王煒靈 李蔚華

基礎(chǔ)研究

重組人促紅細(xì)胞生成素保護(hù)缺血再灌注大鼠心肌微循環(huán)的機(jī)制探討

王煒靈 李蔚華

目的 探討重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）保護(hù)缺血再灌注大鼠心肌微循環(huán)的機(jī)制。方法將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為SHAM組、IR組和rhEPO組，每組20只。SHAM組假手術(shù)處理后30 min，腹腔注射0.5 ml生理鹽水。IR組和rhEPO組大鼠缺血30 min，再灌注1 h；再灌注開始時(shí)，IR組大鼠腹腔注射0.5 ml生理鹽水，rhEPO組腹腔注射5000 U/kg rhEPO（加生理鹽水稀釋至0.5 ml）。ELISA法檢測(cè)心肌NO和eNOS含量，Western blot法檢測(cè)心肌p-Akt和Akt蛋白表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)VEGF和CD31的陽(yáng)性表達(dá)，HE染色觀察心肌微結(jié)構(gòu)變化，墨汁灌注的方法計(jì)數(shù)新生血管數(shù)。結(jié)果 與IR組相比，rhEPO組心肌中NO、eNOS、p-Akt的表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），p-Akt/Akt比值明顯增大（P＜0.01）；VEGF和CD31的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；心肌微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕；墨汁灌注的毛細(xì)血管數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與SHAM組相比，rhEPO組心肌組織的NO、eNOS、p-Akt的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），p-Akt/Akt明顯增大（P＜0.01）；VEGF和CD31的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論 rhEPO保護(hù)缺血再灌注大鼠心肌微循環(huán)，可能的機(jī)制是與PI3K/AkteNOS-NO信號(hào)途徑促進(jìn)新生血管的生成相關(guān)。

重組人促紅細(xì)胞生成素； 缺血再灌注損傷； 冠脈微循環(huán)

急性心肌梗死（AMI）是急診搶救中常見的危重癥，及時(shí)有效恢復(fù)心肌的血液灌注，挽救瀕死的心肌是搶救成功的關(guān)鍵[1]。但再灌注會(huì)造成損傷，減少缺血再灌注損傷是提高心?；颊呷芩ㄖ委煶晒β屎痛婊盥实年P(guān)鍵。促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）可減輕心臟缺血再灌注損傷，發(fā)揮心臟保護(hù)作用，本研究旨在探討其機(jī)制，為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小動(dòng)物呼吸機(jī)（奧爾科特、ALCV8S）；酶標(biāo)儀（Rayto，Rt2100c）；紫外可見分光光度計(jì)（上?，F(xiàn)科儀器有限公752-p）；重組人EPO（rhEPO）注射液（益比奧，沈陽(yáng)三生）；NO和eNOS檢測(cè)試劑盒（南京建成A012和H195）；SABC免疫組化試劑盒（谷歌，貨號(hào)GB13007）；DAB顯色試劑盒（谷歌，K5007）；p-Akt和 Akt一抗（CST#4060，CST#4691）；HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG（谷歌，GB23303）；β-actin（谷歌，GB13001-3）；VEGF和CD31一抗（博世德BA0407和BA2966）等。

1.2 研究對(duì)象 60只健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，購(gòu)于湖北省疾控中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42000600009468。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，體重（253±8.4）g，造模前大鼠禁食12 h，不禁水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。將60只大鼠隨機(jī)分為3組：SHAM組（假手術(shù)組）、IR組和rhEPO組，每組20只大鼠。

1.3 方法

1.3.1 大鼠心臟缺血再灌注模型的建立 大鼠仰臥位固定，腹腔注射4%水合氯醛麻醉，氣管插管后立即連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（呼吸頻率110次/min）。打開胸腔，剪開心包膜，左心耳根下緣約2 mm處用5-0絲線穿過(guò)心肌層，連同直徑2 mm的塑料膠管結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支；結(jié)扎30 min后，剪開結(jié)扎線再灌注60 min。冠脈結(jié)扎成功的標(biāo)志：結(jié)扎遠(yuǎn)端心肌顏色變紫，心電圖表現(xiàn)為ST段抬高和（或）T波高聳。再灌注損傷模型成功標(biāo)志：缺血部位心肌顏色基本恢復(fù)，抬高的ST段下降50%以上。EPO治療組在解除結(jié)扎后立即腹腔注射5000 U/kg的rhEPO（用生理鹽水稀釋至0.5 ml），假手術(shù)組和IR模型組注射等量生理鹽水。

