王旭東， 張更謙， 張曉嘉， 王佳琦， 陳尚坤

(1.西南政法大學刑事偵查學院， 重慶 401120; 2.山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院物證教研室， 山西太原 030001;3.吉林省警察學院 吉林長春 130117)

土壤微生物結(jié)構(gòu)的T-RFLP及其法醫(yī)學應用分析

王旭東1， 張更謙2， 張曉嘉2， 王佳琦2， 陳尚坤3

(1.西南政法大學刑事偵查學院， 重慶 401120; 2.山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院物證教研室， 山西太原 030001;3.吉林省警察學院 吉林長春 130117)

目的 用末端標記限制性片段長度多態(tài)性方法(T-RFLP)，觀察不同地域土壤微生物構(gòu)成的多態(tài)性，為法醫(yī)學土壤成分分析和地域鑒別提供適當?shù)姆治龇椒?。方?采集吉林省和重慶市兩地的土壤樣本，用PowerSoil?試劑盒提取土壤細菌DNA，PCR擴增16S rRNA基因的多態(tài)性區(qū)域，引物的5’端采用FAM標記。擴增產(chǎn)物分別用MspⅠ、RsaⅠ內(nèi)切酶消化后，用3130遺傳分析儀進行電泳分離。采用主成分分析(PCA)法和主效可加護作用可乘模型(AMMI)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 采用MspⅠ酶切后，T-RFLP法可以明確分離重慶和吉林兩地的土壤樣本。RsaⅠ酶切后分離效果稍差。結(jié)論 T-RFLP法可以區(qū)分來自重慶、吉林兩地域的土壤樣本，為法醫(yī)學土壤多樣性分析提供了一種可靠的分析方法。

末端標記限制性片段長度多態(tài)性； 土壤細菌； 法醫(yī)學

0 引言

法醫(yī)學對土壤分析非常感興趣，因為土壤很容易沾到人和物上，因此對案發(fā)現(xiàn)場的確定、犯罪嫌疑人的行動軌跡追蹤很有意義，可為案件提供有價值的線索。以前在偵查破案中檢測土壤主要是針對土壤的物理特征、化學構(gòu)成，如土壤種類、顏色、顆粒大小、土壤酸堿度、主要元素、礦物和有機成分。但是，這些參數(shù)的多樣性有限，不能充分地區(qū)分兩種土壤樣本。因此，分析土壤中微生物的差別來鑒別泥土的來源，無疑可成為提供偵查線索和證據(jù)的有效思路。環(huán)境微生物學的研究已充分證明，土壤中存在大量微生物，并且土壤中的微生物呈多樣性分布，不同地區(qū)及同一地區(qū)不同地點所分布的微生物種類不同、菌株也不同。大量的微生物基因組測序顯示，不同種類微生物的基因組序列存在差異，不同菌株的某些位置序列存在多態(tài)性[1-2]。

近年來發(fā)展起來的末端標記限制性片段長度多態(tài)性 (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP技術(shù))為這一區(qū)分策略提供了新的技術(shù)平臺。該方法建立在PCR的基礎(chǔ)上,不需要分離培養(yǎng)細菌，因而避免了培養(yǎng)方法的弊端。通過設(shè)計出細菌的通用引物，對所有細菌的16S rRNA 片段進行擴增，將擴增產(chǎn)物酶切，酶切后產(chǎn)生大小不同的片段，根據(jù)酶切產(chǎn)物片段圖譜的差異，可明確微生物種群的差異，從而實現(xiàn)對檢材來源的快速、準確的分析[3]。

1 材料

1.1 土壤采集

土壤樣本共42個，分別來自吉林省和重慶市，具體見表1。

1.2 實驗材料

PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒(MO BIO，美國)；內(nèi)切酶MspⅠ和RsaⅠ(New England Biolabs，英國)；rTaq和dNTP(Takara，日本)；引物序列為 8F: 5’FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG， 785R: 5’-ACTACCTGGGTATCTAATCC，擴增產(chǎn)物總長度約777 bp[4]；引物合成和標記由生工生物工程(上海)股份公司完成。

