郭曉萍，周旖旎，曹詣斌

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

HIF-1反義核酸對金魚HIF-1α及其靶基因VEGF表達(dá)水平的影響

郭曉萍，周旖旎，曹詣斌

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

金魚是低氧耐受能力最強的淡水魚類之一，低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainducedfactor，HIF-1）在動物低氧應(yīng)答調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，目前尚沒有關(guān)于魚類HIF-1抑制劑的研究報道。試驗分析了HIF-1反義寡聚核苷酸對金魚肝臟組織HIF-1及其靶基因血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growthfactor，VEGF）的基因表達(dá)差異。熒光定量PCR結(jié)果顯示，低氧狀態(tài)下，30，60mg/kg劑量的反義核酸能有效抑制VEGF基因的表達(dá)，但對HIF-1α mRNA水平?jīng)]有影響。制備金魚HIF-1兔源多克隆抗體并進(jìn)行WesternBlot分析，結(jié)果顯示，60 mg/kg劑量的反義核酸抑制低氧所誘導(dǎo)的HIF-1蛋白水平的上升，表明合成的反義核酸能夠特異性地抑制金魚HIF-1 mRNA的翻譯。金魚HIF-1抗體的合成及反義寡聚核苷酸的制備，可為進(jìn)一步探索金魚獨特的低氧應(yīng)答機制提供有效研究手段。

HIF-1；反義核酸；低氧；金魚

低氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧信號調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，由一個α亞基和一個β亞基組成[1]。HIF-1的氧敏感調(diào)控主要發(fā)生在HIF-1α亞基。常氧狀態(tài)下，HIF-1α在相關(guān)功能域的作用下降解。低氧條件下，降解途徑被中斷，HIF-1α的穩(wěn)定性提高并積累。激活后的HIF-1在其他轉(zhuǎn)錄因子的共同作用下，與靶基因的低氧應(yīng)答元件相結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)，如葡萄糖代謝途徑的己糖激酶（HK）和乳酸脫氫酶（LDH），血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）等[2]。VEGF是血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，使毛細(xì)血管的通透性增加。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移都與新生血管形成有關(guān)[3]。

人們對HIF-1小分子抑制劑進(jìn)行了多方面的研發(fā)，如影響HIF-1α蛋白合成和降解、HIF-1α和HIF-1β二聚化作用、HIF-1α和DNA的結(jié)合等[4]。但是，目前還未獲得成功上市的特異性HIF-1抑制劑。反義寡聚脫氧核酸（antisense oligonucleotide，反義DNA）是一種短序列單鏈DNA片段，它與目標(biāo)mRNA的一個或多個位點互補，從而減少或抑制由該基因所編碼多肽的合成[5]。反義DNA可以在mRNA的剪接、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制基因的表達(dá)[6]。反義DNA特異性較強，作用迅速，具有局部抑制特性和可逆性，在試驗動物模型建立中比較經(jīng)濟、方便且毒副作用較低[7-8]。

金魚（Carassius auratus）作為鯽魚的變種，是低氧耐受能力最強的淡水魚類之一，可能是迄今唯一一種能在室內(nèi)不依賴氣泵而長期生存的魚類。金魚擁有一系列獨特的低氧適應(yīng)生理機制，但相關(guān)機制的分子調(diào)控機理及其與HIF-1之間的關(guān)系尚不明確。本研究擬通過金魚HIF-1反義寡聚核苷酸抑制劑和多克隆抗體的制備，為金魚耐低氧分子機制的研究提供有效分析方法。

1 材料和方法

1.1 材料

金魚體質(zhì)量10～15 g，購于金華市花鳥市場。實驗室魚缸中馴化4～5 d，以商品化魚食喂養(yǎng)，馴化養(yǎng)殖期間均活動正常，無病，試驗前1 d停止投餌。

1.2 試驗藥物與條件

根據(jù)金魚HIF-1α序列，硫代反義寡聚核苷酸序列為AAAGCCTCAAGTGTCCCAT[9]，由賽百勝公司合成。注射前用魚類生理鹽水（A液：1mol/L NaCl，0.03 mol/L KCl，0.01 mol/L MgSO4·7H2O，0.1 mol/L KH2PO4；B液：0.025 mol/L CaCl2；C液：0.25 mol/L NaHCO3。使用時，每100mL蒸餾水中各加入10mL A液、B液和C液）將反義核酸稀釋，常氧生理鹽水組與低氧生理鹽水組各注射200 μL生理鹽水，試驗組分別注射30，60 mg/kg劑量的反義寡聚核苷酸。藥物注射后常氧狀態(tài)下培養(yǎng)12 h。

