■劉 燕張宏福孫 哲 楊 琳 王瑞軍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣東廣州510642；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

纖維素酶是將纖維素水解成葡萄糖的一組酶的總稱，試驗(yàn)證明，完全降解纖維素至少需要三類酶系：內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(BG)。木質(zhì)纖維素中的纖維素主要以結(jié)晶狀態(tài)存在，其中CBH是纖維素水解酶系中唯一可以作用于結(jié)晶纖維素的酶組分，因而CBH在木質(zhì)纖維素水解中的作用相當(dāng)重要[1]。

絲狀真菌木霉屬可產(chǎn)生大量纖維素酶，酶系完全，分泌性較好。目前國內(nèi)外研究較多的是里氏木霉，纖維素酶的各個(gè)組分在不同程度上已得到克隆，并且有些基因已在大腸桿菌和酵母中得到了表達(dá)[2]。但關(guān)于康寧木霉研究較少(Thomas，1988)[3]；同時(shí)大部分分子生物學(xué)工作中，常以抗性基因作為克隆篩選的標(biāo)記，這使得在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中應(yīng)用的菌株，因可能含有位于質(zhì)粒上的抗性基因，而造成耐藥性，增加了耐藥性基因向環(huán)境傳播的可能性[4]。因此，構(gòu)建飼料級(jí)可食性的非抗生素抗性標(biāo)記的纖維素酶基因重組菌成為重要的研究方向之一。

本研究將康寧木霉AS3.2774纖維素酶CBHⅡ基因進(jìn)行克隆和測序，與非抗生素抗性的、以thyA基因?yàn)檫x擇標(biāo)記的、可在乳酸菌和大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的載體pW425t[5]進(jìn)行重組，并轉(zhuǎn)化入thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coliX13中進(jìn)行表達(dá)，為下一步pW425t-CBHⅡ在基因缺陷型的乳酸菌受體菌株中表達(dá)提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

康寧木霉AS3.2774、大腸桿菌DH5a分別購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所及Tiangen公司；克隆載體pMD18-T Simple Vector購自Takara公司；thyA基因缺陷型受體菌E.coliX13及表達(dá)載體pW425t均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA、Mendals基本培養(yǎng)基用于康寧木霉的培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基，根據(jù)需要加入終濃度為100 μg/ml的氨芐青霉素或50 μg/ml的胸腺嘧啶核苷酸。

1.1.3 主要試劑

植物RNA快速提取試劑盒為普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品；AMV Reverse Transcriptase XL、Ex Taq HS、Agarose Gel DNA Purification Kit、DNase I、SmaI、SphI、T4DNA ligase均為TaKaRa產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白質(zhì)Marker、DNA Marker為Tiangen產(chǎn)品；DL-蘇氨酸、剛果紅、胸腺嘧啶核苷酸、對(duì)硝基酚-β-D-纖維二糖苷（p-NPC）為Sigma產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 康寧木霉AS3.2774菌絲體的制備

挑取PDA平板培養(yǎng)基上一菌環(huán)孢子，接于250 ml三角燒瓶中的50 ml Mendels基本培養(yǎng)基，200 r/min、30 ℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d，4 000 r/min、10 min離心收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 康寧木霉總RNA提取及引物設(shè)計(jì)

采用植物總RNA快速提取試劑盒提取總RNA，操作按照說明書進(jìn)行，為防止DNA的污染，并用DN?ase I 37℃處理30 min，然后再純化總RNA。根據(jù)Gene Bank中康寧木霉AS3.2774 CBHⅡ (DQ504304)的基因序列設(shè)計(jì)引物由上海生工公司合成。P1：5’-ATACCCGGGATG ATT GTC GGC ATT CTCACC-3’；P2：5’-TCGGCATGCTTA CAG GAA CGA TGG GTT TGC-3’(斜體部分別為SmaI、SphI酶切位點(diǎn))。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增CBHⅡ基因

P1、P2為引物，總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增CBHⅡ基因。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：取6 μl mRNA，1 μl Oligodt，65 ℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻2 min，再依次加入MgCl24 μl，10×RT Buffer 2 μl，RNase Free dH2O 3 μl，dNTP Mixture(各 10 mM)1 μl，RNase Inhibitor 1 μl，AMV Reverse Transcriptase 1 μl?；靹蚍磻?yīng)液，42℃，1 h。