2 方法

2.1 土壤DNA提取與擴增

采用MO BIO PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒，具體步驟按照試劑盒說明書進行。 簡單步驟如下： 取250 mg的樣品加入power Bead管中，加入C1溶液混勻，10 000 g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入C2溶液混勻，10 000 g離心1 min,將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入C3溶液，10 000 g離心1 min，取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加C4溶液混勻，每次取600 μL加入過濾柱中，10 000 g離心1 min,重復3次，在過濾柱中加入C5洗滌，10 000 g離心1 min,將過濾柱換到新的離心管中，加入C6溶液，10 000 g離心1 min,收集離心管中的DNA。測定樣本OD值并計算其濃度。

表1 土壤樣本

用ABI PCR 9700擴增儀進行擴增。擴增條件如下：總體系50 μL，其中含 PCR緩沖液5 μL、dNTP 200 μM、引物濃度0.2 μM、rTaq 3U、DNA 100 ng。PCR反應條件：95 ℃ 5 min預變性；共36個循環(huán)：95 ℃ 10 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

2.2 酶切

擴增結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物，分別用內(nèi)切酶MspⅠ、RsaⅠ酶切。25 μL酶切體系含有緩沖液2.5 μL、內(nèi)切酶(MspⅠ或者RsaⅠ)10U，擴增產(chǎn)物10 μL。放置于37 ℃水浴條件下過夜后煮沸滅活內(nèi)切酶。

2.3 電泳和自動分析

電泳在ABI公司Genetic Analyzer 3130遺傳分析儀上進行。具體步驟如下: 取去離子甲酰胺9.5 μL、0.2 μL內(nèi)標(LIZ 500)和1.5 μL酶切產(chǎn)物混合后95 ℃ 3 min，立即冰浴，然后上樣電泳。用GeneMapper 3.2分析電泳結(jié)果。顯示每個實際位置，BIN設(shè)置為±0.5 bp，大于該值被認為是不同的OTU(Operational Taxonomic Units)，即不同的峰。

2.4 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計收集90～500 bp之間的所有峰高大于50的峰。記錄峰位置、峰高和峰面積的大小，作為原始數(shù)據(jù)(Raw Data)。將Raw Data用T-REX軟件進行在線匹配(http:∥trex.biohpc.org/)，并生成矩陣數(shù)據(jù)。對所得數(shù)據(jù)分別采用IMMA分析和PCA分析。IMMA分析由T-REX在線完成，PCA分析由IBM SPSS23.0完成。

3 結(jié)果

3.1 不同地域的土壤的差別

MspⅠ酶切后T-RFLP圖譜顯示，吉林地區(qū)與重慶地區(qū)的樣本T-RFLP差別較大。峰的大小和組合完全不同。兩地區(qū)的土壤樣本，其特征峰(箭頭所示)的片段大小和高度以及豐度都相差較大，即擁有不同的特征峰型組合，可明確區(qū)別來自這兩地區(qū)的土壤，如圖1。而用RsaⅠ酶切后T-RFLP圖譜，并不能將不同的地區(qū)的土壤分開(見圖2)。

圖1 不同地域土壤樣本MspⅠ酶切后的T-RFLP圖譜A:代表4號樣本，B:代表9號樣本，C:代表10號樣本，D:代表15號樣本，E: 代表16號樣本，F(xiàn): 代表17號樣本。A、B、C來自重慶市，D、E、F來自吉林省。箭頭指示特征峰。

圖2 不同地域土壤樣本RsaⅠ酶切后的T-RFLP圖譜(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所做的PCA分析，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所做的PCA分析。

3.2 可重復性

重慶地區(qū)土壤樣本4、樣本9為在2 m2內(nèi)采集的兩份土壤，二者與樣本10相距約50 m。用MspⅠ酶切所得T-RFLP圖更為相似，其特征峰的片段大小高度相近，即采自于同一片區(qū)域的樣本有一定的重復性(見圖1)。

3.3 對MspⅠ酶切后T-RFLP圖譜的分析

擴增產(chǎn)物用兩種限制性內(nèi)切酶MspⅠ和RsaⅠ進行酶切，對T-RFLP分別根據(jù)峰高和峰面積進行主成分分析(PCA)和主效可加護作用可乘模型(AMMI)分析。MspⅠ 酶切處理后，PCA分析可見重慶和吉林地區(qū)的樣本大致分成兩個群落，并且峰高和峰面積的分析結(jié)果一致。8號樣本與其他樣本多態(tài)性差別較大，顯示出該地點土壤菌群的較高特異性(見圖3)。

