趙科研 郭曉東 李紅巖 佟昌慈 張玉彪 王輝山 侯明曉

基礎(chǔ)研究

過(guò)表達(dá)eNOS的MSCs對(duì)高血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠的治療作用

趙科研 郭曉東 李紅巖 佟昌慈 張玉彪 王輝山 侯明曉

目的 觀察過(guò)表達(dá)eNOS的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)高血流性肺動(dòng)脈高壓的作用。方法 構(gòu)建過(guò)表達(dá)eNOS基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。成年雄性Wistar大鼠，采用左側(cè)頸總動(dòng)脈與頸外靜脈吻合法建立模型36只，分3組，即Shunt組、MSCs組和MSCs+eNOS組，每組12只；正常大鼠12只為Control組。由中心靜脈注入細(xì)胞，2周后測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌質(zhì)量變化及肺組織切片的病理變化，western blot及熒光定量PCR測(cè)定肺組織表達(dá)eNOS的變化。結(jié)果 細(xì)胞移植2周后肺組織中有eNOS表達(dá)；轉(zhuǎn)染eNOS組表達(dá)eNOS mRNA和蛋白明顯增加。MSCs組右心室收縮壓較分流組下降［（31.9±2.4）mm Hg比（35.6±3.9）mm Hg］，MSCs+eNOS組下降更明顯［（28.2±2.8）mm Hg比（35.6±3.9）mm Hg］（P＜0.05）。右心室肥厚指數(shù)分流組下降0.3411±0.0314，MSCs組下降0.3095±0.0231，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MSCs+eNOS組下降 0.2868± 0.0167，與MSCs組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MSCs組肺組織病理改變減輕，肺小動(dòng)脈中層變薄，而MSCs+eNOS組最明顯。結(jié)論 MSCs可定植于肺組織并表達(dá)eNOS；MSCs移植對(duì)高血流量的肺動(dòng)脈高壓發(fā)揮治療作用，聯(lián)合轉(zhuǎn)染eNOS進(jìn)一步增加治療效果。

分流性； 動(dòng)物模型； 肺動(dòng)脈高壓； 內(nèi)皮型一氧化氮合成酶

內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）最早從血管內(nèi)皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)和純化，故稱為內(nèi)皮型NOS。由eNOS催化生成的NO主要發(fā)揮以下作用：舒張血管平滑肌細(xì)胞抑制血小板聚集和吸附、細(xì)胞保護(hù)作用、抑制SMC增殖、促進(jìn)SMC凋亡等。Giaid等[1,2]證實(shí)，原發(fā)或繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）患者肺動(dòng)脈中層肥厚和內(nèi)膜纖維化的內(nèi)皮NOS表達(dá)明顯減少。Celemejer等[3]證實(shí)，發(fā)生PH前合并流量增加?jì)雰汉蛢和?，早期選擇性內(nèi)皮依賴的肺血管松弛的損害，提示早期NO的生物利用下降，因此我們考慮轉(zhuǎn)染eNOS基因治療PAH。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有高度可塑性，易于體外擴(kuò)增，因其來(lái)源充足、取材方便，體外增殖能力相對(duì)較強(qiáng)，而且在異體移植中排斥反應(yīng)小，被認(rèn)為是組織工程和基因工程的理想種子細(xì)胞。采用MSC作為種子細(xì)胞轉(zhuǎn)染eNOS基因，使細(xì)胞高度表達(dá)eNOS，移植肺動(dòng)脈高壓大鼠，從細(xì)胞和基因兩個(gè)角度治療肺動(dòng)脈高壓，可能會(huì)起到更好的治療效果。

本研究通過(guò)大鼠頸總動(dòng)脈與頸外靜脈吻合建立高肺血流量的肺動(dòng)脈高壓模型，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染eNOS，探討體內(nèi)移植對(duì)分流性肺動(dòng)脈高壓大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境 成年雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠48只，體重150～200 g，周齡6周，購(gòu)自沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（遼）2010-0001］，于沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，使用合格證號(hào)［SYXK（軍）2012-0003］，飼料及水由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，確保不含干擾本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的成分。

