李萌梅 張寶文 苑 迅

(大連大學醫(yī)學院2014級碩士研究生，遼寧 大連 116622)

三才封髓丹加減對陰虛火旺型口腔潰瘍小鼠血清白細胞介素-1β、2、6的影響

李萌梅 張寶文△苑 迅1

(大連大學醫(yī)學院2014級碩士研究生，遼寧 大連 116622)

目的 觀察三才封髓丹加減對陰虛火旺型口腔潰瘍小鼠血清白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)水平的影響，評價三才封髓丹加減對陰虛火旺型口腔潰瘍小鼠的治療效果，探究其作用機制，進一步為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法 將61只小鼠隨機分為正常組(15只)和實驗組(46只)，給予實驗組小鼠每日0.32 mg/g(體質(zhì)量)甲狀腺片混懸液，連續(xù)灌胃9 d建立陰虛火旺模型，第10 d用氫氧化鈉(NaOH)晶體灼燒法，聯(lián)合建立陰虛火旺型口腔潰瘍小鼠模型。第11 d造模完成后，隨機處死實驗組小鼠1只，留取有損傷的口腔黏膜組織做病理切片，并將實驗組小鼠45只隨機分為模型對照組、維生素陽性對照組、三才封髓丹治療組，各15只，按每日0.02 mL/g(體質(zhì)量)分別灌胃給藥，連續(xù)6 d。測定小鼠體質(zhì)量、體溫，檢測血清中IL-1β、IL-2、IL-6的水平。結(jié)果 實驗組小鼠與正常組小鼠體質(zhì)量變化比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，正常組與實驗組小鼠每日體溫比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？谇粷兡Ｐ筒±砜梢?，表面被覆鱗狀上皮，表層輕度角化，間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生，小血管擴張，慢性炎細胞浸潤，罕見涎腺組織。模型對照組小鼠血清IL-1β、IL-6水平較正常組明顯升高(P<0.05)，IL-2水平較正常組明顯下降(P<0.05)。維生素對照組小鼠血清IL-1β、IL-6水平較模型對照組明顯下降(P<0.05)，IL-2水平較模型組亦明顯下降(P<0.05)。三才封髓丹組小鼠血清IL-1β、IL-6水平較模型對照組明顯降低(P<0.05)，其中IL-1β水平較正常組亦明顯下降(P<0.05)，IL-2水平模型組明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 三才封髓丹加減可降低血清中IL-1β、IL-6含量，升高IL-2，對陰虛火旺型口腔潰瘍具有一定的治療作用，其作用機制可能與增強免疫作用有關(guān)?；旌暇S生素可以降低血清中IL-1β、IL-6含量，對陰虛火旺型口腔潰瘍有治療作用，而過量的維生素會降低血清中IL-2，可能有抑制免疫的作用。

口腔潰瘍；中藥療法；動物；鼠；白細胞介素1β；白細胞介素2；白細胞介素6

口腔潰瘍是發(fā)生在口腔黏膜上的表淺性潰瘍，大小可從麥粒至黃豆大小，成圓形或卵圓形，潰瘍面凹陷、周圍充血，具有“紅、腫、熱、痛”的特點，可因刺激性食物引發(fā)疼痛，一般1周左右愈合，口腔潰瘍呈周期性反復(fù)發(fā)生，稱為復(fù)發(fā)性口腔潰瘍，可數(shù)年或1年發(fā)病1次，也可1個月發(fā)病1次，甚至新舊病交替出現(xiàn)。口腔潰瘍屬中醫(yī)學口瘡范疇，以口舌生瘡或糜爛、灼熱疼痛為主要表現(xiàn)的病癥，中醫(yī)臨床常見分型有：心脾積熱型、陰虛火旺型和脾腎虛寒型[1]。臨床實踐中三才封髓丹加減湯劑對于陰虛火旺型口腔潰瘍收效顯著，現(xiàn)通過動物實驗探討其可能的作用機制，為臨床用藥提供思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 甲狀腺片(山東仁和制藥有限公司，批號：014140306，國藥準字H37021098)；維生素B2片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：4151105，國藥準字H21022859)；維生素C片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：5151101，國藥準字H21022862)；氨基甲酸乙酯(國藥集團化學制劑有限公司，批號:20130125)；三才封髓丹加減方(藥物組成：人參9 g，天門冬6 g，生地黃15 g，黃柏6 g，砂仁3 g，甘草3 g)，購于遼寧省大連市開發(fā)區(qū)中醫(yī)院；氫氧化鈉(NaOH)晶體；0.9%氯化鈉注射液(遼寧民康制藥有限公司，批號：A141214K1)；實驗室用水為蒸餾水。

