張彩坤，張豪英，邢冬杰，辛先貴，王楓 ,路新磊

(1 山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東煙臺264100；2 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院)

肥胖大鼠心外膜脂肪組織中巨噬細(xì)胞計數(shù)變化

張彩坤1，張豪英1，邢冬杰1，辛先貴1，王楓1,路新磊2

(1 山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東煙臺264100；2 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院)

目的 觀察肥胖大鼠心外膜脂肪(EAT)組織中巨噬細(xì)胞計數(shù)變化。方法 選擇20只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對照組10只和肥胖組10只；對照組飼以基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗組飼以高脂飼料。飼養(yǎng)80 d后將兩組大鼠處死并取其EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織，EAT稱重。采用免疫組化染色法對EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織的巨噬細(xì)胞(M)、M1、M2進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果 肥胖組EAT組織質(zhì)量為(0.45±0.20)g，對照組為(0.30±0.14)g，兩組相比，P<0.05。對照組三個部位脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M2/M、M1/M2相比，P均>0.05；肥胖組EAT組織、附睪周圍脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2、M2/M與腹股溝脂肪組織相比，P均<0.05；肥胖組EAT組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2、M2/M與附睪周圍脂肪組織相比，P均>0.05；肥胖組EAT組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2、M2/M與對照組相比，P均<0.05。結(jié)論 肥胖大鼠具有更多的EAT組織，其EAT組織中M數(shù)量增多，但M2數(shù)量相對減少。

肥胖；脂肪組織；心外膜脂肪；巨噬細(xì)胞；冠狀動脈粥樣硬化性心臟病

肥胖尤其是腹型肥胖是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的重要危險因素[1]。脂肪組織不僅是機(jī)體的能量儲庫，而且還是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官，尤其是內(nèi)臟脂肪，可分泌眾多脂肪細(xì)胞因子，與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2,3]。心外膜脂肪(EAT)作為沉積在心臟周圍特別是圍繞在冠狀動脈周圍的內(nèi)臟脂肪，是預(yù)測冠心病的有效標(biāo)志物[4]。Hirata等[5]研究證實(shí)，冠心病患者心外膜浸潤的巨噬細(xì)胞(M)可以分泌大量的促炎癥細(xì)胞因子。然而，目前尚不清楚此時的心外膜炎癥是由于動脈粥樣硬化斑塊引起，還是脂肪組織本身炎癥導(dǎo)致。脂肪組織的M可以處于不同的極性狀態(tài)：經(jīng)典途徑激活的M為M1，能夠促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生；替代激活的M為M2，能夠產(chǎn)生抗炎因子[6,7]。脂肪組織的慢性炎癥不僅可能是由持續(xù)的促炎癥反應(yīng)造成，也可能與機(jī)體的抗炎監(jiān)管機(jī)制失敗有關(guān)。目前關(guān)于肥胖患者EAT組織中M的研究較少。2014年7月1日～2015年4月30日，我們觀察了肥胖大鼠EAT組織中M的計數(shù)變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗動物分組及其飼養(yǎng) 選擇20只成年雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后隨機(jī)分為對照組10只和肥胖組10只。兩組均飲用自配飼養(yǎng)用水(pH 2.5～2.8)，對照組飼以基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗組飼以高脂飼料，自由進(jìn)飲及進(jìn)食。基礎(chǔ)飼料配方：水9.2%，粗蛋白22.1%，粗脂肪5.28%，粗灰粉5.20%，粗纖維4.12%，無氮浸出物52.0%，鈣1.24%，磷0.92%，賴氨酸1.34%，蛋氨酸和胱氨酸共0.72%，能量352 kcal/100 g。高脂飼料配方：豬油20%，白砂糖4%，全脂奶粉2%，膽固醇1%，膽酸鹽0.5%，基礎(chǔ)飼料73%，能量493 kcal/100 g。

1.2 大鼠EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織的獲取及處理 兩組大鼠飼養(yǎng)80 d后，采用頸椎脫臼法將其處死，立即取EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織，清除血液和周圍結(jié)締組織。EAT組織稱重。將所有脂肪組織標(biāo)本分別裝入凍存管，液氮凍存10 min，然后置深低溫冰箱中保存。

1.3 大鼠EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù) 采用免疫組化染色法。取上述冰凍脂肪組織，解凍后用10%中性甲醛固定24 h以上，脫脂、脫水、透明、浸蠟后常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。用水煮加熱法修復(fù)抗原，將脂肪組織切片用5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min；滴加兔抗鼠一抗，包括CD68(檢測M)、CD80(檢測M1)、CD163(檢測M2)抗體，37 ℃孵育1 h；滴加二抗生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min。PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37 ℃孵育20 min；顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染。光鏡下觀察，400倍視野下每張切片隨機(jī)選取4個視野，觀察、記錄M、M1、M2數(shù)目(CD68陽性為M，CD80陽性為M1，CD163陽性為M2)。

2 結(jié)果

肥胖組EAT組織質(zhì)量為(0.45±0.20)g，對照組為(0.30±0.14)g，兩組相比，P<0.05。

兩組大鼠EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)結(jié)果見表1。對照組三個部位脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M2/M、M1/M2相比，P均>0.05。肥胖組EAT、附睪周圍脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2、M2/M與腹股溝脂肪組織相比，P均<0.05；肥胖組EAT組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2、M2/M與附睪周圍脂肪組織相比，P均>0.05；肥胖組EAT組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2、M2/M與對照組相比，P均<0.05。

表1 兩組大鼠EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)結(jié)果[中位數(shù)(全距)]

