在各自的缺點。本文將對常見的犬動物心衰模型的制作方法、適應證及優(yōu)缺點進行文獻綜述。

1 容量超負荷心衰模型

容量超負荷心衰模型是最為常用的心衰模型制作方法[9]。血流動力學改變包括：①中心靜脈壓、右房壓、肺動脈壓、肺毛細血管契壓升高；②腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活引起水鈉潴留。

1.1 動靜脈瘺法 動靜脈瘺包括頸動靜脈-靜脈瘺、腎動脈分支以下的主動脈-下腔靜脈、腹主動脈-髂靜脈等方法。Zucker等[10]通過分別阻斷下腔靜脈及腹主動脈后，在腎動脈水平以下建立主動脈-腔靜脈瘺（吻合口長度10～15 mm），術后通過評估左室舒張末期最大內(nèi)徑、腹水、肺水腫等評估心衰情況，結果證明左室舒張末期最大內(nèi)徑明顯增加。Chekanov[11]使用建立下腔靜脈-主動脈瘺（端端吻合，10～12 mm），1個月后左室射血分數(shù)從術前的（77±5）%降至（66±4）%，2 個月后降至（43±6）%，從而成功建立心衰模型。Tessier等[12]通過首先建立頸內(nèi)靜脈與頸動脈的側-側吻合的瘺口（2 cm），并聯(lián)合使用多柔比星（1～2 mg/kg)靜脈注射，使左室舒張末期體積擴大50%，并成功建立心衰模型。

1.2 瓣膜腱索破壞法 瓣膜腱索破壞法是通過切斷犬的二尖腱索或是用塑料管破壞二尖瓣尖造成二尖瓣關閉不全，進而引起心衰發(fā)生。Kleaveland等[13]在比格犬動脈放置動脈抓取鉗破壞二尖瓣腱索或小葉產(chǎn)生二尖瓣返流，3個月舒張末期容積、左室質量、左室舒張末期壓明顯增加，心輸出量降低，進而成功制作超負荷心衰模型。Young等[14]也同樣使用頸動脈放置鼠齒抓取鉗破壞二尖瓣腱索，從而使肺毛細血管楔形壓力增加20 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），心輸出量下降50%，術后6個月因二尖瓣返流使左室舒張末期容積增加75%。此外通過靜脈使用晶體液可以很容易制作心衰模型[15]。容量負荷心衰模型目前多用于心功能儲備及評價心臟舒張功能障礙。該模型優(yōu)點是臨床相關性高，但缺點是花費時間較長。

2 壓力超負荷心衰模型

2.1 主動脈阻斷心衰模型 主動脈阻斷心衰模型是通過主動脈局部阻斷或受壓，增加左心后負荷，從而導致左室壓力慢性升高、心肌肥厚及心肌損傷，最終模擬出心衰模型。Carabello等[16]在犬的左前降支周圍黏附長度固定貼合帶，隨著犬的生長，心輸出量增加，會導致相對的主動脈狹窄，從而成功建立心衰模型。Chien等[17]先用收縮帶停止靜脈弓靜脈回流，并使用J型血管夾阻斷升主動脈并預置縫合線，當升主動脈擴張大約50%，釋放血管夾并測量左室及主動脈壓力。隨后使用預置線局部扎緊升主動脈從而獲取所需的壓力，術后2～6個月，壓力梯度為50～200 mm Hg，心臟體積明顯增大。該模型優(yōu)勢在于比較容易控制壓力梯度，并可以在較短時間內(nèi)再現(xiàn)左室增大。但該模型不能再現(xiàn)神經(jīng)激素調控及左室收縮功能障礙。