1.2 實驗動物 昆明種小白鼠61只，雌30只，雄31只，體質(zhì)量18～22 g，由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(遼)2013-0003。

1.3 實驗儀器與設(shè)備 YB1201型電子天平(上海?？惦娮觾x器廠)；YD-WT1型紅外測溫儀(廣州瑪奈特醫(yī)療器械有限公司)；計時器；MIKRO-220R冷凍型臺式高速離心(Hettich，德國)；小鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-6，生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA )檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；-80 ℃冰箱(賽默飛世爾科技公司)；37 ℃恒溫箱(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；Multiskan Go全波長酶標儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.4 藥物及其制備

1.4.1 甲狀腺片混懸液制備 將400 mg甲狀腺片研磨成粉，溶于20 mL的蒸餾水中，制備為每mL含藥量20 mg的混懸液[2]。

1.4.2 維生素陽性供試液制備 將20 mg維生素B2、400 mg維生素C研磨成粉末，溶于100 mL蒸餾水中，制備為每mL含維生素B20.2 mg、維生素C 4 mg的陽性供試液[3]。

1.4.3 三才封髓丹供試液制備 三才封髓丹加減方(藥物組成：人參9 g，天門冬6 g，生地黃15 g，黃柏6 g，砂仁3 g，甘草3 g)制成200%濃度，即每mL含生藥2 g制劑。

1.5 造模方法

1.5.1 甲狀腺片和NaOH灼燒法聯(lián)合建立陰虛火旺型口腔潰瘍小鼠模型 室內(nèi)溫度為(20±2)℃，平均相對濕度40%，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后將61只小鼠，隨機分為正常組(15只)和實驗組(46只)。實驗組每日0.32 mg/g(體質(zhì)量)甲狀腺片混懸液，連續(xù)灌胃9 d，造成陰虛火旺的模型。第10 d，用化學灼燒法建立潰瘍模型，小鼠在10%的氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉下[4]，取直徑為2 mm的NaOH晶體，在右下唇靠近口角黏膜處灼燒5 s，用0.9%氯化鈉注射液沖洗，24 h后形成潰瘍[5]，每只小鼠所建模型盡量在同一位置，大小、深度力求一致。第11 d造模完成后，隨機處死實驗組小鼠1只，留取有損傷的口腔黏膜組織，做病理切片。并將實驗組小鼠隨機分為模型對照組(15只)、維生素陽性對照組(15只)、三才封髓丹治療組(15只)，分別灌胃給藥。每日灌胃前分別給小鼠稱體質(zhì)量，并于每日15:00時測量小鼠鼻部溫度，觀察小鼠癥狀、體征的變化。

1.5.2 小鼠分組給藥 維生素陽性對照組給予每只小鼠維生素陽性供試液0.02 mL/g體質(zhì)量；三才封髓丹組給予每只小鼠三才封髓丹供試液0.02 mL/g體質(zhì)量；正常對照組、模型對照組給予每只小鼠0.9%氯化鈉注射液0.02 mL/g體質(zhì)量。每日1次，灌胃給藥，連續(xù)給藥6 d。

1.6 口腔黏膜病理標本的制備 第11 d造模完成后，隨機處死實驗組小鼠1只，留取有損傷的口腔黏膜組織，做病理切片。第16 d小鼠眼球取血后，處死小鼠，隨機取正常組小鼠1只，沿其嘴角部位剪開，充分暴露整個口腔，留取口腔黏膜組織，0.9%氯化鈉注射液沖洗后，浸入甲醛固定，制作病理切片。

1.7 觀測指標 末次給藥2 h后，小鼠眼球取血，脫頸處死各組動物。血液標本室溫靜置20 min后用低溫離心機3 500 r/min，20 min離心，取上清液，用ELISA法測定小鼠外周血血清中IL-1β、IL-2、IL-6的含量。

2 結(jié) 果

2.1 造模及結(jié)果

2.1.1 正常組與實驗組小鼠體質(zhì)量比較 見表1。

表1 正常組與實驗組小鼠體質(zhì)量比較 g, ±s

由表1可見，正常組小鼠第11 d與第16 d體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明0.9%氯化鈉注射液灌胃操作對小鼠體質(zhì)量變化無影響。第9 d實驗組與正常組小鼠體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。灌胃操作影響小鼠飲食習慣，小鼠體質(zhì)量趨于穩(wěn)定，不會出現(xiàn)明顯增加或者減少，實驗組小鼠在甲狀腺片灌胃期間出現(xiàn)體質(zhì)量下降，主要是因為小鼠體內(nèi)甲狀腺素增加，新陳代謝加快，模擬“甲亢”模型，出現(xiàn)體質(zhì)量下降，符合中醫(yī)陰虛火旺證出現(xiàn)形體消瘦的臨床指證。

