張 靜

(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心中醫(yī)兒科，廣東 廣州 510623)

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、白細(xì)胞介素-17與嬰幼兒喘息樣支氣管炎辨證分型的關(guān)系

張 靜

(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心中醫(yī)兒科，廣東 廣州 510623)

目的 探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)與嬰幼兒喘息樣支氣管炎辨證分型的關(guān)系。方法 選擇健康兒童20名、肺脾氣虛型喘息樣支氣管炎患兒20例及脾腎陽虛型喘息樣支氣管炎患兒20例，檢測(cè)其外周血Treg細(xì)胞、IL-17含量。6個(gè)月后隨訪各組再次發(fā)作喘息患兒的人數(shù)及次數(shù)，檢測(cè)其外周血Treg細(xì)胞、IL-17含量。結(jié)果 3組Treg細(xì)胞比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。6個(gè)月后隨訪3組Treg細(xì)胞比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 Treg細(xì)胞、IL-17與嬰幼兒喘息樣支氣管炎的首次發(fā)作及再次喘息發(fā)作存在密切關(guān)系。在喘息樣支氣管炎緩解階段，應(yīng)用健脾益肺補(bǔ)氣的方法對(duì)肺脾氣虛型患兒進(jìn)行體質(zhì)治療及預(yù)防，從根本上改善患兒的生活質(zhì)量。

哮喘；辨證分型；白細(xì)胞介素6；T淋巴細(xì)胞

嬰幼兒喘息樣支氣管炎[1]是最常見的兒科呼吸系統(tǒng)疾病，此病有反復(fù)發(fā)作趨勢(shì)，部分患兒甚至可能發(fā)展為支氣管哮喘。因此，為了提高中醫(yī)對(duì)喘息樣支氣管炎患兒的治療及預(yù)防再次發(fā)作喘息，本研究主要觀察喘息樣支氣管炎緩解階段肺脾氣虛型和脾腎陽虛型嬰幼兒和正常兒童的外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)含量，以及其相互之間的關(guān)系，旨在探討Treg細(xì)胞、IL-17與嬰幼兒喘息樣支氣管炎辨證分型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷指標(biāo) 西醫(yī)診斷參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[2]中喘息樣支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；中醫(yī)診斷參照《中醫(yī)兒科學(xué)》[3]中哮喘緩解期診斷標(biāo)準(zhǔn)，辨證分型為肺脾氣虛型、脾腎陽虛型[4-5]。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 患兒：年齡<3周歲；符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)；首次被診斷為喘息樣支氣管炎收治入院。健康兒童：年齡<3周歲；無喘息發(fā)作史；無過敏性疾病；一級(jí)親屬無過敏性疾病。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 支氣管異物、喉發(fā)育不良、支氣管肺發(fā)育不良、先天性氣道畸形、支氣管擴(kuò)張、重癥肺炎等可能引起喘息的疾患；有心、腦、腎基礎(chǔ)疾病者；嚴(yán)重的免疫缺陷病和遺傳代謝性疾病。健康兒童：父母有哮喘病史；外周血嗜酸粒細(xì)胞≥0.04。

1.2 一般材料 選擇2014-01-01—2014-06-30到廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童保健門診體檢的健康兒童20名，廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心呼吸科住院患兒肺脾氣虛型和脾腎陽虛型各20例，均首次診斷為喘息樣支氣管炎。健康組20名，男9名，女11名；年齡1～36個(gè)月，平均(23.65±5.02)個(gè)月；體質(zhì)量8～15 kg，平均(11.60±1.63) kg；肺脾氣虛組20例，男11例，女9例；年齡1～36個(gè)月，平均(22.05±7.10)個(gè)月；體質(zhì)量8～15 kg，平均(11.76±1.53) kg；脾腎陽虛組20例，男12例，女8例；年齡1～36個(gè)月，平均(22.20±3.44)個(gè)月；體質(zhì)量8～15 kg，平均(11.18±0.91) kg。3組性別、年齡、體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。6個(gè)月后隨訪肺脾氣虛組、脾腎陽虛組再次發(fā)作喘息患兒的人數(shù)及次數(shù)，檢測(cè)其外周血Treg細(xì)胞、IL-17含量，以我院醫(yī)生門診病歷診斷為喘息性支氣管炎納入再次喘息發(fā)作的依據(jù)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 Treg細(xì)胞 Treg細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購自BD Biosciences公司。抽取研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，取50 μL乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝全血，加入10 μLCD25-FITC，2.5 μL CD4-APC，5 μLCD127-PE，然后混勻，室溫避光15 min，后取2 mL溶血素混勻，再室溫避光10 min，平衡試管質(zhì)量后置于水平式離心機(jī)內(nèi)離心1 500 r/min ，5 min，去上清，取2 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)混勻，水平式離心機(jī)內(nèi)離心1 500 r/min，5 min，去上清，450 μL PBS懸浮，最后上機(jī)檢測(cè)。用流式細(xì)胞儀CELL Quest Pro軟件收集數(shù)據(jù)并分析。