1.3 低氧處理

選擇身體健康、反應(yīng)靈敏、大小基本一致的金魚，隨機取魚分組，分為常氧生理鹽水組、低氧生理鹽水組、低氧反義核酸組，每組4只。試劑注射前，統(tǒng)一以1.5 g/L的MS222水溶液進(jìn)行麻醉處理。待輕觸其頭部反應(yīng)遲鈍時，迅速抓取，采用腹腔注射法，分別給對照組注射生理鹽水溶液，試驗組注射反義核酸溶液。注射完成后，將魚體放回正常生長的自來水中，使其自行蘇醒。12 h后，試驗組進(jìn)行低氧處理。在低氧處理過程中，持續(xù)充入氮氣使氧濃度水平保持為2 mg/L，采用溶氧儀（DISSOLVED OXYGEN METER AZ8403）檢測氧含量。在低氧處理6 h后，取出魚體，于MS222水溶液中麻醉后，解剖提取肝臟組織并迅速放入液氮后，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Real Time PCR

將肝臟組織從-80℃超低溫冰箱取出，用Trizol法提取肝組織樣品的總RNA，進(jìn)行RT-PCR。參照TOYOBO公司ReverTra AceqPCR RT Kit說明操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于Real Time PCR（RT-PCR）。

Real Time PCR用 Thunderbird SYBRRqPCR Mix試劑盒（Toyobo）和ABI Stepone plus熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR分析，檢測HIF-1α及其靶基因VEGF基因表達(dá)水平差異。擴增反應(yīng)總體系為20μL，其中包括：SYBR GREENⅡ，10 μL；cDNA，2 μL；引物F/R，各0.4 μL；ROX，0.4 μL；ddH2O，6.8 μL。反應(yīng)條件：98℃，10min；98℃，30 s；55℃，45 s。40個循環(huán)后，進(jìn)行溶解曲線反應(yīng)，條件98℃，30 s；55℃，45 s。采用ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.5 Western Blot檢測

以金魚 HIF-1α 759～774位氨基酸序列（CHLLQGEELLRALDQVN）合成多肽作為抗原，免疫兔子4次10周。分離血清，間接ELISA檢測抗體效價達(dá)到1∶60 000以上，特異性多肽親和純化，Western Blot檢測抗體特異性。

從-80℃超低溫冰箱取出金魚肝臟組織，放入加有300μL RIPA與5 μL PMSF的EP管內(nèi)，用組織細(xì)胞破碎儀破碎3次，每次10 s，至液體澄清，再向EP管內(nèi)加入200 μL RIPA，12 000×g，4℃，離心10min。取上清30 μL，加入7.5μL 5×SDS上樣緩沖液，99℃，10 min變性。變性后的樣品進(jìn)行Western Blot檢測。12%SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉90 min，4℃一抗孵育過夜，37℃孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔2 h，最后以ECL顯色法（碧云天，特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒）進(jìn)行顯色成像（Tanon6600成像儀）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗重復(fù)4次，數(shù)據(jù)采用Excel軟件統(tǒng)計和做圖，組間差異采用t檢驗進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIF-1α及其靶基因VEGF熒光定量PCR

30 mg/kg（圖1-A）和60 mg/kg劑量（圖1-C）的反義寡聚核苷酸處理，HIF-1α mRNA水平常氧對照組和低氧處理組相比均無顯著差異，表明反義DNA基本不影響金魚HIF-1α mRNA水平。作為HIF-1α的靶基因，VEGF mRNA水平在低氧誘導(dǎo)下顯著上升，而30 mg/kg（圖1-B）和60 mg/kg劑量（圖1-D）的反義寡聚核苷酸處理均顯著抑制低氧對VEGF的誘導(dǎo)表達(dá)作用。

2.2 金魚 HIF-1多克隆抗體 ELISA檢測與Western Blot鑒定

采用間接ELISA方法檢測效價，結(jié)果顯示，經(jīng)過4次免疫兔子后，獲得的血清和純化抗體效價分別達(dá)到1∶60 000和1∶20 000（圖2-A）。Western Blot檢測金魚肝臟樣本在約120 kD處出現(xiàn)目的條帶（圖2-B）。

2.3 反義寡聚核苷酸處理抑制金魚肝臟HIF-1的蛋白水平

Real Time PCR的結(jié)果顯示，在基因水平30，60mg/kg劑量的反義DNA基本不影響金魚HIF-1α mRNA水平，因此，挑取高劑量處理組在蛋白水平分析反義DNA對HIF-1蛋白表達(dá)的影響。從圖3可以看出，與常氧處理組相比，金魚肝臟HIF-1蛋白水平在低氧處理6 h后升高；而反義核酸藥物處理使低氧組金魚肝臟HIF-1蛋白水平與常氧處理組無顯著差異，表明所合成的反義DNA可以通過阻礙HIF-1α mRNA的翻譯，抑制金魚HIF-1蛋白的表達(dá)。

3 討論

改善實體腫瘤中的低氧微環(huán)境是目前腫瘤治療的一個方向，針對HIF-1小分子抑制劑的研發(fā)是其中的重點[10]。對于HIF-1具有抑制作用的小分子化合物已有多種，且大多都是通過級聯(lián)反應(yīng)間接影響HIF-1[11]。目前已報道的HIF-1小分子抑制劑在抑制HIF-1的表達(dá)、穩(wěn)定性、翻譯活性或核內(nèi)運輸?shù)冗^程的同時，往往還具有其他已知或未知的生理生化效應(yīng)，對研究結(jié)果的分析造成一定困難。本研究首次將HIF-1反義核酸抑制劑應(yīng)用于硬骨魚類，發(fā)現(xiàn)所合成的反義核酸能有效抑制金魚HIF-1 mRNA的翻譯及其靶基因VEGF的表達(dá)，表明HIF-1反義核酸抑制劑可在金魚低氧應(yīng)答分子機制研究中發(fā)揮作用。

