盛長城 謝娟 熊世娟 王清忱 張玲敏 李龍寬 沈祥春

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴州 貴陽 550002； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，貴州 貴陽 550004)

反相-高效液相色譜法測定人血清中萬古霉素濃度

盛長城1,2謝娟2熊世娟2王清忱2張玲敏3李龍寬3沈祥春1△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴州 貴陽 550002； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，貴州 貴陽 550004)

萬古霉素； 治療藥物監(jiān)測； 反相-高效液相色譜法

萬古霉素是三環(huán)糖肽類抗生素，對革蘭氏陽性菌有強(qiáng)大殺菌作用，是治療耐藥革蘭陽性菌特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)所致重癥感染的首選藥物。萬古霉素治療窗窄，谷濃度<10 mg/L時易增加誘導(dǎo)耐藥風(fēng)險，導(dǎo)致治療失敗[1-2]，而谷濃度>20 mg/L時腎損害發(fā)生率顯著增加[3]。國內(nèi)外文獻(xiàn)[4-5]均推薦維持萬古霉素穩(wěn)態(tài)血清谷濃度>10 mg/L，針對MRSA所引起的血流感染、心內(nèi)膜炎及腦膜炎等，應(yīng)維持穩(wěn)態(tài)血清谷濃度在15～20 mg/L。因此，結(jié)合患者病理生理情況進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，指導(dǎo)劑量調(diào)整，實施個體化治療就尤為重要。目前臨床上用于萬古霉素血藥濃度監(jiān)測的方法主要有熒光偏振免疫(FPIA)法、微生物法和高效液相色譜(HPLC)法。FPIA法所需儀器成本和試劑盒價格較昂貴，需集中標(biāo)本后進(jìn)行檢測，不能完全滿足臨床即時檢測的需求，且其檢測結(jié)果偏高[6]，在慢性腎功能不全和血透患者中偏高尤為明顯[7]，而微生物法則易受合并使用抗生素的影響，其臨床應(yīng)用受到一定限制。筆者查閱文獻(xiàn)[8-12]，結(jié)合實驗室自身條件，建立了一種簡單、快捷的反相-高效液相色譜(RP-HPLC)法，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀(美國Aglient公司)；TG16-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；XH-B旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；PHS-3C pH計(上海理達(dá)儀器廠)；DW-86L338超低溫冰箱(Haier)。萬古霉素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號130360-201302)；替硝唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號100336-200703)；甲醇、乙腈為色譜純，Mreda Technology Inc生產(chǎn)；磷酸二氫鉀、高氯酸、磷酸均為分析純；水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液=10∶3∶87；流速:1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。在該色譜條件下，萬古霉素與內(nèi)標(biāo)替硝唑分離完全，血中內(nèi)源性物質(zhì)對測定結(jié)果無干擾，見圖1。

(a) 空白血清

(b) 空白血清+萬古霉素對照品+內(nèi)標(biāo)

(c) 血清樣品+內(nèi)標(biāo)圖1 萬古霉素色譜圖(1：內(nèi)標(biāo)，2：萬古霉素)

2.2 溶液配制

2.2.1 流動相 稱取磷酸二氫鉀3.402 5 g，加入雙蒸水至1 000 mL使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.1，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得0.025 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液。

2.2.2 沉淀劑 將乙腈和6% 高氯酸以1∶6的比例混合即得。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取75.0 mg替硝唑于50 mL容量瓶中，用雙蒸水溶解并稀釋至刻度，即得1.5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，密封，4 ℃避光保存。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液 精密稱取64.0 mg萬古霉素對照品于50 mL容量瓶中，用0.025 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 280 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密量取該貯備液適量，逐級稀釋成濃度為640、320、160、80、40、20、10 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，密封，4 ℃避光保存。

2.3 血清樣品預(yù)處理

取血清樣品300 μL于1.5 mL EP管中，加入1.5 mg/mL替硝唑30 μL，渦旋混勻1 min，再加入沉淀劑300 μL，渦旋混勻3 min，16 000r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，自動進(jìn)樣20 μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取空白血清270 μL于1.5 mL EP管中，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液30 μL，配制成濃度為64、32、16、8、4、2、1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)血樣。按“2.3”項處理后進(jìn)樣測定，以樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.092 6X+0.004 6(r=0.999 8，n=7)，表明萬古霉素血清濃度在1.0～64.0 mg/L內(nèi)線性良好。以S/N≥3計算，萬古霉素的最低檢測濃度為0.4 mg/L。

2.5 回收率試驗

配制含萬古霉素64、8、1 mg/L的血清樣品各6份，按“2.3”項處理后進(jìn)樣測定，記錄萬古霉素峰面積(AX)，計算實測濃度與理論濃度的比值即得相對回收率；另在同樣條件下進(jìn)行相應(yīng)濃度的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄峰面積(AS)，計算相應(yīng)的峰面積比(AX/AS)即得提取回收率。結(jié)果見表1。

理論濃度/(mg/L)實測濃度/(mg/L)相對回收率/%RSD/%提取回收率/%RSD/%6468．157±1．213106．496±1．8961．78090．216±2．4762．74488．053±0．370100．663±4．6294．59893．223±4．4204．74211．045±0．094104．520±9．4189．01194．578±6．1966．551

