魏金鳳,張亞嫻，王學(xué)標，田苗新，張賽賽，康文

1. 河南大學(xué) 民生學(xué)院，河南 開封 475004； 2. 河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開封 475004； 3. 開封市保健食品功效成分研究重點實驗室，河南 開封 475004

三種果蔬褐變機制及其防止初探

1. 河南大學(xué) 民生學(xué)院，河南 開封 475004； 2. 河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開封 475004； 3. 開封市保健食品功效成分研究重點實驗室，河南 開封 475004

〔目的〕 探討果蔬酶促褐變的最佳條件及主要影響因素?！卜椒ā?以新鮮蓮藕、馬鈴薯為研究對象，分析多酚氧化酶的活性大小。〔結(jié)果〕 以鄰苯二酚作為底物時，最適溫度為 35 ℃、pH值為7.0、底物濃度0.09 mol/L 及最佳抑制劑組合為亞硫酸鈉(Na2SO3)濃度0.10% 、EDTA 濃度0.25%、檸檬酸濃度0.20% 、抗壞血酸(Vc)濃度0.20% 。以梨汁為研究對象，探究其在加工和貯存過程中褐變度的變化及影響梨汁非酶褐變的主要因素。〔結(jié)論〕結(jié)果表明，影響其非酶褐變的主要因素有：金屬離子(Mg2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+)、pH值、貯藏溫度等。此外，吸附劑的使用也可起到一定的抑制作用。

酶促褐變；非酶促褐變；抑制；影響因素

褐變是食品加工、貯藏過程中普遍存在的一種變色現(xiàn)象，尤其是當(dāng)新鮮果蔬發(fā)生機械性損傷(如切割、蟲咬、削皮、壓傷等)及處于異常的環(huán)境下(如過冷、過熱等)時，會發(fā)生氧化產(chǎn)物的積累，從而造成變色。通常，褐變按其機制分為酶促褐變和非酶促褐變。酶促褐變是指在酚酶的催化下，酚類物質(zhì)被氧化為醌及其聚合物的反應(yīng)過程。植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)種類多、含量豐富，在無損傷細胞中作為呼吸傳遞物質(zhì)，若細胞組織遭到破壞，氧氣會大量侵入，從而打破酚-醌之間的動態(tài)平衡，發(fā)生醌的積累。醌還可進一步聚合成黑色物質(zhì)，導(dǎo)致果蔬發(fā)生褐變。在果汁的加工過程中，只要熱燙徹底，即可抑制酶促褐變對果汁色澤的影響。然而，非酶褐變產(chǎn)生的深色物質(zhì)影響果汁的色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)價值，且反應(yīng)復(fù)雜。影響梨汁非酶褐變的主要機制是美拉德反應(yīng)[1]。

常用的控制酶促褐變的方法主要有：①使用抑制劑、高溫?zé)釥C等方法使酚酶活性下降；②隔離氧氣；③通過改變溫度、pH值等改變酚酶的作用條件；④使用SO2、抗壞血酸等抗氧化劑。非酶褐變反應(yīng)的影響因素很多，主要有pH值、溫度、氧氣、金屬離子等，通過改變這些條件可有效控制非酶褐變的發(fā)生。

新鮮果蔬在加工和貯藏過程中，很容易腐爛變質(zhì)。深入研究新鮮果蔬褐變相關(guān)的生理生化機制，從理論上認識組織褐變，找到影響褐變的因素和抑制褐變的有效方法，對解決新鮮果蔬產(chǎn)品加工、貯藏過程中的褐變問題，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。多數(shù)果蔬的褐變都是以酶促褐變?yōu)橹?，但果蔬汁的加工也難免受到非酶褐變的影響。探究果蔬褐變的機理及其影響因素，以期更有效地防止褐變的發(fā)生，對于延長食品的貨架期具有現(xiàn)實意義。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

材料：新鮮馬鈴薯，蓮藕，梨(2～4 ℃保存)。

試劑：鄰苯二酚，亞硫酸鈉(Na2SO3)，檸檬酸，抗壞血酸(Vc)，EDTA，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，氯化鐵，硫酸銅，氯化錫，氯化鎂。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計，離心機，恒溫水浴鍋，榨汁機，pHS-3C型精密pH計，電子分析天平。