3 討論

從傳統(tǒng)解剖學(xué)來看，內(nèi)臟脂肪組織應(yīng)該包括胸腹盆腔內(nèi)所有的脂肪組織，但文獻(xiàn)[8～11]資料中提及的脂肪組織均未包括胸腔脂肪組織，這可能與胸腔脂肪組織含量較少、重要性尚未明確有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠的EAT組織質(zhì)量顯著高于對照組，提示EAT同其他部位脂肪類似，隨著體質(zhì)量的升高而增加。冠狀動脈被豐富的EAT組織包圍，后者作為一種內(nèi)臟脂肪，隨著肥胖的發(fā)展，逐漸失去正常功能，脂肪的堆積導(dǎo)致脂肪分解的活躍，大量游離脂肪酸進(jìn)入血液，同時會導(dǎo)致EAT組織內(nèi)分泌功能亢進(jìn)，產(chǎn)生一系列脂肪因子，對于動脈粥樣硬化的形成可能發(fā)揮重要作用[2]。本研究結(jié)果提示減肥有可能降低EAT組織質(zhì)量，這也可能是減肥預(yù)防動脈粥樣硬化的一個重要因素。

本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠EAT、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M2/M、M1/M2相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果提示正常體質(zhì)量者的皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪均處于正常功能狀態(tài)，無明顯炎癥改變。與之相反，肥胖組大鼠EAT組織、附睪周圍脂肪、腹股溝脂肪組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M2/M、M1/M2不同，表現(xiàn)為附睪脂肪組織和EAT組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2顯著高于皮下脂肪，而M2/M顯著低于皮下脂肪。這一結(jié)果提示肥胖對內(nèi)臟脂肪組織慢性炎癥程度的影響要大于皮下脂肪組織。已知皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上均存在明顯差異，過多的內(nèi)臟脂肪堆積更容易導(dǎo)致胰島素抵抗、血脂紊亂、糖尿病和心血管疾病[2,12]。本研究也證實(shí)，與皮下脂肪組織相比，肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織具有更多的M。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，與皮下脂肪和腎周脂肪組織相比，冠狀動脈周圍的脂肪組織在形態(tài)學(xué)和功能上均不同。但是在本研究中，同樣為內(nèi)臟脂肪，附睪脂肪組織和EAT組織中的M、M1、M2計數(shù)及M1/M、M1/M2差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮除了與物種的差異有關(guān)之外，標(biāo)本選取的時機(jī)也可能是一個原因。EAT組織炎癥與動脈斑塊炎癥相互影響、相互促進(jìn)，從而形成局部炎癥的惡性循環(huán)[3]。本研究的大鼠可能尚未發(fā)生嚴(yán)重的冠脈粥樣硬化斑塊而未形成炎癥的惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致附睪脂肪組織和EAT組織的炎癥嚴(yán)重程度未顯示出差異，可能還需要長期的、動態(tài)的觀察。

本研究結(jié)果顯示，肥胖組EAT組織的M、M1、M2、M1/M、M1/M2顯著高于對照組，而M2/M顯著低于對照組，與文獻(xiàn)[13]報道相符。EAT組織作為血管的支撐組織，與冠狀動脈的血管外膜直接接觸。血管外膜并非僅起支持及營養(yǎng)作用，外膜的成纖維細(xì)胞具有內(nèi)分泌功能，其分泌的炎癥因子也參與動脈粥樣硬化進(jìn)程[13]。陳新忠等[13]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者冠狀動脈外膜有大量M浸潤，在血管外膜與EAT交界處可見明顯M聚集帶。從本研究結(jié)果來看，這些M極有可能是來自于EAT。推測M導(dǎo)致的EAT組織慢性炎癥在冠脈粥樣硬化的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠EAT組織中增多的M，不僅是促炎反應(yīng)的M1增多，抗炎反應(yīng)的M2也增多，M2的這種改變可能是機(jī)體對抗肥胖導(dǎo)致的慢性炎癥的一種代償。但是這種代償難以完全代償，表現(xiàn)為M2/M下降、M1/M2升高，提示M2相對減少，促炎反應(yīng)仍然占了主導(dǎo)地位。因此，降低M1或促進(jìn)M1轉(zhuǎn)化為M2可能有助于肥胖患者冠狀動脈粥樣硬化的預(yù)防。賀強(qiáng)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，游泳訓(xùn)練可有效降低小鼠附睪脂肪組織M1數(shù)量、提高M(jìn)2數(shù)量。羅雯靜等[15]發(fā)現(xiàn)，不同種類脂肪酸可能通過PPARγ/NF-κB相關(guān)信號通路參與M1/M2的轉(zhuǎn)化，其中多不飽和脂肪酸能抑制M1極化。因此，運(yùn)動和富含多不飽和脂肪酸的飲食如深海冷水魚類(如鮭魚、鯖魚等)、海藻或深海魚油將有助于緩解肥胖者EAT組織的慢性炎癥。最近有研究[16,17]發(fā)現(xiàn)，在體外，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能抑制M1的特異性基因表達(dá),促進(jìn)M2特異性基因的表達(dá),并使M1向M2轉(zhuǎn)化。這一研究結(jié)果提示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在預(yù)防肥胖患者EAT慢性炎癥中有較好的應(yīng)用前景，但需要體內(nèi)研究的進(jìn)一步證實(shí)。

總之，本研究結(jié)果表明，肥胖大鼠具有更多的EAT組織，其EAT組織中M數(shù)量增多，但M2數(shù)量相對減少，促進(jìn)M1轉(zhuǎn)化為M2可能有助于預(yù)防肥胖患者冠狀動脈粥樣硬化。

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山東省教育廳科研計劃項目(J13LK55)。

路新磊(E-mail: zhangcaikun666@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.014

R392.3

A

1002-266X(2016)43-0047-03

2016-09-11)