2.2 野百合堿心衰模型 野百合堿心衰模型是通過靜脈注射方式注射野百合堿（3～5 mg/kg），持續(xù)6～12個月成功誘導心衰發(fā)生。野百合堿是一種雙稠吡咯啶型生物堿，可引起肺血管綜合征，表現(xiàn)為增生性肺血管炎、肺動脈高壓及肺性腦病[18,19]。Chen等[20]通過對成年犬注射野百合堿后6個月觀察到犬的平均右室壓、平均肺動脈壓及肺毛細血管楔壓明顯增加，從而成功制作出慢性心衰模型。值得注意的是，成年狗肝組織中并不存在代謝野百合堿的酶，所以對野百合堿的使用需要嚴格控制劑量。野百合堿模型主要是用于評估肺動脈高壓引起的內(nèi)膜增生及基因調控表達機制、神經(jīng)內(nèi)分泌、血流動力學變化等心衰模型制作。

3 藥物誘導心衰模型

3.1 多柔比星（阿霉素） 多柔比星（阿霉素）心衰模型是指在外周靜脈或冠狀動脈注射多柔比星（2～4 mg/kg，2 min 或 1 mg/kg，30 min）制作心衰模型。其機理是因為多柔比星可誘導脂質過氧化超微結構破壞，包括線粒體腫脹、線粒體顆粒空泡化及心肌損傷[21]。Bristow等[22]研究冠狀動脈內(nèi)注射多柔比星（2～4 mg/kg）并評估對犬血流動力學影響，結果發(fā)現(xiàn)多柔比星與心衰程度具備劑量相關性。多柔比星可以通過冠狀動脈或靜脈途徑給藥。冠狀動脈內(nèi)注射可以通過術中預置引流管或經(jīng)皮介入方式給藥，這樣只產(chǎn)生心臟毒性作用從而避免全身反應。此外也可以聯(lián)合動靜脈瘺方式建立心衰模型。Tessier等[12]對存在動靜脈瘺的山羊模型持續(xù)給予多柔比星13周，發(fā)現(xiàn)山羊模型均存在心衰癥狀。多柔比星使用劑量與心衰嚴重程度之間存在劑量正相關性，1 mg/kg比0.5 mg/kg多柔比星更容易建立心衰模型。該模型優(yōu)點是心衰模型較為穩(wěn)定，容易誘導且避免全身并發(fā)癥發(fā)生，對犬內(nèi)環(huán)境影響較小。缺點是：①模型建立過程與心律失常有高度相關性，導致建模失敗率高；②存在骨髓及胃腸道毒性，影響實驗結果。

3.2 普萘洛爾 普萘洛爾心衰模型制作方法是大劑量使用（5 mg/kg）普萘洛爾建立心衰模型。其機制為，普萘洛爾是一種β受體阻滯劑，可長期負性抑制心肌收縮性，靜脈注射可明顯降低平均動脈壓、心輸出量、左室最大舒張內(nèi)徑。Soltero等[23]通過高劑量普萘洛爾（5 mg/kg）靜脈注射成功誘導心衰模型，等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率（dp/dtmax）明顯降低。普萘洛爾心衰模型的優(yōu)點在于可塑造一個穩(wěn)定且可控制的急性心衰模型，但不能使心室擴張從而限制心衰輔助裝置等技術應用。

3.3 皂素及丙咪嗪 皂素心衰模型制作方法是在開胸的犬冠狀動脈內(nèi)注射皂苷使容量超負荷，并聯(lián)合靜脈注射甲氧胺誘導成功建立穩(wěn)定心衰模型。Kamijo等[24]的研究結果證明，左室舒張末期壓力增加，主動脈血流降低，系統(tǒng)性血管阻力、右心房壓力明顯增加。該心衰模型特點是可明顯降低心輸出量并增加外周血管阻力，從而成功建立全心心衰模型。丙咪嗪是對心臟功能有明顯損害作用的三環(huán)抗抑郁藥物，機制為可阻斷鈉通道及β腎上腺能受體阻滯劑。Lucas等[25]給犬靜脈輸注丙咪嗪，30 min后導管測壓證實dp/dtmax、左心室壓力明顯降低，心室舒張末期壓力明顯增加，60 min后超聲心動圖提示左室射血分數(shù)明顯降低。丙咪嗪建立心衰模型的特點是心律失常發(fā)生率低。