1.3.2 IL-17 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購自安迪生物科技(上海)有限公司。IL-17標(biāo)本采集及細(xì)胞分離：抽取全部研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，肝素鈉抗凝。全血離心后收集血漿-80 ℃凍存待ELISA檢測(cè)。本試劑盒使用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中IL-17水平。用純化的IL-17抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入IL-17，再與辣根化氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人抗體結(jié)合，構(gòu)成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過完全洗滌后加底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣本中的IL-17呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-17含量。

2 結(jié) 果

2.1 3組Treg細(xì)胞、IL-17比較 見表1。

表1 3組Treg細(xì)胞、IL-17比較

健康組(n=20)肺脾氣虛組(n=20)脾腎陽虛組(n=20)Treg細(xì)胞(%)7.7250±1.615187.5195±1.506117.9945±1.36052IL-17(pg/mL)3032.87±814.41*4034.20±1279.002865.77±520.26*

與肺脾氣虛組比較，*P<0.05

由表1可見，3組Treg細(xì)胞比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肺脾氣虛組、脾腎陽虛組隨訪再次喘息患兒與健康組Treg細(xì)胞、IL-17比較 見表2。

表2 肺脾氣虛組、脾腎陽虛組隨訪再次喘息患兒與健康組Treg細(xì)胞、IL-17比較 ±s

與肺脾氣虛組比較，*P<0.05

由表2可見，3組Treg細(xì)胞比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

喘息樣支氣管炎的免疫學(xué)基礎(chǔ)是輔助性T細(xì)胞2(Th2)為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)，氣道存在以肥大細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞參與為主的氣道慢性過敏性炎癥[6]。目前認(rèn)為喘息樣支氣管炎的反復(fù)發(fā)作是由于免疫調(diào)節(jié)紊亂引起的。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)呼吸道炎癥過程的細(xì)胞，并可能在過敏性哮喘的發(fā)病和發(fā)展機(jī)制中起到關(guān)鍵性作用。Treg細(xì)胞[7]通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和細(xì)胞間直接接觸介導(dǎo)免疫抑制，IL-10是具有抗炎作用的細(xì)胞因子，可抑制促炎細(xì)胞因子的合成，亦可抑制嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的致炎作用。CD4+、CD25+Treg細(xì)胞的主要作用表現(xiàn)為免疫無能性和免疫抑制性，是外周免疫耐受形成機(jī)制的主要組成部分。其主要作用機(jī)制為分泌抑制性細(xì)胞因子(IL-10和TGF-β)、表達(dá)細(xì)胞表面分子[細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)]及Foxp3等。國外研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β能誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)，促進(jìn)CD4+、CD25+Treg細(xì)胞增殖，從而抑制呼吸道嗜酸粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥，降低呼吸道變態(tài)反應(yīng)[8]。吳奎等[9]發(fā)現(xiàn)哮喘鼠中CD4+、CD25+Treg細(xì)胞顯著低于正常鼠，還發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞相關(guān)因子IL-10水平降低。而另一研究[10]亦顯示，呼吸道過敏癥模型小鼠的體內(nèi)存在Treg細(xì)胞的缺陷，將CD4+、CD25+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)移到模型鼠體內(nèi)可以抑制過敏性炎癥的發(fā)生。

國外臨床研究中哮喘急性發(fā)作期及持續(xù)期CD4+、CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)較緩解期及正常對(duì)照組降低，癥狀緩解階段CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)增加接近正常[11]，由此可見Treg細(xì)胞的免疫抑制作用在保持機(jī)體的自身耐受性中發(fā)揮著決定性作用[12]。彭力等[13]在臨床實(shí)驗(yàn)中觀察喘息嬰幼兒CD4+、CD25+Treg細(xì)胞百分率的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，Treg細(xì)胞可能在嬰幼兒喘息疾病活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，可能參與了嬰幼兒喘息的發(fā)病機(jī)制。而在本研究中顯示Treg細(xì)胞在健康兒童組外周血中與肺脾氣虛和脾腎陽虛組患兒的差別并不大，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，此結(jié)果與彭力等[13]觀察喘息嬰幼兒Treg細(xì)胞明顯低于對(duì)照組得出的結(jié)論有所不同，但由于彭力等[13]觀察的指標(biāo)為喘息發(fā)作時(shí)進(jìn)行的檢測(cè)，而本研究是喘息緩解階段進(jìn)行的免疫學(xué)檢測(cè)，這可能提示在嬰幼兒喘息緩解后Treg細(xì)胞的表達(dá)逐漸增加接近正常。這一結(jié)果與國外研究哮喘緩解后Treg細(xì)胞表達(dá)增加接近正常組的結(jié)論相近[11]。也進(jìn)一步提示嬰幼兒喘息與哮喘的免疫學(xué)指標(biāo)高度相似。從另一方面也表示在嬰幼兒喘息的發(fā)作中可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少有相關(guān)性。