1.2 主要藥品試劑與儀器 NOS-3（eNOS）抗體（美國(guó)Santa公司），RT-PCR試劑盒（大連寶生物Takara公司），DNA擴(kuò)增儀（PT-200型，美國(guó)PE公司產(chǎn)品），熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystems公司GeneAmp730）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 過(guò)表達(dá)eNOS慢病毒載體（上海吉?jiǎng)P公司），基因信息：人類NOS3（NM_000603），即eNOS；GV358載體含有GFP標(biāo)記。慢病毒轉(zhuǎn)染eNOS到SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Cyagen公司）：細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)后，接種5×105個(gè)MSCs于6孔板中的2個(gè)孔，體積2 ml。使用ENi.S.稀釋病毒，滴度為1×108TU/ml。細(xì)胞更換培養(yǎng)液加入200 μl Polybrene（M）和200 μl稀釋后的病毒，感染時(shí)培養(yǎng)基終體積1 ml?；旌虾罄^續(xù)培養(yǎng)，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。感染3 d后，觀察熒光表達(dá)情況細(xì)胞生長(zhǎng)情況，如慢病毒感染成功細(xì)胞狀態(tài)良好，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第三代MSCs，以0.25%含EDTA的胰酶消化，PBS沖洗，1000個(gè)細(xì)胞/μl濃度以PBS懸浮，置于冰上直到進(jìn)行移植。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及細(xì)胞移植 采用左側(cè)頸總動(dòng)脈與左頸外靜脈吻合分流[4]建立高血流性肺動(dòng)脈高壓模型。12周后大鼠再次麻醉、固定，沿原頸部正中縱切口切開(kāi)，檢查原吻合口通暢的進(jìn)行分組。36只通暢的進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)分組，采用成組設(shè)計(jì)：Shunt組、MSCs組和MSCs+eNOS組，每組12只；同一批正常大鼠12只為Control組。通過(guò)游離的右側(cè)頸外靜脈進(jìn)行移植。Shunt組：注射1 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate balanced solution，PBS）；MSCs組：注射1 ml 1×106個(gè)MSCs；MSCs+eNOS組：注射1 ml含有1×106個(gè)轉(zhuǎn)染eNOS基因的MSCs；Control組：注射1 ml PBS。采用4-0滌綸線連續(xù)縫合頸部切口，待大鼠自然清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。檢查及取材：2周后再次全身麻醉，進(jìn)行各項(xiàng)檢查及取材。

1.3.3 MSCs肺組織定位 細(xì)胞移植2周后，處死MSCs+eNOS組大鼠時(shí)，取右肺上葉組織，在暗光下操作，采用OCT包埋，冰凍切片，厚2～3 μm，采用多聚甲醛固定，PBS沖洗3次，每次5 min，無(wú)菌的DAPI 50 mg/L復(fù)染組織細(xì)胞核5 min，PBS再次沖洗，甘油封片，避免氣泡產(chǎn)生，快速在熒光顯微鏡下觀察、照相觀察GFP表達(dá)。

1.3.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 右心微導(dǎo)管測(cè)右心室收縮壓（RVSP），壓力波形經(jīng)BL-420E系統(tǒng)記錄并保存。

1.3.5 病理學(xué)檢查 取大鼠的肺組織，置于10%中性甲醛液中固定，經(jīng)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色，光鏡顯微鏡觀察肺組織。分離心臟組織，測(cè)定右心室/（左心室+室間隔）質(zhì)量比。

1.3.6 Western blot檢測(cè) 提取肺組織蛋白：將凍存的肺組織取出后融化，加入適量含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，利用組織勻漿器制備成組織勻漿；4℃，12 000 rpm離心20 min，取組織總蛋白上清液轉(zhuǎn)移至另一新的EP管中，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

免疫印跡雜交（Western blot）：蛋白樣品加入相應(yīng)比例的SDS凝膠上樣緩沖液，變性5 min，電泳，電泳濃縮膠電壓90 V，分離膠110 V，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠的底部時(shí)停止電泳，轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，室溫封閉1 h，緩慢搖晃。加入特異性一抗4℃雜交過(guò)夜，次日用1×TBST洗膜3次（10 min/次），然后用1∶5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫緩慢搖晃雜交2 h。1×TBST洗膜3次（10 min/次）。一抗如下：GAPDH（Santa）和eNOS（Santa）。ECL（Bio-rad）發(fā)光，Western blot成像系統(tǒng)采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用±s表示，進(jìn)行兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞eNOS的表達(dá)