PCR反應(yīng)體系(25 μl)及反應(yīng)條件：5×PCR Buffer 5 μl，滅菌蒸餾水 13.75 μl，TaKaRa Ex TaqTM 0.25 μl，P1 0.5 μl，P2 0.5 μl，CDNA 2 μl，dNTP 3 μl。95 ℃5 min，預(yù)變性；94 ℃ 45 s，變性；53 ℃ 45 s，退火；72 ℃ 90 s，延伸，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，延伸。

1.2.4 CBHⅡ基因的克隆

通過DNA快速純化/回收試劑盒得到目的片段CBHⅡ，將其連接于pMD18-T Simple Vector中，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，在含有X-Gal和IPTG的LB+Amp瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過夜。通過藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒大小、酶切鑒定及PCR鑒定證明重組克隆pMD18-T-CBHⅡ的獲得及其正確性，最后將重組克隆菌送至北京奧科生物技術(shù)公司測序，DNAMAN軟件分析。

1.2.5 pW425t-CBHⅡ重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用SmaI和SphI雙酶切表達(dá)載體pW425t和重組質(zhì)粒pMD18-T-CBHⅡ，膠回收，利用T4DNA連接酶將CBHⅡ片段連接至pW425t的SmaI和SphI多克隆位點(diǎn)之間，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliX13中，在普通的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)酶切分析、PCR鑒定及生長功能彌補(bǔ)篩選，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t-CBHⅡ。thyA基因缺陷的E.coliX13必須在加有外源胸腺嘧啶核苷(50 μg/ml)的LB培養(yǎng)基上恢復(fù)生長。

1.2.6 CBHⅡ基因在大腸桿菌中的表達(dá)

在普通LB液體培養(yǎng)基(未添加胸腺嘧啶核苷)中接種含有pW425t-CBHⅡ重組質(zhì)粒的陽性菌株，200 r/min、37℃過夜培養(yǎng)。取2 ml上述菌液接種于100 mlLB中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8間，加入40 mmol/l DL-蘇氨酸。每1 h取一次菌液，直到5 h，含空載體pW425t的E.coliX13以同樣方法誘導(dǎo)作對(duì)照。

1.2.7 SDS-PAGE分析

對(duì)每一時(shí)間誘導(dǎo)得到的菌液統(tǒng)一調(diào)OD600值為0.7，分別取菌液1.0 ml，4℃離心收集菌體，用生理鹽水洗滌2次，加入80 μl去離子水到沉淀菌體中，再加20 μl 5×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min在沸水中，離心10 min、15 000 r/min，參照分子克隆中SDSPAGE方法取上清液10 μl進(jìn)行電泳。

1.2.8 重組pW425t-CBHⅡ大腸桿菌中CBHⅡ酶活的平皿檢測

采用剛果紅染色法[4]：用牙簽將pW425t-CBHⅡ大腸桿菌轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到涂布終濃度為5 mg/ml溶菌酶的LB瓊脂平板上，37℃保溫4 d；1 mg/ml的剛果紅染色1 h，去掉染液，用1 mol/l的NaCl溶液洗滌平板1 h。

1.2.9 CBHⅡ酶解最適溫度、pH值以及酶活力的測定

參照pNPC法[5]，利用50 mmol/l、pH值5.0的醋酸鈉緩沖液配2.5 mmol/l的pNPC溶液，取1 ml加入1 ml粗酶液，50℃保溫30 min，終止反應(yīng)用1%Na2CO31 ml，410 nm比色。酶活力用對(duì)硝基酚的生成量表示，每分鐘水解pNPC產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基酚所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 康寧木霉的總RNA提?。ㄒ妶D1）

圖1 康寧木霉總RNA提取

電泳檢測經(jīng)抽提純化好的康寧木霉AS3.2774總RNA，由圖1可以看出，28 s與18 s條帶完整性較好，條帶清晰，明亮，銳利，沒有基因組污染與降解現(xiàn)象，說明已提到質(zhì)量較好的總RNA，可進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

2.2 PCR擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)好的引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增CBHⅡ基因。電泳檢測，擴(kuò)增出與預(yù)期大小1.4 kb相符的條帶，如圖2。

圖2PCR擴(kuò)增CBHⅡ基因

2.3 CBHⅡ基因的克隆及序列分析

將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化，與pMD18-T Sim?ple載體連接轉(zhuǎn)化DH5a，質(zhì)粒小量提取，SmaI和SphI酶切鑒定、PCR鑒定證明挑取得6個(gè)白色菌落都為陽性菌，證明已獲得重組克隆pMD18-T-CBHⅡ菌(如圖3)。將陽性菌送北京奧科生物技術(shù)有限公司測序，經(jīng)分析所得的CBHⅡ基因的開放閱讀框架為1 413 bp，編碼470個(gè)蛋白，其序列與Gene Bank發(fā)表的標(biāo)準(zhǔn)序列相比同源性達(dá)到99.86%。