Th17細(xì)胞是由Infante-Duarte C等[14]首次提出的一群不表達(dá)IL-4或γ-干擾素(IFNγ)，卻高水平分泌IL-17的新的Th亞群。Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子是IL-17。近年來發(fā)現(xiàn)，IL-17 是T 細(xì)胞來源細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞分泌的IL-17是強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子，它可以促使氣道黏液腺分泌大量黏液，增加氣道的高反應(yīng)性，從而在哮喘氣道重塑的過程中發(fā)揮重要作用。施宇衡等[15]發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的過敏性哮喘患者Th17細(xì)胞的反應(yīng)增加，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17為哮喘加重的關(guān)鍵因素。而IL-17基因[16]缺陷小鼠不易引發(fā)哮喘，說明在哮喘的發(fā)作中Th17細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。但目前國內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[17]亦表明哮喘急性發(fā)作期氣道IL-17表達(dá)和產(chǎn)生增加，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞性炎癥，臨床資料證實(shí)IL-17在哮喘急性發(fā)作期氣道表達(dá)增加，提示Th17在兒童哮喘發(fā)病中可能有重要作用。Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)疾病免疫發(fā)病機(jī)制，尤其是嬰幼兒喘息樣支氣管炎的發(fā)病機(jī)制突破僅有的Thl/Th2模式的局限。過去許多認(rèn)為是Th1或Th2細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，現(xiàn)在證實(shí)Th17細(xì)胞亦起重要作用或主要作用。

本研究中，健康兒童外周血IL-17 與肺脾氣虛組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與脾腎陽虛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肺脾氣虛組再發(fā)喘息患兒IL-17含量與健康兒童比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示喘息樣支氣管炎肺脾氣虛型患兒喘息癥狀的反復(fù)發(fā)作可能與IL-17含量有明顯直接關(guān)系。而脾腎陽虛組再發(fā)喘息患兒IL-17含量與健康兒童比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在嬰幼兒再發(fā)喘息中IL-17與肺脾氣虛型患兒的關(guān)系比脾腎陽虛型患兒的相關(guān)性有可能要更加密切。肺脾氣虛組患兒IL-17含量均高于健康組和脾腎陽虛組，而IL-17具有上調(diào)黏液基因表達(dá)、促進(jìn)黏液分泌的作用，并可間接促進(jìn)氣道組織纖維化而參與哮喘的氣道重塑過程。張亞梅等[18]報(bào)道兒童喘息樣支氣管炎病情嚴(yán)重程度與外周血漿中IL-17表達(dá)水平呈正相關(guān)，因此IL-17含量的增多對(duì)喘息的發(fā)作有一定程度的影響。并且在喘息發(fā)病中辨證為肺脾氣虛型患兒IL-17的高表達(dá)也提示此類患兒發(fā)展為慢性哮喘的可能性較高，并不利于喘息恢復(fù)，所以在治療預(yù)防中要重視此類患兒的體質(zhì)調(diào)理。魯雙喜[19]在玉屏風(fēng)散對(duì)哮喘小鼠Th17相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)影響研究中發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散對(duì)哮喘小鼠急性期IL-17有抑制作用，能減輕哮喘小鼠肺組織細(xì)支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤，改善氣道炎癥狀態(tài)，減少氣道上皮黏液分泌。

在喘息樣支氣管炎緩解階段，我們可以應(yīng)用健脾益肺補(bǔ)氣法對(duì)肺脾氣虛型患兒進(jìn)行體質(zhì)治療及預(yù)防，從根本上改善此類患兒的生活質(zhì)量。

(指導(dǎo)老師：陳曉剛 劉 華)

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(本文編輯：習(xí) 沙)

Correlation among regulatory T cells, interleukin-17 and syndrome differentiation of asthmatoid bronchitis in infants

ZHANGJing.

DepartmentofTraditionalChinesePediatrics,GuangzhouMedicalCenterforWomenandChildreninGuangdongProvince,Guangdong,Guangzhou510623

Objective To study the correlation among regulatory T cells (Treg cells), interleukin-17 (IL-17) and syndrome differentiation of asthmatoid bronchitis in infants. Methods 20 healthy infants, 20 asthmatoid bronchitis infants with lung and spleen QI deficiency type and 20 asthmatoid bronchitis infants with spleen-kidney Yang deficiency type were selected. The contents of peripheral-blood Treg cells and IL-17 were measured. The people counting and attack frequency of acute exacerbation of asthma after 6 months follow-up were observed and the contents of peripheral-blood Treg cells and IL-17 were measured. Results There were no statistical differences on Treg cells among three groups (P>0.05). The IL-17 in lung and spleen QI deficiency group was higher than healthy and spleen-kidney Yang deficiency group (P<0.05), and there were no statistical differences on IL-17 between healthy group and spleen-kidney Yang deficiency group (P>0.05). Conclusion There are intimate connection among Treg cells, IL-17 and the first and second attack of asthma in infants with asthmatoid bronchitis. In the remission stage of asthmatoid bronchitis, the therapy of strengthening spleen, invigorating lung and nourishing QI is able to treat and prevent the infants with lung and spleen QI deficiency constitution, which can fundamentally improve the quality of life.

Asthma; Syndrome differentiation; IL-6; T lymphocyte

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.11.007

張靜(1983—)，女，主治醫(yī)師，碩士。從事中醫(yī)兒科臨床工作。

R725.6；R725.622.5；R331.125

A

1002-2619(2016)11-1630-05

2016-07-14)