2.1.1 MSCs形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，極性較好，立體感一般，生長(zhǎng)速度較快，經(jīng)傳代5次后，細(xì)胞仍很有活力，以1∶3～1∶4的比例傳代，約48 h即可長(zhǎng)滿。細(xì)胞從第5代開(kāi)始生長(zhǎng)速度變慢，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)改變。細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶慢病毒后，可見(jiàn)細(xì)胞呈細(xì)胞漿綠色表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.1.2 MSCs在大鼠體內(nèi)示蹤 轉(zhuǎn)染GFP的MSCs頸外靜脈移植分流大鼠2周后，肺、心、肝和腎等重要組織冰凍切片，采用熒光顯微鏡觀察，未見(jiàn)心、肝和腎臟GFP表達(dá)，而肺臟中可見(jiàn)明顯綠色熒光表達(dá)，參入到肺組織中，說(shuō)明MSCs可在肺組織存活達(dá)2周并表達(dá)轉(zhuǎn)染基因。見(jiàn)圖2。

2.1.3 各組肺組織eNOS的表達(dá) 采用Western blot檢測(cè)大鼠肺組織中eNOS蛋白水平，Shunt組較Control組表達(dá)量降低，MSCs組與Shunt組相比有所增加，MSCs+eNOS組eNOS表達(dá)明顯增加，說(shuō)明轉(zhuǎn)染eNOS基因的MSCs移植2周后在大鼠肺組織中存活，而且有較高水平eNOS蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖3。

2.2 肺組織病理變化 光鏡下可見(jiàn)Shunt組大鼠的終末細(xì)支氣管旁肌性小肺動(dòng)脈中膜增厚、管腔狹窄，肺泡間質(zhì)增生、炎癥細(xì)胞增多；而MSCs組和MSCs+eNOS組肺小動(dòng)脈中膜增厚程度明顯減輕，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組肺動(dòng)脈管壁菲薄，內(nèi)皮細(xì)胞扁平連續(xù)，細(xì)胞分布均勻，大小厚薄較一致。

2.3 右心室收縮壓、心室體重比及右心室肥厚指數(shù)改變 細(xì)胞移植2周后，與Shunt組相比，MSCs組和MSCs+eNOS組的RVSP明顯下降，分別從（35.6±3.9）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）下降至（31.9±2.4）mm Hg和（28.2±2.8）mm Hg（P＜0.05）。說(shuō)明MSCs移植能明顯減輕高血流性肺動(dòng)脈高壓壓力，且MSCs+eNOS組和MSCs組之間差異顯著，轉(zhuǎn)染eNOS的MSCs能進(jìn)一步降低RVSP。細(xì)胞移植2周后心室體重比及右心室肥厚指數(shù)MSCs組和MSCs+eNOS組較分流組明顯下降，轉(zhuǎn)染eNOS基因未進(jìn)一步減輕雙心室的肥大。見(jiàn)圖4。

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是頑固性和致死性疾病，其主要特征是肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力進(jìn)行性升高，最終導(dǎo)致患者右心衰竭而死亡[5,6]。高流量誘導(dǎo)的肺高壓患者具有明顯的圍手術(shù)期死亡率和術(shù)后較低的長(zhǎng)期存活率[7]。干細(xì)胞移植治療的再生手段和基因治療等研究不斷應(yīng)用于PAH的治療，以打斷PAH的惡性循環(huán)。

移植細(xì)胞的標(biāo)記是研究其在體內(nèi)定位的常用方法。本實(shí)驗(yàn)觀察到攜帶GFP蛋白MSCs移植2周后顯示較強(qiáng)的發(fā)光，MSCs定植于肺泡或肺血管發(fā)揮作用。而在其他臟器如心、肝、腎臟均未見(jiàn)GFP熒光。這與Campbell等[8]的研究相似。因此認(rèn)為肺是天生的解剖濾器，由中心靜脈注射的懸浮細(xì)胞到達(dá)肺動(dòng)脈后難以通過(guò)肺微血管到達(dá)肺靜脈，從而匯到左心房、左心室而到達(dá)全身臟器，采用這種方法細(xì)胞以高度選擇方式到阻力前毛細(xì)血管床可以證明對(duì)治療某一肺動(dòng)脈血管疾病非常有用。