圖3 MspⅠ酶切所得主成分分析(PCA)圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所做的PCA分析，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所做的PCA分析。 可見重慶和吉林地區(qū)的樣本大致分成兩個群落。 8號樣本與其他樣本多態(tài)性差別較大，顯示出該地點土壤的特異性。

用在線分析軟件T-REX對吉林和重慶地區(qū)的土壤樣本進行AMMI分析，分別以峰高、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素和以峰面積、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素。用MspⅠ酶切后，AMMI分析可以將吉林土和重慶地區(qū)土壤細菌分為兩個群落。散點圖中吉林地區(qū)土壤樣本較為集中，重慶地區(qū)土壤樣本較為離散，分析為重慶土壤取樣位置、取樣高度差異較大，從而導致了土壤中細菌種類和數(shù)量的較大差異，而吉林土壤取自同一高度及環(huán)境相似的農(nóng)田，因而環(huán)境對細菌菌落影響較小。8號樣本獨立于吉林和重慶兩地區(qū)土壤細菌群落外，影響因素除了位置，可能還有其較獨特的環(huán)境因素。PCA 分析和AMMI分析均可較明確區(qū)分重慶與吉林地區(qū)的土壤。 但是AMMI分析后，吉林地區(qū)樣本的結(jié)果顯示更加集中(見圖4)。

圖4 MspⅠ酶切后進行T-REX在線AMMI分析數(shù)據(jù)圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所得AMMI分析圖，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所得AMMI分析圖。吉林地區(qū)樣本分布集中，重慶地區(qū)由于采樣高度和采樣位置的不同較為分散。其中兩圖中8號樣本的土壤顯示與其他地方土壤微生物的差異較大。

3.4 對RsaⅠ酶切后T-RFLP圖譜的分析

圖5 RsaⅠ酶切后得到的主成分分析(PCA)分析圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所做的PCA分析，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所做的PCA分析。根據(jù)分析圖，RsaⅠ難以將重慶和吉林省兩地的土壤樣本明確區(qū)分，且多數(shù)樣本較為集中。

對吉林和重慶地區(qū)的樣本，經(jīng)RsaⅠ酶切后的T-RFLP圖譜，根據(jù)特征峰的峰高和峰面積進行PCA分析和AMMI分析，結(jié)果顯示，兩地區(qū)的點混雜在一起，無論用峰的有無還是峰面積均難以區(qū)分兩地區(qū)土壤樣本(見圖5，圖6)。

圖6 RsaⅠ酶切后進行T-REX在線進行AMMI分析數(shù)據(jù)圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所得AMMI分析圖，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所得AMMI分析圖。(a),(b)兩圖中樣本5，樣本12顯示與其它區(qū)域的土壤差異較大。

4 討論

構(gòu)成土壤生態(tài)環(huán)境的因素眾多，包括土壤的用途、植被、氣候、光照、高度等，從而造成土壤微生物群落構(gòu)成上的差別。而T-RFLP法正是以這種差別為理論基礎(chǔ)區(qū)分各個地區(qū)土壤，即用內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生不同長度大小的DNA片段，通過末端標記的熒光PCR產(chǎn)物的電泳差異顯示出來。凡有差異的土壤應該表現(xiàn)出不同的DNA圖譜和特征峰[5-6]。

本文用T-RFLP分析不同地域土壤細菌16SrRNA基因的多態(tài)性。實驗表明，采用該方法可以成功提取大部分土壤的細菌DNA并成功擴增和分析。本文中采自吉林、重慶有23份樣本可成功分析，采自重慶的33份土壤樣本中，有16份樣本未能成功分析。吉林樣本9份，一份樣本未能分析。未能成功分析的樣本，在DNA提取后，雖在瓊脂糖凝膠電泳后觀測到清晰的土壤細菌基因組DNA條帶，但仍無法完成PCR過程，我們曾嘗試多種方法，如更換DNA提取試劑盒，用乙醇沉淀后重新純化DNA，改善擴增條件等方法仍無法獲得有效的擴增產(chǎn)物。分析可能為該地區(qū)土壤腐殖酸等抑制擴增的物質(zhì)含量過多，抑制PCR擴增[7]。隨著模板量的增大，抑制擴增的物質(zhì)也隨之增加，一些樣本在減少模板量的條件下可以擴增出產(chǎn)物。土壤成分復雜，如何有效減少擴增抑制物，這是在分析土壤時必需注意的。