2.1.2 甲狀腺片造模期間實驗組小鼠雌雄性體質(zhì)量比較 見表2。

表2 甲狀腺片造模期間實驗組小鼠雌雄性體質(zhì)量比較 g, ±s

由表2可見，甲狀腺片灌胃第9 d 實驗組雌性與雄性小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。臨床上甲亢男女均可發(fā)病，以中、青年女性為多見，但在動物實驗中甲狀腺素對雌雄性小鼠體質(zhì)量無影響。

2.1.3 正常組與實驗組小鼠造模期間體溫比較 見表3。

表3 正常組與實驗組小鼠甲狀腺造模期間體溫比較 ℃,±s

采用紅外測溫儀于每日15:00測量小鼠鼻部溫度，測量2次取平均值。由表3可見，正常組與實驗組小鼠每日體溫比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。考慮小鼠的汗腺不發(fā)達，主要通過尾部散熱，甲狀腺素灌胃后小鼠自主活動增加，產(chǎn)熱增加，汗液揮發(fā)，故體表局部溫度與正常組小鼠無差異。通常測量小鼠體溫采用肛溫法，要求每只小鼠要固定一只體溫計，每次插入直腸的深度要一致，插入肛門后要用手捏閉肛門，以防止小鼠掙扎[6]。當樣本量較大時，不易操作。采用紅外測溫儀較體溫計操作簡便，安全系數(shù)較高。

2.2 小鼠癥狀和體征變化 甲狀腺素造模期間，正常組小鼠反應(yīng)敏捷，皮毛光潔整齊，體質(zhì)量增加明顯。實驗組小鼠，瞇眼明顯，眼裂小，煩躁多動，皮毛稀疏無光澤，清潔度下降，體質(zhì)量下降。

2.3 病理切片 正?？谇唤M織病理切片可見：表面被覆鱗狀上皮，表層輕度角化，黏膜下層為結(jié)締組織，內(nèi)含小涎腺、血管(見圖1、圖2)?？谇粷兡Ｐ筒±砬衅梢姡罕砻姹桓谗[狀上皮，表層輕度角化，間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生，小血管擴張，慢性炎細胞浸潤，罕見涎腺組織(見圖3、圖4)。

圖1 正?？谇唤M織(HE，×100) 圖2 正?？谇唤M織(HE，×400) 圖3 口腔潰瘍模型(HE，×100) 圖4 口腔潰瘍模型(HE，×400)

2.4 各組小鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6水平比較 見表4。

組 別nIL-1βIL-2IL-6正常組1557.52±6.0371.25±5.6380.52±6.46模型對照組1571.51±5.74*62.06±6.37*92.85±9.17*維生素對照組1558.44±4.16○55.66±2.77*○80.26±6.78○三才封髓丹組1542.91±6.21*○△69.29±5.97○△86.30±8.09○

與正常組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，○P<0.05；與維生素對照組比較，△P<0.05

由表4可見，模型對照組小鼠血清IL-1β、IL-6水平較正常組明顯升高(P<0.05)，IL-2水平較正常組明顯下降(P<0.05)。維生素對照組小鼠血清IL-1β、IL-6水平較模型對照組明顯下降(P<0.05)，IL-2的水平較模型組亦明顯下降(P<0.05)。三才封髓丹組小鼠血清IL-1β、IL-6水平較模型對照組均明顯降低(P<0.05)，其中IL-1β的水平較正常組亦明顯下降(P<0.05)，IL-2的水平較模型對照組明顯升高(P<0.05)。

3 討 論

本實驗采用甲狀腺片誘導、NaOH晶體灼燒聯(lián)合所致的陰虛火旺型口腔潰瘍小鼠模型來進行治療。有研究表明，甲狀腺片造模誘導小鼠表觀指征的變化能夠模擬陰虛火旺型的主要臨床特征[7]。從本研究造模結(jié)果看，給予甲狀腺素灌胃后的小鼠體質(zhì)量下降可以模擬 “甲亢”模型，出現(xiàn)體質(zhì)量下降，符合中醫(yī)陰虛火旺證出現(xiàn)形體消瘦的臨床指證?？谇徊±砬衅梢婇g質(zhì)內(nèi)纖維組織增生，小血管擴張，慢性炎細胞浸潤，故造模結(jié)果能夠較好地模擬臨床陰虛火旺型口腔潰瘍。