4 心衰快速起搏模型

心衰快速起搏模型制作方法是通過右頸靜脈或開胸方式將電極植入右室或左室心尖部心外膜下，快速起搏裝置使心率提高至180～260 bpm，持續(xù)數(shù)周即可建立心衰模型。心衰發(fā)生機制包括：①心肌過快收縮可導致心肌耗氧量增加，能量物質（肌酸、ATP等）大量耗竭引起心衰；②神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)（交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素）激活促進水鈉潴留；③快速起搏引起活化鈣通道數(shù)目減少，使心肌收縮能力下降；④心臟舒張期縮短，加重心肌缺血；⑤反應性細胞肥大及心肌纖維化導致心室重塑。第一例心衰快速起搏模型是在1962年由Whipple等[26]在犬動物模型上成功制作。目前心臟快速起搏來誘導制作心衰模型在大型動物上廣泛應用。Kashem等[27]在犬心內(nèi)放置CardioClasp裝置并在第2、3、4周把心率增加至 220 bpm、230 bpm、240 bpm，結果成功制備心衰模型。Takagaki等[28]通過單純?nèi)膬?nèi)置入快速心室起搏（230 bpm），4周后成功誘導心衰發(fā)生。此外模擬心臟手術所用時間（開關開胸手術，持續(xù)45 min）并在術后第3天開始將心率降至190 bpm，4周后犬的左室射血功能明顯下降，收縮末期壓力-容積關系的斜率、射血分數(shù)、心輸出量均明顯降低。心動過速導致的細胞凋亡與心衰發(fā)生呈正相關關系。停止刺激后2～3周心臟收縮及舒張功能可恢復。該模型優(yōu)點是操作時間短、創(chuàng)傷較?。蝗秉c是心衰實現(xiàn)過程較短、實驗對象不穩(wěn)定、混雜因素較多。

5 心肌缺血心衰模型

心肌缺血是心力衰竭最為重要的發(fā)病原因，其生理病理機制與左室心肌重塑及順應性改變相關。

5.1 微栓子心衰模型 微栓子心衰模型制作方法是通過導管將直徑90 μm，約20 000個聚苯乙烯微栓塞球植入左冠狀動脈，3次重復注射且間隔15 min，成功獲得心衰模型［左室射血分數(shù)從（59%±5）%減少至（26%±5）%］[29]。微栓子心衰模型機制為明顯減少冠狀動脈血流、增加左室舒張末期末壓并提高血漿去甲腎上腺素水平。Hedayati等[30]使用微栓塞球聯(lián)合胸主動脈環(huán)繞阻斷建立心衰模型，將0.5 ml，約40 000個/ml聚苯乙烯微球混合在造影劑中推注到冠狀動脈中，監(jiān)測左室射血從63.5%降低至36.5%。微栓子心衰模型的優(yōu)點是可高度模擬臨床發(fā)展過程、無明顯有創(chuàng)操作、減少多系統(tǒng)損傷發(fā)生；但缺點是建模失敗率較高（30%～50%），對操作者的技術要求、經(jīng)濟花費、時間均較高。

5.2 冠狀動脈阻斷心衰模型 冠狀動脈阻斷心衰模型是通過結扎前降支的分支或多處結扎方法來模擬局部心肌缺血，一般多在術后4周左右出現(xiàn)左室擴大、左室舒張末壓升高，進而出現(xiàn)心衰。Moainie等[31]通過結扎前降支分支來誘導心室前外側壁急性心肌梗死，10～12周后直視下觀察到左室舒張末期容積增大1倍以上，左室收縮末容積增加近3倍；超聲心動圖檢查提示左室射血分數(shù)降低、左室舒張末期壓力增加、心輸出量降低。但值得注意的是，前降支遠端或回旋支分支結扎容易產(chǎn)生室壁瘤、乳頭肌梗死并產(chǎn)生嚴重二尖瓣返流。Llaneras等[32]通過造影方式確定回旋支提供血供心肌的范圍，分別結扎回旋支的第一支、第二支及第三支，發(fā)現(xiàn)結扎第一、二支時左室約（23±3.0）%面積梗死，無明顯乳頭肌梗死。當結扎第二、三支時導致左室（21.4±4.0）%梗死，并包括后乳頭肌梗死[33]。也正因為這個特征，其可用于模擬二尖瓣膜損傷的模型。在慢性心衰模型制作中，為了避免直接冠狀動脈結扎對心肌的急性損傷，AMEROID環(huán)、磁性線圈及液氮細針局部冷凍技術[34-36]也逐漸在缺血性心衰模型中應用。通過缺血心肌建立的心衰模型可最大程度上重現(xiàn)因急性心梗繼發(fā)心衰的發(fā)展過程，且沒有混雜因素影響。其缺點在于需要開胸操作、實驗對象死亡率高、對手術者技術要求較高、心律失常發(fā)生率高等。