兩個地區(qū)的土壤細菌擴增產(chǎn)物采用內(nèi)切酶MspⅠ處理后，可以將此二地區(qū)的土壤有效地分離開來，而內(nèi)切酶RsaⅠ處理后，不能有效地將兩地區(qū)土壤分開。推測是因為兩種酶的酶切序列不同，MspⅠ的酶切序列為5’…C＾CFF…， RsaⅠ的酶切序列為5’…GT＾AC…。另一方面我們用的引物是8F-785R,能擴增出60%～90%的土壤細菌菌落DNA，但并不是全部細菌DNA，對于一些特異性菌落可能不能擴出，因此可以嘗試其他引物結(jié)合不同的酶進一步改進。

我們用PCA和AMMI兩種方法，通過對兩種酶處理后的T-RFLP圖譜的分析，結(jié)果顯示，這兩種方法結(jié)果一致。土壤樣本距離越近，T-RFLP圖譜越相似，應用此二方法所得出的位置也越接近，而且說明該兩種分析方法均具有良好的可靠性和重復性。我們亦驗證了AMMI相較于PCA能夠發(fā)現(xiàn)更微小的差異，說明 AMMI模型能更透徹地分析交互作用(G×E)信息[8]。

內(nèi)切酶MspⅠ處理后，用AMMI 模型分析吉林地區(qū)的土壤，結(jié)果顯示分布非常集中，考慮為土壤樣本來源的環(huán)境影響較為一致。來自重慶土壤樣本分布較為離散，考慮可能為不同高度位置(山頂，山腳)和不同環(huán)境(水塘，路邊干燥處)使細菌群落表現(xiàn)出了較大的差異。不同地點由近到遠呈漸變趨勢，如11號樣本地處樣本7和樣本12之間，而在AMMI分析圖上也位于兩點之間。由于土壤的多樣性，即使是取自同一地區(qū)的土壤，也有可能出現(xiàn)土壤菌落結(jié)構(gòu)的差異。對于8號樣本這樣與其他菌群差異較大的樣本，我們不能分析出其是哪一地區(qū)的土壤，但可以利用其特殊性，如沾在證據(jù)(如鞋、衣服)上的土壤和案發(fā)現(xiàn)場土壤直接進行比對，來推測其歸屬地的同一性。

直接提取土壤細菌全基因組DNA過程簡單，擴增和結(jié)果分析易于自動化(儀器檢測后以數(shù)字化的形式直接輸出結(jié)果，減少了分析時人為誤差)，便于推廣，在各地有DNA實驗室的公安局即可自行檢測；另外通過遺傳分析儀對任何一種末端限制性片段的檢測，均可以建立相應的地區(qū)土壤數(shù)據(jù)庫，亦可與已知數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行比較分析，確定樣品所包含的微生物在系統(tǒng)中的分類地位，整個過程可在較短的時間內(nèi)完成[9]。在本研究中選用16S rRNA保守序列與不同內(nèi)切酶相結(jié)合的方法對土壤細菌群落進行研究，結(jié)果證明并不是所有的酶和引物都適合：16S rRNA序列與MspⅠ內(nèi)切酶結(jié)合，在土壤多態(tài)性研究方面是一種有效的手段，重復性好，穩(wěn)定性高，但16S rRNA序列結(jié)合RsaⅠ內(nèi)切酶對不同地區(qū)土壤的鑒別能力較差。我們將進一步用不同引物和不同酶組合的方法檢測土壤微生物的多樣性，為法醫(yī)微生物學研究土壤提供更有效的方法。

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(責任編輯 于瑞華)

吉林省科技發(fā)展計劃重點項目“微生物16SrRNA的T-RFLP技術(shù)在法庭科學中的應用研究”(20110424)。

王旭東(1970—)，男，山西平陸人，醫(yī)學博士，副教授。研究方向為法醫(yī)遺傳學。

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