1.3 酶促褐變及防止研究方法

1.3.1 制備PPO粗酶液(多酚氧化酶) 將新鮮馬鈴薯、蓮藕洗凈、晾干，去除果皮。準確稱取樣品各10 g，切碎后放入盛有25 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)的研缽中，研磨2 min；3 000 r/min離心10 min；取上清液，即為粗酶液。

1.3.2 測定PPO酶活性 各取0.5 mL粗酶液，分別加入1.0 mL濃度為0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液、1.0 mL pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液；混勻后于420 nm波長下測定吸光度。

1.3.3 pH值對PPO酶活性的影響 配置不同pH值(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)的磷酸鹽緩沖液；各取2 mL，加入粗酶液1.0 mL；混勻后于420 nm波長下測定吸光度。

1.3.4 溫度對PPO酶活性的影響 各取7支試管，均加入1.0 mL pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液和1.0 mL 0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液；混勻后，分別在20～50 ℃ (每個間隔 5 ℃)下保溫 10 min；然后，各加入1.0 mL PPO粗酶液，于420 nm波長下測定吸光度。

1.3.5 底物濃度對PPO 酶活性的影響 分別配置濃度為0.01 mol /L、0.02 mol /L、0.03 mol /L、0.04 mol /L、0.05 mol /L、0.06 mol /L、0.07 mol /L、0.08 mol /L、0.09 mol /L、0.10 mol /L 的鄰苯二酚溶液，作為底物，于420 nm波長下測定吸光度。

1.3.6 復(fù)合抑制劑對PPO酶活性的影響 取樣品3 g，加入相同質(zhì)量體積的9種復(fù)合抑制劑(EDTA、檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉組合，見表1)；浸泡30 min后，按照測PPO活性的步驟測定吸光度。

抑制效果=(1-吸光度)×100%[2]。

表1 復(fù)合抑制劑組合(質(zhì)量分數(shù)/%)

1.4 非酶褐變的影響因素及其控制方法

1.4.1 試驗方法 新鮮成熟的梨清洗去皮、去核，榨汁后進行滅酶、過濾，然后添加影響非酶褐變的物質(zhì)進行殺菌貯藏；定期在420 nm波長下測定其吸光度。

1.4.2 多酚氧化酶的鈍化 將榨好的梨汁置于85 ℃水浴鍋中，保持3 min。

1.4.3 褐變度的測定 在420 nm波長下測定樣品吸光度值。

1.4.4 不同條件對非酶褐變反應(yīng)的影響 ①吸附劑：50 mL梨汁中加入活性炭(5 g/100 mL)，50 ℃下保溫1 h；每20 min攪拌一次，靜置10 min，過濾、包裝、殺菌(93℃左右，1 min)，于40 ℃下貯藏。測定吸光度，1次/d，共5 d。

②pH值：加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5；包裝殺菌后，40 ℃下貯藏。測定吸光度值，1次/d，共5 d。

③金屬離子：30 mL梨汁中分別加入100 μg/mL的金屬離子Cu2+、Mg2+、Sn2+、Fe3+，包裝殺菌后40 ℃下貯藏。測定吸光度，1次/d，共5 d。

④貯藏溫度: 30 mL梨汁(自然pH值)分別放置于4 ℃、25 ℃(室溫)、40℃條件下貯藏。測定吸光度，1次/d，共5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶促褐變反應(yīng)影響因素的探究

2.1.1 PPO活性的測定 由表2可知，馬鈴薯的PPO活性高于蓮藕，說明相同條件下，馬鈴薯比連藕更易發(fā)生褐變。

表2 樣品吸光度的測定結(jié)果

2.1.2 不同溫度對樣品PPO活性的影響 如圖1所示，樣品中PPO活性呈先上升后下降的趨勢，在35 ℃時達到最大。溫度過高或過低，PPO活性均較低。溫度過高易使蛋白質(zhì)變性，降低果蔬的營養(yǎng)價值；溫度過低抑制蛋白質(zhì)活性；溫度為35 ℃時，酶活性達到最大，褐變度最高。因此，可采用低溫貯藏抑制酶促褐變。