6 討論

犬心衰模型是研究心力衰竭發(fā)生、發(fā)展、治療及預后最常用的平臺之一。這與犬本身的生理特點、解剖結構、對有創(chuàng)操作耐受性、倫理可行性及經(jīng)濟性等諸多優(yōu)勢因素有關。但具體如何選擇心衰制作方法，要在研究方案基礎上權衡各種模型優(yōu)缺點綜合決定。其中影響選擇最為重要的因素是研究目的，即研究心衰的發(fā)病原因還是治療方式。若心衰是因為心肌局部缺血引起可使用微栓塞球或冠狀動脈結扎方式進行，若是全心衰竭可應用快速起搏或藥物誘導等方法誘導。其次需要明確各種心衰模型特點，如冠狀動脈結扎方式往往是建立一種永久不可逆的心衰模型，而快速起搏或藥物模型在一定程度上是可逆的、臨時的心衰模型（常用于心衰藥理學研究）。此外，一個成功的心衰模型制作與實驗人員熟練程度及操作設備有關，如冠狀動脈結扎心衰模型制作過程中需要正中開胸、暴露冠狀動脈及術中并發(fā)癥的處理等能力。無論使用哪一種心衰模型制作方法，在實驗準備、進行中、術后實驗對象死亡都是不可避免的，一些心衰模型制作過程中死亡率更是高達50%[37]。死亡原因與心衰的病理過程、并發(fā)癥復雜情況及最終臨床結局相關。此外，值得注意的是，因為人體與實驗犬之間存在生理、病理變化及疾病發(fā)展的差異性，使得任何一項動物研究都不可能完全模擬疾病在人體中的發(fā)展過程，實驗結果也都不能簡簡單單的復制到人體上。所以，全面認識動物實驗與人體的差異，對于研究心衰的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后至關重要。

7 展望

目前較常用的心衰模型均存在不同的缺點。新的微創(chuàng)心衰制作的方法如基因替換、基因剔除及轉基因等技術，也被逐漸應用到心衰模型研究過程中。Greineder等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，舒馬替尼可抑制AMP激活蛋白激酶（AMPK）、血小板衍生生長因子受體（PDGFRs）和血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFRs）1，2等三個關節(jié)位點從而阻斷信號傳導機制，造成心衰發(fā)生。Toko等[39]通過基因突變使Bcl-2表達減少或p53上調，從而導致心肌肌鈣蛋白表達異常，造成擴張型心衰模型。其表現(xiàn)出來的對實驗動物影響小、影響因素可控等優(yōu)點將會對心衰相關發(fā)病機制、治療及預后相關研究帶來具大影響。

8 總結

理想犬心衰模型對研究心衰的發(fā)生過程、治療、預后情況起到重要作用，但目前的模型均存在不同的缺點。所以，為了增強模型的可操作性、可重復性及實驗性，并為研究人體心衰的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后提供合適的平臺，還需進一步探索新的犬心衰模型建立方法。

［1］Oeing CU，Tschope C，Pieske B，et al.The new ESC Guidelines for acute and chronic heart failure 2016.Herz，2016，41：655-663.