從血清指標看，模型組較正常組血清IL-1β、IL-6水平顯升高，維生素對照組和三才封髓丹組較模型組IL-1β、IL-6水平明顯下降，小鼠血清中促炎因子明顯減少，說明藥物對炎癥反應(yīng)有改善效果。值得注意的是，三才封髓丹組IL-1β水平更是明顯低于正常組水平，可能是三才封髓丹湯劑對甲狀腺聯(lián)合NaOH造模的口腔潰瘍小鼠血清IL-1β有抑制作用，減少促炎因子。模型組IL-2水平明顯低于正常組，三才封髓丹組較模型組IL-2水平升高，而維生素組IL-2水平則明顯低于模型組，混合維生素能夠顯著抑制甲狀腺聯(lián)合NaOH造模的口腔潰瘍小鼠的IL-2水平，暫時不能明確是維生素C和維生素B2共同作用的結(jié)果，或是其中一種維生素作用的結(jié)果，需要進一步研究。

臨床上認為口腔潰瘍的病因較復(fù)雜，存在明顯的個體差異，目前尚無統(tǒng)一的說法，中西醫(yī)亦有不同見解?？诏彽挠涊d首見于《內(nèi)經(jīng)》，后世醫(yī)家認為口瘡病機全在于一個“火”字，可分虛實兩端，《外科正宗》曰：“口破者，有虛火、實火之分，色淡色紅之別。虛火者，色淡而斑細點，甚者陷露龜紋，脈虛不渴，此因思煩太甚，多醒少睡，虛火動而發(fā)之?！敝嗅t(yī)學認為，口腔潰瘍病變雖在局部，但口腔與各臟腑關(guān)系密切，尤其是心、脾、腎三臟，口腔更是經(jīng)絡(luò)循行的要沖，人體的十二經(jīng)脈中除手厥陰心包經(jīng)間接循行于口腔外，其余的經(jīng)絡(luò)都直接循行或通過分支交匯于舌、唇、齦、齒、面頰等口腔組織。中醫(yī)學關(guān)于口腔潰瘍的病因大多認為是過食辛辣厚味或嗜酒，以致心脾積熱，上蒸于口；或口腔不潔，毒邪侵襲；或素體陰虛虛火上炎或久病不愈，脾腎陽虛等引起。明代薛已《口齒類要·口瘡》曰：“口瘡，上焦實熱，中焦虛寒，下焦陰火，各經(jīng)傳變所致，當分別而治之?！迸R床常見分型有：心脾積熱型、陰虛火旺型和脾腎虛寒型?！妒颐劁洝分赋觥翱谏嗌徴撸诵慕?jīng)熱也”。陰虛火旺型口腔潰瘍多由素體陰虛或久病不愈，人體正氣損傷，耗傷心腎水不制火，虛火上炎，熏灼口舌，發(fā)為口瘡。

三才封髓丹是臨床上治療陰虛火旺型口腔潰瘍的常用方劑之一，臨床收效佳。三才封髓丹出自于《衛(wèi)生寶鑒》，由人參、天門冬、熟地黃、黃柏、砂仁、炙甘草組成。主治陰虛火旺、虛火上炎所致的口腔潰瘍、牙痛、口咽干癢、遺夢滑精及腰膝無力等[8]。方中天門冬滋陰補肺生水，熟地黃補腎滋陰，人參益氣生津，得三補而腎水充、陰液足，則浮火自降；黃柏清虛火，堅腎陰，瀉火而不傷陰，實為口瘡之要藥；甘草助黃柏瀉火解毒而不傷陰；砂仁入脾、胃經(jīng)，醒脾化濕行滯，解陰膩之礙脾以助藥運。黃柏、砂仁、炙甘草又名封髓丹，主要治療腎陰虛損，相火妄動所導致的疾患。本次實驗中將熟地黃易為生地黃，二者均能滋陰，可用治陰虛證，但生地黃甘寒質(zhì)潤長于養(yǎng)心腎之陰，故血熱陰傷及精血陰液虧虛有熱者宜用。