2.6 精密度試驗

配制含萬古霉素64、8、1 mg/L的血清樣品，按“2.3”項處理后進(jìn)樣測定，每日平行操作6次，連續(xù)3 d，計算日內(nèi)與日間精密度。結(jié)果見表2。

理論濃度/(mg/L)實測濃度/(mg/L)日內(nèi)RSD/%日間RSD/%6467．178±2．4783．2885．87888．130±0．3143．6964．90311．023±0．0656．5734．646

2.7 穩(wěn)定性試驗

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液穩(wěn)定性 以磷酸二氫鉀緩沖液代替空白血清和沉淀劑，配制含萬古霉素64、8、1 mg/L的樣品各5份，按“2.3”項處理，4 ℃避光保存。分別于0時、7 d、15 d進(jìn)樣測定，記錄萬古霉素與內(nèi)標(biāo)峰面積比(AVan/AIS)。結(jié)果見表3。

時間64mg/LAVan/AISRSD/%8mg/LAVan/AISRSD/%1mg/LAVan/AIS RSD/%0時8．662±0．5836．7260．933±0．0091．0120．114±0．0054．7947d8．280±0．6357．6710．898±0．0202．2280．109±0．0032．67515d8．880±0．4424．9750．906±0．0414．5210．110±0．0087．009

2.7.2 含藥血清樣品穩(wěn)定性 配制含萬古霉素64、8、1 mg/L的血清樣品，分別于0時、室溫24 h、4 ℃冷藏7 d、4 ℃冷藏15 d、-20 ℃冷凍1個月、-20 ℃凍融3次、-80 ℃凍融3次，按“2.3”項處理后進(jìn)樣測定。結(jié)果見表4。

時間64mg/L實測濃度/(mg/L)RSD/%8mg/L實測濃度/(mg/L)RSD/%1mg/L實測濃度/(mg/L) RSD/%0時67．377±1．1271．6728．368±0．1842．2001．093±0．0575．193室溫24h66．518±1．0221．5378．171±0．2533．0911．045±0．0706．6704℃冷藏7d66．335±0．3640．5488．199±0．5857．1291．089±0．0615．6014℃冷藏15d65．292±0．5140．7878．373±0．1421．6911．085±0．1029．439-20℃冷凍1個月66．504±1．1601．7458．233±0．2102．5511．054±0．0423．978-20℃凍融3次65．623±0．9751．4858．173±0．2893．5331．072±0．0847．795-80℃凍融3次67．108±0．6560．9788．149±0．5206．3861．100±0．1089．793

3 討 論

經(jīng)多種流動相實驗，本法最終選擇了甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀，乙腈有助于改善二者的分離，而甲醇可改善峰形。且三者比例對萬古霉素保留時間影響很大，將其比例調(diào)整為10∶3∶87時，內(nèi)源性雜質(zhì)、內(nèi)標(biāo)與萬古霉素分離完全，峰形較好。如增加水相比例，萬古霉素出峰時間明顯延長，峰形變差；如增加有機(jī)相比例，雖然萬古霉素出峰時間大幅提前，但內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾也加大。

在內(nèi)標(biāo)選擇上，文獻(xiàn)報道較多的是去甲萬古霉素，但萬古霉素與去甲萬古霉素均由發(fā)酵法制備，在萬古霉素中含有少量去甲萬古霉素，去甲萬古霉素中亦含有少量萬古霉素，因此在低濃度時測量誤差較大。筆者亦曾嘗試以紅霉素、維生素B12、頭孢呋辛、2-甲基-5-硝基咪唑為內(nèi)標(biāo)，分離效果均不甚理想。經(jīng)反復(fù)實驗，最終選擇以替硝唑為內(nèi)標(biāo)，回收穩(wěn)定，色譜峰峰形好，與萬古霉素及內(nèi)源性雜質(zhì)分離完全。

在血清樣品處理方法上，文獻(xiàn)報道有蛋白沉淀后液-液提取法[12]、蛋白沉淀后直接進(jìn)樣法[7]和固相萃取法[11]，以蛋白沉淀后直接進(jìn)樣法最為簡單、快捷。筆者考察了5%硫酸鋅、10%硫酸鋅、20%硫酸鋅、30%硫酸鋅、甲醇、20%高氯酸、乙腈-6%高氯酸(1∶6)等常用沉淀劑，單從外觀上看，均可達(dá)到理想的凈化效果。與文獻(xiàn)[13]報道不同的是，各種比例硫酸鋅的提取回收率均在40%～60%，甲醇的提取回收率僅為30%，未達(dá)到相關(guān)分析要求；20%高氯酸的提取回收率在65%左右，但基線不平，考慮與萬古霉素被高氯酸降解破壞所致；乙腈-6%高氯酸(1∶6)的提取回收率可達(dá)90%，基線平坦。

綜上所述，本實驗所建立的分析方法快速、簡捷、靈敏度高，經(jīng)考察準(zhǔn)確度和精密度良好，可用于人血清中萬古霉素濃度測定，滿足臨床開展治療藥物監(jiān)測和進(jìn)行群體藥動學(xué)研究的需要。

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1000-744X(2016)04-0372-03

2015-12-03)

△通信作者,E-mail：shenxiangchun@126.com