本研究采用金魚HIF-1α 759～774位合成多肽作為抗原制備多克隆抗體，Western Blot檢測在約120 kD處出現(xiàn)目的條帶（而不是根據(jù)其氨基酸序列預(yù)測的90 kD），這與哺乳動物HIF-1 Western Blot檢測結(jié)果一致[12]，可能和HIF-1α的翻譯后修飾有關(guān)。作為鯉形目魚類第一個HIF-1多克隆抗體，金魚HIF-1抗體的制備有助于硬骨魚類特別是鯉科魚類HIF-1蛋白水平的表達(dá)調(diào)控分析。

［1］章湝，任紀(jì)龍，沈靈燕，等.青海湖裸鯉HIF-2α基因的克隆及其ODD功能域羥化分析 [J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2014（5）：410-412.

［2］Lee J W，Bae S H，Jeong J W，et al.Hypoxia-inducible factor（HIF-1）alpha：itsprotein stabilityand biological functions[J].Exp Mol Med，2004，36（1）：1-12.

［3］李寶江，朱志華，王軍業(yè)，等.Ki67、P53、VEGF和C-erbB-2在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性研究及其臨床意義 [J].癌癥，2004（10）：1176-1179.

［4］Onnis B，Rapisarda A，Melillo G.Development of HIF-1 inhibitors for cancer therapy[J].J Cell Mol Med，2009，13（9A）：2780-2786.

［5］Scarbrough K.Use of antisense oligodeoxynucleotides to study biological rhythms[J].Methods，2000，22（3）：255-260.

［6］Stein C A，Cohen J S.Oligodeoxynucleotides as inhibitors of gene expression：a review [J].Cancer Research，1988，48（10）：2659-2668.

［7］王凌燕，楊曉運.反義DNA技術(shù)研究進(jìn)展及其在動物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2003（1）：62-65.

［8］ Crooke S T.Potential roles of antisense technology in cancer chemotherapy[J].Oncogene，2000，19：6651-6659.

［9］Dikmen Z G，GellertG C，Dogan P，etal.In vivo and in vitro effects ofaHIF-1alpha inhibitor，RX-0047[J].J Cell Biochem，2008，104（3）：985-994.

［10］Xia Y，Choi H K，Lee K.Recent advances in hypoxia-inducible factor（HIF）-1 inhibitors[J].Eur J Med Chem，2012，49：24-40.

［11］Semenza G L.Evaluation of HIF-1 inhibitors as anticancer agents [J].DrugDiscov Today，2007，12（19/20）：853-859.

［12］Jones N M，Lee E M，Brown T G，et al.Hypoxic preconditioning produces differential expression of hypoxia-inducible factor-1alpha（HIF-1alpha）and its regulatory enzyme HIF prolyl hydroxylase 2 in neonatal rat brain[J].Neurosci Lett，2006，404（1/2）：72-77.

Effect of HIF-1 Antisense Oligonucleotide Inhibitor on the Expression Level of HIF-1α and Its Target Gene VEGF in Goldfish

GUOXiaoping，ZHOU Yini，CAOYibin
（CollegeofChemistryandLifeSciences，ZhejiangNormal University，Jinhua321004，China）

Goldfish may be the most hypoxia-tolerant freshwater fish in teleost,and hypoxia induced factor（HIF-1）is a master regulator of oxygen homeostasis in animals.Until now,there is still noreport on the HIF-1 inhibitor in teleost.This study analyzed the effectofHIF-1antisenseoligonucleotideinhibitorontheexpressionofHIF-1α anditstargetgeneVEGF inlivertissuesofgoldfish.Real timePCR showedthatantisenseoligonucleotideatadoseof30mg/kgand60mg/kgcouldbotheffectivelydown-regulatethemRNA level of VEGF.However,treatment with antisense oligonucleotide had no detectable effect on HIF-1α mRNA levels under hypoxia.A polyclonal antibody for goldfish HIF-1 was produced and implied in Western Blot analysis.Antisense oligonucleotide at a dose of 60 mg/kg inhibited the hypoxia-induced up-regulation of HIF-1 protein levels in liver tissues of goldfish,which suggested that the antisense oligonucleotide inhibitor could specially repress the translation of HIF-1α mRNA.The production of HIF-1 antibody and antisenseoligonucleotideinhibitorcouldofferauseful waytoinvestigatethemolecularmechanismofhypoxiatoleranceingoldfish.

HIF-1;antisensenucleic acid;hypoxia;goldfish

S965.811

A

1002-2481（2016）07-0914-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.06

2016-02-26

國家自然科學(xué)基金項目（31371209）

郭曉萍（1989-），女，安徽宿州人，在讀碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。周旖旎為共同第一作者。曹詣斌為通信作者。