圖1 不同溫度下樣品PPO活性的變化

2.1.3 不同pH值對樣品PPO活性的影響 由圖2可知：pH=7.0時，兩樣品PPO的活性最大，即其最適pH值為7.0；pH<5.5或pH>8.0時，PPO活性明顯下降。強堿條件下，多酚氧化酶(酚酶的系統(tǒng)名稱是鄰二酚，以Cu2+為輔基，必須以氧為受氫體)(PPO)中的銅會解離生成 Cu(OH)2，從而使酶活性降低。在pH<5.5的酸性條件下，PPO中的Cu2+被解離出來，酶失活[2]。因此，調(diào)節(jié)pH值可有效抑制PPO活性大小。

圖2 不同pH值下樣品PPO活性的變化

2.1.4 底物濃度對樣品PPO活性的影響 如圖3所示，酶促褐變反應(yīng)速率隨底物濃度(以鄰苯二酚為底物)的增加而增大，直至底物濃度增加到0.09 mol/L時，酶促反應(yīng)速率趨于平穩(wěn)。由此得出，樣品PPO活性在最適反應(yīng)底物(以鄰苯二酚為底物)濃度時，其褐變度也最大。

圖3 不同物低濃度下樣品PPO活性的變化

2.1.5 復(fù)合抑制劑對樣品PPO活性的影響 如表3所示，抑制酶促褐變的最佳組合為表1中的4號組合，即質(zhì)量分數(shù)為0.10%的亞硫酸鈉(Na2SO3)、質(zhì)量分數(shù)為0.20%的EDTA 、質(zhì)量分數(shù)為0.20%的檸檬酸、質(zhì)量分數(shù)為0.20%的抗壞血酸(Vc)。相對于馬鈴薯，抑制劑對于蓮藕的抑制效果更佳。所以在果蔬貯藏期間，可使用一定濃度的抑制劑延長褐變時間。

2.2 非酶促褐變反應(yīng)影響因素的探究

2.2.1 吸附劑的使用 采用去除與未去除色素、雜質(zhì)的梨汁進行對比分析，二者殺菌后40℃下貯藏，褐變程度隨時間的變化結(jié)果如圖4?？煽闯觯砑踊钚蕴康睦嬷暮肿兌刃∮谖刺砑踊钚蕴康睦嬷?。含有色素及雜質(zhì)的梨汁，隨時間延長，褐變度增幅較大。由此知，色素及雜質(zhì)的存在是導(dǎo)致梨汁非酶褐變的因素之一。

表3 復(fù)合抑制劑實驗效果

圖4 吸附劑對梨汁非酶褐變的影響

2.2.2 添加金屬離子 在梨汁中添加金屬離子Cu2+、Mg2+、Sn2+、Fe3+，于40 ℃條件下存放一周。每天測定一次褐變度，比較未添加金屬離子的梨汁與添加金屬離子的梨汁的褐變度隨時間的變化，結(jié)果見圖5。從圖5可知，不同的金屬離子對梨汁的非酶褐變的影響有所不同：Sn2+抑制非酶褐變反應(yīng)，Mg2+對非酶褐變反應(yīng)幾乎無影響，而Cu2+、Fe3+可促進非酶褐變的發(fā)生。所以，選擇性添加金屬離子可有效抑制非酶褐變。

圖5 金屬離子對梨汁非酶褐變的影響

2.2.3 pH值 采用檸檬酸調(diào)節(jié)酸度后的梨汁(pH=3.0，3.5，4.0，4.5)與未調(diào)節(jié)酸度的進行比較，結(jié)果見圖6。由圖6可知, 未調(diào)節(jié)pH值的樣品的褐變度大于添加檸檬酸調(diào)節(jié)后的梨汁，且褐變度與pH值呈正相關(guān)。因此，可通過降低梨汁的pH值控制非酶褐變的程度。

圖6 pH值對梨汁非酶褐變的影響

2.2.4 貯藏溫度 分別將自然pH值的梨汁放置于4℃、25℃(室溫)、40℃條件下貯藏。比較不同貯藏溫度下梨汁的褐變度，結(jié)果見圖7。表明，貯藏溫度越高，梨汁的褐變度增加越快。由此可見，低溫貯藏有益于抑制梨汁的非酶褐變。