現(xiàn)代藥理以及臨床研究表明，三才封髓丹具有增強免疫力、促進造血功能等作用[9]。人參中的人參皂苷Rg1無論在體內(nèi)外均能選擇性地增強脾淋巴細胞IL-2的產(chǎn)生和釋放，人參多糖則對人外周血單核細胞誘生IL-2有明顯促進作用，人參能夠增強機體對有害因素的抵抗能力，調(diào)節(jié)機體免疫功能[10]；天門冬增強體液免疫功能[11]；生地黃可糾正甲亢大鼠腎臟β-受體數(shù)量的增加，使甲狀腺功能恢復(fù)正常[11]；黃柏主要成分為小檗堿，具有明顯抗炎作用[12]；甘草中的甘草酸則有非特異性免疫增強作用[11]。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，口腔潰瘍形成因素較多，包括遺傳易感性、食物過敏、微量元素缺乏、系統(tǒng)性疾病、激素失調(diào)、機械性損傷、壓力及免疫因素等[13]。其治療包括以消炎、止痛、防止感染、促進愈合為原則的局部治療和以消除可能病因因素的全身治療原則[14]。大量臨床試驗證實維生素能夠有效治療口腔潰瘍[15-17]，實驗中采用的是臨床上較為常用的維生素制劑為對照組，藥物價格低廉易得，患者認知度高。

觀察結(jié)果表明，三才封髓丹加減湯劑可以有效地改善陰虛火旺癥狀及治療陰虛火旺型口腔潰瘍，顯著提高IL-2水平，降低IL-1β、IL-6的水平，減少促炎因子，增強抗炎因子的水平，提高機體免疫功能，促進口腔潰瘍愈合。進而提示提高IL-2水平以及降低IL-1β、IL-6的水平可能是三才封髓丹治療陰虛火旺型口腔潰瘍的作用機制之一，IL-2水平降低以及IL-1β、IL-6水平升高，免疫功能下降是誘發(fā)口腔潰瘍的一個重要原因。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of Sancai-Fengsui pills on serum IL-1β, IL-2 and IL-6 in oral ulcer mice with fire excess from yin deficiency type

LIMengmei*,ZHANGBaowen,YUANXun.

*2014gradePostgraduateStudentinDalianUniversitySchoolofMedicine,Liaoning,Dalian116622

Objective To observe the effects of Sancai-Fengsui pills on serum interleukin (IL-1β), IL-2 and IL-6 in mice model of oral ulcer with fire excess from yin deficiency type, to study its therapeutic effects and action mechanism, provide an further evidence for clinical application. Methods Mice were randomly divided into normal group and experimental group. Mice (n=46) in experimental group received suspension of thyroxine [0.32 mg/(g·d)] for 9 d which order to establish the model of fire excess from yin deficiency type, and then the oral ulcer model was established by NaOH crystal-burned at day 10. After successful modeling at day 11, termination of one mouse in experimental group took injury oral mucosa tissues for pathological section, the other mice in experimental group were randomly divided into model control group, vitamin positive control group and Sancai-Fengsui pills group, 15 mice each group,continuously treatment intragastric administration [0.02 mg/(g·d)] for 6 d, respectively. The levels of body weight, temperature, serum IL-1β, IL-2 and IL-6 were measured. Results There were statistical differences on body weight between experimental group which using thyroxine and normal group (P<0.05). There were no statistical differences on daily temperature between normal and experimental group (P>0.05). The pathological section of oral ulcer model showed cover squamous epithelium, surface mild, interstitial fibrous proliferation, the minute vessel expands, chronic inflammatory cells and rare salivary tissues. The levels of serum IL-1β and IL-6 in model control group were obviously higher than those in normal group (P<0.05), and the IL-2 was obviously lower (P<0.05). The levels of serum IL-1β and IL-6 in vitamin positive control group were obviously lower than those in model control group (P<0.05), and the IL-2 was obviously lower than that in model control group (P<0.05). The levels of serum IL-1β and IL-6 in Sancai-Fengsui pills group were obviously lower than those in model control group (P<0.05), and the serum IL-1βwas obviously lower than that in normal group (P<0.05), the IL-2 was obviously higher than that in model group (P<0.05). Conclusion Modified Sancai-fengsui pills can decrease the serum IL-1β and IL-6, increase IL-2, has certain therapeutic effect on oral ulcer with fire excess from yin deficiency type. Its action mechanism may be related with immunological enhancement. Mixed vitamin can decrease serum IL-1β and IL-6, has therapeutic effect on oral ulcer with fire excess from yin deficiency type, but excess vitamin can decrease serum IL-2, which may related with immune suppression.

Oral ulcer; Chinese medicine therapy; Animals; Mice; IL-1β; IL-2; IL-6

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.11.022

李萌梅(1990—)，女，學士，碩士研究生在讀。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治疾病機制研究。

R-332；R781.505.31

A

1002-2619(2016)11-1693-06

2016-07-23)

△ 通訊作者：大連大學醫(yī)學院中醫(yī)中藥系，遼寧 大連 116622

1 大連大學，遼寧 大連 116622