1.3.2 心臟標(biāo)本的留取 術(shù)后立即處死大鼠并摘取心臟組織，用刀片在結(jié)扎點(diǎn)至心尖連線中點(diǎn)處切取1.5~2.0 mm心內(nèi)膜下心肌組織，浸泡于40%的多聚甲醛中，用于HE染色及免疫組化染色，剩余標(biāo)本置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)心肌組織中的NO、eNOS 稱適量的組織，用9倍的生理鹽水研磨，然后將研磨液以3000~4000 r/min離心10 min，取上清放入4℃的冰箱待測(cè)。NO的檢測(cè)：①按照說(shuō)明書步驟加入樣本和R1、R2混合試劑，37℃水浴60 min。②加入R3、R4，抽提室溫靜置40 min，3500~4000 r/min離心10 min。③取上清0.5 ml，加入顯色劑，靜置10 min，置于分光光度計(jì)波長(zhǎng)550 nm處，0.5 cm光徑比色皿，雙蒸水調(diào)零，比色，記下數(shù)值。eNOS的檢測(cè)：①按照說(shuō)明書配制標(biāo)準(zhǔn)品液、標(biāo)本稀釋液和洗滌液。②加樣，每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120 min。③洗板，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次，向?yàn)V紙上印干。④每孔中加入第一抗體工作液100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60 min。洗板（同上）。⑤每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μl，將反應(yīng)板置37℃30 min。洗板（同上）。⑥每孔加入底物工作液100 μl，置37℃暗處反應(yīng)15 min。⑦每孔加入100 μl終止液混勻，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值。

1.3.4 Western bolt法（WB）檢測(cè)p-Akt及Akt的蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt的比值 ①將50 mg心肌組織放入玻璃勻漿器中，加入細(xì)胞裂解液、PMSF裂解液、cocktail和磷酸酶抑制液（A液和B液），冰浴上勻漿。②12 000 r/min離心15 min，取上清液即為總蛋白。BCA法測(cè)定總蛋白濃度。③取10 μl蛋白樣品，煮沸使蛋白變性，10%SDS-PAGE電泳60 min，冰浴中恒電流276 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。④Akt用5%脫脂奶粉封閉2 h，p-Akt用5%BSA封閉2 h。然后TBST清洗3次，每次10 min。加入一抗（1∶1000和1∶2000），4℃孵育過(guò)夜。⑤TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗1∶3000）孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL發(fā)光液曝光。用凝膠成像分析儀掃描各條帶。Quantity One軟件分析灰度值。以β-actin作為內(nèi)參，灰度值以各蛋白與內(nèi)參的灰度值比值來(lái)表示。

1.3.5 SABC免疫組化法分析VEGF及CD31的表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸（PH6.0）修復(fù)液沸騰后計(jì)時(shí)2 min。PBS洗滌3次，每次5 min。切片放入3%過(guò)氧化氫溶液避光孵育25 min，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。在組化筆圈內(nèi)滴加3%BSA室溫封閉30 min；甩掉封閉液，滴加一抗（1∶1000和1∶1500），4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，加二抗（1∶2000）孵育50 min。加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來(lái)水沖洗切片，終止顯色。蘇木素復(fù)染3 min左右，1%的鹽酸酒精風(fēng)化數(shù)秒，返藍(lán)，流水沖洗；脫水，中性樹膠封片。采集圖像，用Image-ProPlus 6.0軟件分別測(cè)量IOD（積分光密度）和A（面積），計(jì)算出AIOD值。