［2］中華醫(yī)學會心血管病學分會.2014年中國慢性心力衰竭診斷和治療指南.中國心血管病雜志，2014，42：98-122.

［3］Heusch G，Schulz R，Haude M，et al.Coronary microembolization.J Mol Cell Cardiol，2000，36：22-24.

［4］Mehran R，Dangas G，Mintz GS，et al.Atherosclerotic plaque burden and CK-MB enzyme elevation after coronary interventions：Intravascular ultrasound study of 2256 patients.Circulation，2000，101：604-610.

［5］Bowers TR，Stewart RE，O′Neill WW，et al.Effect of Rotablator atherectomy and adjunctive balloon angioplasty on coronary blood flow.Circulation，1997，95：1157-1164.

［6］Williams MJ，Dow CJ，Newell JB，et al.Prevalence and timing ofregionalmyocardialdysfunction afterrotationalcoronary atherectomy.J Am Coll Cardiol，1996，28：861-869.

［7］Ricciardi MJ，Wu E，Davidson CJ，et al.Visualization of discrete microinfarction after percutaneous coronary intervention associated with mild creatine kinase-MB elevation.Circulation，2001，103：2780-2783.

［8］Hasenfuss G.Animal models of human cardiovascular disease，heart failure and hypertrophy.Cardiovasc Res，1998，39：60-76.

［9］Weber KT，Pick R，Silver MA，et al.Fibrillar collagen and remodeling of dilated canine left ventricle.Circulation，1990，82：1387-1401.

［10］Zucker IH，Earle AM，Gilmore JP，et al.The mechanism of adaptation of left atrial stretch receptors in dogs with chronic congestive heart failure.J Clin Invest，1977，60：323-331.

［11］Chekanov VS.A stable model of chronic bilateral ventricular insufficiency（dilated cardiomyopathy）induced by arteriovenous anastomosis and doxorubicin administration in sheep.J Thorac Cardiovasc Surg，1999，117：198-199.

［12］Tessier D，Lajos P，Braunberger E，et al.Induction of chronic cardiac insufficiency by arteriovenous fistula and doxorubicin administration.J Card Surg，2003，18：307-311.

［13］Kleaveland JP，Kussmaul WG，Vinciguerra T，et al.Volume overload hypertrophy in a closed-chestmodelofmitral regurgitation.Am J Physiol，1988，254：H1034.

［14］Young AA，Orr R，Smaill BH，et al.Threedimensional changes in leftand rightventriculargeometry in chronic mitral regurgitation.Am J Physiol，1996，271：2689-2700.

［15］Huang Y，Kawaguchi O，Zeng B，et al.A stable ovine congestive heart failure model.A suitable substrate for left ventricular assist device assessment.ASAIO J，1997，43：408-413.

［16］Carabello BA，Mee R，Collins JJ，et al.Contractile function in chronic gradually developing subcoronary aortic stenosis.Am J Physiol，1981，240：240-280.

［17］Chien SF，Diana JN，Brum JM，et al.A simple technique for producing supravalvular aortic stenosis in animals.Cardiovasc Res，1988，22：739-745.

［18］Zile MR，Brutsaert DL.New concepts in diastolic dysfunction and diastolic heart failure；part Ⅰ：diagnosis，prognosis，and measurements of diastolic dysfunction.Circulation，2002，105：1387-1393.

［19］Wilson DW，Segall HJ，Pan LC，et al.Mechanisms and pathology of monocrotaline pulmonary toxicity.Crit Rev Toxicol，1992，22：307-325.

［20］Chen EP，Bittner HB，Tull F，et al.An adult canine model of chronic pulmonary hypertension for cardiopulmonary transplantation.J Heart Lung Transplant，1997，16：538-547.

［21］LeeV， RandhawaAK， SingalPK.Adriamycin-induced myocardial dysfunction in vitro is mediated by free radicals.Am J Physiol，1991，261：989-995.