圖7 貯藏溫度對梨汁非酶褐變的影響

3 討論

3.1 果蔬酶促褐變的研究

本試驗以新鮮蓮藕、馬鈴薯為研究對象，酶促褐變最適溫度35 ℃、pH值7.0，最適底物濃度(以鄰苯二酚作為底物)0.09 mol/L等。這些結(jié)果與方蘭蘭等人[2-7]的研究基本一致，但復(fù)合抑制劑抑制效果有些許差異，這可能與試驗條件、材料品種、季節(jié)等有關(guān)。

3.2 梨汁非酶促褐變的研究

梨汁非酶褐變的影響因素中，本課題針對溫度、pH值、金屬離子的研究結(jié)果與黃卉等人[8-9]的結(jié)果大致相同。因活性炭具有芳香環(huán)式結(jié)構(gòu)，有較大的比表面積，表面自由能相對較高，能有效吸附雜質(zhì)、色素等，故本試驗使用活性炭去除梨汁中的色素和雜質(zhì)。后續(xù)試驗中將對活性炭吸附高溫鈍化的酚酶、色素的方法以消除非酶褐變的影響進行研究，同時考察不同添加量對于去除效果的影響。

4 結(jié)論

4.1 控制果蔬酶促褐變的主要措施

酶促反應(yīng)是引起果蔬褐變的主要原因?？蓮囊韵路矫婵刂泼复俸肿儯旱蜏刭A藏；改變pH值；添加一定量的抑制劑。

4.2 控制梨汁非酶褐變的主要措施

由試驗得到影響梨汁非酶褐變的影響因素可知，控制梨汁非酶褐變方法：去除梨汁中的色素和雜質(zhì)；降低梨汁的pH值；添加適當(dāng)?shù)慕饘匐x子和降低貯藏溫度等方法來控制非酶褐變。但綜合梨汁的感官評定, 梨汁的pH值控制在3.5～4.0可增加其口感。果汁加工過程中應(yīng)盡量避免與含有Fe3+、Cu2+的容器接觸。

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[責(zé)任編輯 李麥產(chǎn)]

A Study on the Mechanism and Prevention of Browning of Three Fruits and Vegetables

1. Minsheng College, Henan University, Kaifeng 475004, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, Henan University, Kaifeng 475004, China; 3. Kaifeng Key Laboratory of Functional Components in Health Food, Kaifeng 475004, China

〔Objective〕 By analyzing the activity of polyphenol oxidase in fresh lotus root and potato, we investigated the most appropriate conditions and the main influence factors of enzymatic browning of fruit.〔Methods〕In this experiment, fresh lotus root, potato, ripe pear were used as material for exploring the different mechanisms of fruits browning.〔Results〕Catechol was used as a substrate of and was treated with 35 ℃, pH 7.0, substrate concentration 0.09 mol/L inhibitor and the best combination of sodium sulfite (Na2SO3) concentration of 0.10%, EDTA concentration of 0.25%, lemon acid concentration of 0.20%, ascorbic acid (Vc) concentration of 0.20%. Pear juice was also used as another research object forexploring the main influencing factors of enzymatic browning and non-enzymatic browning during processing and storage.〔Conclusion〕 The results showed that the main influencing factors of the non-enzymatic browning of pear are composed of metal ions (Mg2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+), pH, storage temperature, etc. In addition, the adsorbent may also play a certain role on non-enzymatic browning.

enzymatic browning; non-enzymatic browning; inhibition; influence factors

1672-7606(2016)04-0240-04

2016-10-23

2016年度河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊，藥食兩用資源研究開發(fā)(16IRTSTHN019)；河南省科技廳基礎(chǔ)前沿計劃(142300410123, 152300410064)；開封市創(chuàng)新人才項目(1509010)；河南大學(xué)民生學(xué)院教育教學(xué)改革研究項目(MSJG2015007，MSJG2015040)；河南大學(xué)民生學(xué)院2016年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(MSJG2016042)。

魏金鳳(1975-)，女，副教授，博士，從事藥用植物活性成分研究工作。

康文藝(1971-)，男，黑龍江人，教授，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究工作。

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