1.3.6 HE染色 在冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎點(diǎn)至心尖連線中點(diǎn)處取2 mm左右心內(nèi)膜下心肌組織，放入甲醛中固定，切片，行HE染色，觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.7 墨汁灌注法觀察冠脈毛細(xì)血管墨汁灌流數(shù) 再灌注結(jié)束后每組各取5只大鼠，由心尖進(jìn)針，穿入左心室，灌注生理鹽水［壓力不超過(guò)90～110 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）］，然后剪開右肺葉觀察流出液的顏色。當(dāng)流出液呈無(wú)色透明時(shí)，改用墨汁與低分子右旋糖酐以7∶3比例配制而成的墨汁灌注液繼續(xù)灌注，觀察全身顏色的變化，至逐漸變?yōu)榫鶆虬祷疑珪r(shí)取出心臟，于10%甲醛固定后，做石蠟切片。每只大鼠隨機(jī)選3張200×的病理切片圖像，每張切片圖像分別取3個(gè)視野（左室前壁外層、左室前壁中內(nèi)層、室間隔前2/3），以Image-ProPlus圖像分析軟件計(jì)毛細(xì)血管的數(shù)目（鏡下呈黑色點(diǎn)狀或條狀）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，組內(nèi)比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA結(jié)果 與SHAM組相比，IR組大鼠心肌組織的NO含量明顯增加（P＜0.01），eNOS的含量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與IR組相比，rhEPO組大鼠心肌組織的NO和eNOS含量明顯增加（P＜0.01）。與SHAM組相比，rhEPO組大鼠心肌組織的NO和eNOS含量明顯增加（P＜0.01）。見圖1。

2.2 WB結(jié)果 三組大鼠心肌組織中Akt的表達(dá)量無(wú)差異。與SHAM組相比，IR組大鼠心肌組織中p-Akt的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），p-Akt/Akt明顯增大（P＜0.01）。與IR組相比，rhEPO組大鼠心肌組織中p-Akt的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），p-Akt/ Akt明顯增大（P＜0.01）。與SHAM組相比，rhEPO組大鼠心肌組織中p-Akt的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），p-Akt/Akt明顯增大（P＜0.01）。見圖2。

2.3 免疫組化結(jié)果 與IR組相比，rhEPO組大鼠心肌組織中VEGF和CD31表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。與SHAM組相比，IR組大鼠心肌組織中VEGF和CD31表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）。見圖3、4。

2.4 HE染色結(jié)果 與SHAM組相比，IR組大鼠心肌細(xì)胞水腫、壞死融合成片，膠原纖維網(wǎng)斷裂，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與IR組相比，rhEPO組上述形態(tài)學(xué)表現(xiàn)均明顯減輕。見圖5。

2.5 墨汁灌注結(jié)果 與IR組相比，rhEPO組大鼠的心肌毛細(xì)血管灌流數(shù)明顯增加（P＜0.01）。IR組大鼠心肌血管灌流數(shù)明顯減少，甚至出現(xiàn)無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，但是IR組大鼠心肌不同部位的新生血管數(shù)均明顯多于SHAM組。見圖6、7。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，EPO在腎臟、腸道、心臟等器官的缺血再灌注模型中，能夠減輕缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)[2-4]。蔡智慧等[5]發(fā)現(xiàn)，在大鼠缺血再灌注模型中，聯(lián)合使用EPO和氟伐他汀能增加血液中NO的含量，提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的活性，且效果更明顯，能夠減輕大鼠的缺血再灌注損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。在心肌細(xì)胞中，EPO和促紅細(xì)胞生成素受體（Erythropoietin receptor，EPOR）相互作用的心臟保護(hù)作用，好像是由PI3K-Akt-eNOS信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的，上述途徑是急性應(yīng)答[6]。有報(bào)道稱，在缺血再灌注損傷中，一氧化氮（Nitric oxide，NO）可舒張血管、減少凋亡、保護(hù)器官[7-9]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的糖基化細(xì)胞有絲分裂素，在增強(qiáng)血管的滲透性、血管生成，以及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial celladhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）是血管內(nèi)皮的重要標(biāo)記物，對(duì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記特異性很強(qiáng)，并參與血管新生過(guò)程，有效地反映血管新生的程度[10]。

EPO減輕大鼠心臟的缺血再灌注損傷，可能的機(jī)制是EPO與EPOR結(jié)合后，激活PI3K/AkteNOS-NO信號(hào)途徑，繼而保護(hù)心肌細(xì)胞和心肌微循環(huán)。在心臟缺血再灌注損傷中，PI3K/Akt激活后，減輕心肌凋亡和炎癥；EPO誘導(dǎo)冠脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生eNOS，繼而上調(diào)NO的生成量，使冠狀動(dòng)脈舒張，增加冠狀動(dòng)脈的血流灌注。在心臟缺血再灌注損傷中，EPO誘導(dǎo)上調(diào)VEGF和CD31的表達(dá)量，對(duì)新生血管的生成起促進(jìn)作用，從而減輕缺血再灌注損傷。