［22］Bristow MR，Sageman W，Scott R，et al.Acute and chronic cardiovascular effects of doxorubicin in the dog：the cardiovascular pharmacology of drug-induced histamine release.J Cardiovasc Pharmacol，1980，2：487-515.

［23］Soltero ER，Michael LH，Glaeser DH，et al.New configuration of double cardiomyoplasty based on studies of the length-tension properties of the latissimus dorsi muscle.J Thorac Cardiovasc Surg，1993，106：842-849.

［24］Kamijo T， Tomaru T， Miwa AY， et al.The effects of dobutamine，propranolol and nitroglycerin on an experimental canine model of congestive heart failure.Jpn J Pharmacol，1994，65：223-231.

［25］Lucas CM，Cheriex EC，van der Veen FH，et al.Imipramine induced heart failure in the dog:a model to study the effect of cardiac assist devices.Cardiovasc Res，1992，26：804-809.

［26］Whipple GH，Sheffield LT，Woodman EG，et al.Reversible congestive heart failure due to rapid stimulation of the normal heart.In：Proc New Engl Cardiovasc Soc，1961-1962，20：39-40.

［27］Kashem A，Hassan S，Crabbe DL，et al.Left ventricular reshaping：effects on the pressurevolume relationship.J Thorac Cardiovasc Surg，2003，125：391-399.

［28］Takagaki M，McCarthy PM，Tabata T，et al.Induction and maintenance of an experimental model of severe cardiomyopathy with a novel protocol of rapid ventricular pacing.J Thorac Cardiovasc Surg，2002，123：544-549.

［29］Huang Y，Kawaguchi O，Zeng B，et al.A stable ovine congestive heart failure model.ASAIO J，1997，43：408-410.

［30］Hedayati N，Sherwood JT，Schomisch SJ，et al.Circulatory benefits of diastolic counterpulsation in an ischemic heart failure model after aortomyoplasty.J Thorac Cardiovasc Surg，2002，123：1067-1073.

［31］Moainie SL，Gorman JH 3rd，Guy TS，et al.An ovine model of postinfarction dilated cardiomyopathy.Ann Thorac Surg，2002，74：753-760.

［32］Llaneras MR，Nance ML，Streicher JT，et al.Large animal modelofischemic mitralregurgitation.Ann Thorac Surg，1994，57：432-439.

［33］Markovitz LJ，Savage EB，Ratcliffe MB，et al.Large animal 1452 REVIEW MONNET AND CHACHQUES model of left ventricular aneurysm.Ann Thorac Surg，1989，48：838-845.

［34］Hartman JC，Kampine JP，Schmeling WT，et al.Actions of isoflurane on myocardial perfusion in chronically instrumented dogs with poor， moderate， or well-developed coronary collaterals.J Cardiothorac Anesth，1990，4：715-725.

［35］Li RK，Weisel RD，Mickle DA，et al.Autologous porcine heart cell transplantation improved heart function after a myocardial infarction.J Thorac Cardiovasc Surg，2000，119：62-68.

［36］Li RK，Jia ZQ，Weisel RD，et al.Smooth muscle cell transplantation into myocardialscartissue improves heart function.J Mol Cell Cardiol，1999，31：513-522.

［37］Schmitto JD，Mokashi SA，Lee LS，et al.Large Animal Models of Chronic Heart Failure （CHF）.J Surg Res，2011，166：131-137.

［38］Greineder CF，Kohnstamm S，Ky B.Heart Failure Associated with Sunitinib：Lessons Learned from Animal Models.Curr Hypertens Rep，2011，13：436-441.

［39］Toko H，Takahashi H，Kayama Y，et al.Ca2+/calmodulindependent kinase IIdelta causes heart failure by accumulation ofp53 in dilated cardiomyopathy.Circulation，2010，122：891 －899.

The current situation and progress of animal model of canine heart failure

Heart failure； Canine； Model

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.12.001

R541.6

A

1672-5301（2017）12-1057-05

100083 北京市，北京大學第三醫(yī)院心臟外科

張喆，E-mail：zhangzhe@bjmu.edu.cn

2017-07-24）