圖3 酶切鑒定重組克隆質(zhì)粒

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

在普通LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長功能彌補(bǔ)篩選獲得的菌落，對(duì)篩選的8個(gè)菌落提取質(zhì)粒，用SmaI和SphI酶切鑒定重組質(zhì)粒，其中兩個(gè)質(zhì)粒菌株獲得了約3.7 kb的pW425t片段和1.4 kb的插入片段，表明已構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t-CBHⅡ（如圖4）。

圖4 酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t-CBHⅡ

2.5 SDS-PAGE分析（見圖5）

圖5 CBHⅡ基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測

上述鑒定為陽性克隆的菌株1利用SDS-PAGE分析在不同時(shí)間的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，陽性菌株在約49.6 kD處有一特異條帶，與預(yù)期CBHⅡ蛋白的相對(duì)分子量相同，表明CBHⅡ蛋白得到表達(dá)，在1～5 h時(shí)間內(nèi)，蛋白量有逐漸增加的趨勢，6 h后基本達(dá)到穩(wěn)定。

2.6 平皿檢測轉(zhuǎn)基因大腸桿菌CBHⅡ的酶活

剛果紅染色洗滌后，發(fā)現(xiàn)菌落的周圍出現(xiàn)了清晰的透明圈，說明轉(zhuǎn)基因大腸桿菌具有分泌纖維素酶的功能(如圖 6)。

2.7 CBHⅡ酶解最適溫度和pH值的測定

研究表明：CBHⅡ酶活反應(yīng)的最適溫度為50℃，30～50℃時(shí)CBHⅡ的相對(duì)酶活逐漸升高，50℃最高，之后隨著溫度的升高相對(duì)酶活逐漸下降（如圖7）；CBHⅡ酶活反應(yīng)的最適pH值為5.0，pH值從3.0～5.0時(shí)CBHⅡ的相對(duì)酶活逐漸升高，pH值為5.0時(shí)達(dá)到最高，之后隨著pH值的繼續(xù)升高，相對(duì)酶活逐漸下降（如圖8）。并通過pNPC法測得溫度50℃、pH值5.0時(shí)重組pW425t-CBHⅡ大腸桿菌CBHⅡ的酶活力為0.080 2 U/ml。

圖6 轉(zhuǎn)基因大腸桿菌剛果紅染色產(chǎn)生的水解圈

圖7 溫度對(duì)CBHⅡ酶活的影響

圖8 pH值對(duì)CBHⅡ酶活的影響

3 討論

本試驗(yàn)成功克隆了康寧木霉AS3.2774 CBHⅡ基因。祝令香等(2001)[6]克隆并測定了康寧木霉K801纖維素酶CBHⅡ基因序列。吳興泉等(2006)[7]克隆并序列分析了康寧木霉CBHⅡ基因的cDNA序列。黃時(shí)海等(2011)[8]克隆了康寧木霉纖維素酶CBHI基因。這說明本研究的試驗(yàn)方法是可行的。

本研究在對(duì)CBHⅡ基因的克隆基礎(chǔ)上，將其與非抗性的可在大腸桿菌和乳酸菌之間穿梭的以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的表達(dá)載體pW425t連接，轉(zhuǎn)化入thyA基因缺陷型大腸桿菌，并且成功表達(dá)。pW425t是在大腸桿菌和乳酸菌之間穿梭表達(dá)的載體，首先在大腸桿菌中表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒，原因是大腸桿菌具有培養(yǎng)方便、操作簡單、遺傳背景清楚、特別是應(yīng)用氯化鈣轉(zhuǎn)化方法簡單。同時(shí)，楊桂蓮等(2010)[9]將瑞士乳桿菌胞外蛋白水解酶基因與非抗性表達(dá)載體pW425t重組并在thyA基因缺陷型大腸桿菌成功表達(dá)。這為本試驗(yàn)的研究提供了理論基礎(chǔ)。

本研究為下一步pW425t-CBHⅡ在thyA基因缺陷性乳酸菌株中表達(dá)提供了依據(jù)，為構(gòu)建食品飼料級(jí)的耐酸性的降解纖維素的基因工程乳酸菌奠定了基礎(chǔ)，也為其它纖維素酶基因的克隆和表達(dá)提供了參考依據(jù)。