Ali-Hassan-Sayegh等[11]對(duì)經(jīng)皮冠脈再通術(shù)后的患者應(yīng)用EPO是否有保護(hù)效應(yīng)做了薈萃分析。該分析顯示，短期應(yīng)用EPO在心臟功能、梗死面積的減少和全因死亡率方面并沒有改善。低劑量的EPO治療可能不是心梗患者的選擇，高劑量可能更有效。眾所周知，EPO必須在梗死時(shí)立即應(yīng)用，才能達(dá)到更好的心臟保護(hù)作用，然而在臨床實(shí)踐中通常提供不了這樣的便利。

對(duì)于EPO能否減輕心臟缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌微循環(huán)，需要更深入的研究，比如EPO的應(yīng)用劑量、應(yīng)用時(shí)間、作用機(jī)制等。這些研究在臨床上將有助于改善AMI患者冠脈再通術(shù)后的預(yù)后。

（本文圖片見后插二、三）

［1］劉健，熊瑋玨，王偉民.《2015年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)/美國(guó)心血管造影與介入學(xué)會(huì) ST段抬高心肌梗死患者處理指南更新》解讀.中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，2016，24：607-611.

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［5］蔡智慧，王興紅.促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制.中國(guó)醫(yī)療前沿，2012，7：6.

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［10］卞中國(guó).重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷血管新生的影響及相關(guān)機(jī)制研究.蘇州大學(xué)碩士論文，2014.

［11］Ali-Hassan-Sayegh S，Mirhosseini SJ，Tahernejad M，et al. Administration of erythropoietin in patients with myocardial infarction：does it make sense?An updated and comprehensive meta-analysis and systematic review.Cardiovasc Revasc Med，2015，16：179-189.

The study of mechanism how rhEPO protect myocardial microcirculation of rat with ischemia-reperfusion injury

WANG Wei-ling，LI Wei-hua.Department of Cardiology，Liyuan Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430077，China Corresponding author：LI Wei-hua，E-mail：liwh80@163.com

Objective The study investigates the mechanism how rhEPO protect myocardial microcirculation of rat with ischemia-reperfusion injury.MethodsSixty male SD rats were randomly divided into sham operation group，ischemia-reperfusion group and recombinant human erythropoietin group.0.5 ml saline intraperitoneal in SHAM group was injected.Myocardial ischemia was done for 30 minutes and then reperfusion for 1 hour to the rats in IR group and rhEPO group.At the beginning of reperfusion，0.5 ml saline was injected intraperitoneal in IR group and 5000 U/Kg rhEPO（which is diluted to 0.5 ml by saline）in rhEPO group.The production of NO and eNOS were detected by ELISA，the protein expressions of p-Akt and Akt were determined by Western Blot，the positive protein expression of VEGF and CD31 were determined by IHC.Myocardium were stained by HE staining，the counting of newborn capillary vessels by ink reperfusion.ResultsCompared with IR group，the production of NO，eNOS，p-Akt and the ratio p-Akt/Akt were obviously higher in rhEPO group（P＜0.01），the positive protein expression of VEGF and CD31 were obviously increased（P＜0.05），the myocardial microstructure revealed lighter injury，the quantity of reborn capillary vessels by ink reperfusion increased obviously（P＜0.01）.Compared with SHAM group，the production of NO，eNOS，p-Akt and the ratio p-Akt/Akt were obviously higher in rhEPO group（P＜0.01），the positive protein expression of VEGF and CD31 were obviously increased（P＜0.05）.ConclusionrhEPO protects myocardial microcirculation in rats which suffer from ischemia reperfusion.Its probable mechanism is related with the PI3K/Akt-eNOS-NO signal pathway and the angiogenesis effect of rhEPO.

rhEPO； Ischemia reperfusion injury； Coronary microcirculation

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.07.022

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）07-0664-04

2016-12-03）

湖北省自然科學(xué)基金計(jì)劃面上項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：CGZ0095）

430077 湖北省武漢市，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院心內(nèi)科

李蔚華，E-mail：liwh80@163.com