關(guān)于基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合干細(xì)胞治療嘗試治療慢性分流性肺動(dòng)脈高壓報(bào)道很少[9,10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠在左側(cè)頸總動(dòng)脈與頸外靜脈吻合后12周高血流明顯增加了RVSP，肺血管改變大多為可逆性病變，MSCs單純移植及聯(lián)合eNOS轉(zhuǎn)染MSCs移植該模型2周后均能夠降低RVSP，改善肺組織小動(dòng)脈內(nèi)膜及中層厚度，增殖減緩，抑制了肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展，具有明顯的肺組織重構(gòu)作用，轉(zhuǎn)染eNOS基因治療效果更明顯。分流組心室重量體重比和右心肥厚指數(shù)增加明顯，MSCs移植后兩指標(biāo)明顯下降，說(shuō)明MSCs移植能明顯減輕高肺血流的心臟肥大。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示轉(zhuǎn)染eNOS基因較單純MSCs未見(jiàn)進(jìn)一步減輕心室的肥大和右心室肥厚，可能肺小動(dòng)脈的改變可很快降低肺動(dòng)脈后負(fù)荷，但還未來(lái)得及出現(xiàn)顯著的右心室肥厚減輕，或許需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能表現(xiàn)出來(lái)或需要增加樣本量才有意義。

（本文圖片見(jiàn)后插四）

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Effects of implantation of mesenchymal stem cells over-expressing endothelial nitric oxide synthase on pulmonary arterial hypertension of high blood flow in rat models

ZHAO Ke-yan＊，GUO Xiao-dong，LI Hong-yan，et al.＊Department of Cardiovascular Surgery，General Hospital of Shenyang Military District，Shenyang 110840，China Corresponding author：HOU Ming-xiao，E-mail：houmx188@163.com

Objective To observe effects of MSCs over-expressing eNOS on PAH rats of high flow blood.MethodsLentivirus expressing eNOS gene were constructed and transfected to MSCs to be transplanted.Adult male Sprague Dawley rats，with anastomosis of the left common carotid artery and left external jugular vein，were randomly divided into three groups:group shunt，group MSCs and group MSCs+eNOS（n=12，respectively）.The control group was matched normal rat.MSCs or equal volume PBS were injected through right external jugular vein. Two weeks later，hemodynamic index，pathological changes of myocardial tissue and lung biopsy were determined. Fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR）and Westernblot were used to determine the level of mRNA and protein of eNOS were determined.ResultsENOS can be detected in rat lungs after cell transplantation.And there were high eNOS protein expression in group MSCs+eNOS，but poor in the other three groups.The RVSP decreased from（35.6±3.9）mm Hg in the group shunt to（31.9±2.4）mm Hg in the group MSCs and to（28.2±2.8）mm Hg（P＜0.05）in the group MSCs+eNOS（P＜0.05）.Right ventricular hypertrophy index significantly reduced from 0.3411± 0.0314 in the group shunt to 0.3095±0.0231 in the group MSCs and to 0.2868±0.0167 in the group MSCs+eNOS（P＜0.05 respectively），but there was no statistical significance between the latter groups.RVSP and lung′s lesions were attenuated and pulmonary medium wall was thinner in group MSCs，while these were thinnest in group MSCs+eNOS.ConclusionMSCs can locate in rat lungs and express eNOS after cell transplantation.MSCs transplantation has therapeutic effects on PAH of high blood flow and ransfected eNOS can further improve the effects.

Shunt； Animal model； Pulmonary artery hypertension； eNOS

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.07.023

Q95-33；R544.1+6

A

1672-5301（2017）07-0667-04

2017-02-15）

遼寧省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2015010421-301）

110840 遼寧省沈陽(yáng)市，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科（趙科研、郭曉東、李紅巖、王輝山），全軍重戰(zhàn)創(chuàng)傷中心實(shí)驗(yàn)室（佟昌慈、張玉彪、侯明曉）

侯明曉，E-mail：houmx188@163.com