劉芙蓉，郝勝菊，王 興，鄭 雷，閆有圣

(甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中心，蘭州 730050)

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·論 著·

甘肅地區(qū)孕婦孕中期干血斑產(chǎn)前篩查結(jié)果分析

劉芙蓉，郝勝菊△，王 興，鄭 雷，閆有圣

(甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中心，蘭州 730050)

目的 通過檢測孕婦的干血斑甲胎蛋白(AFP DBS)、干血斑游離絨毛膜促性腺激素-β亞基(free-βhCG DBS)濃度，對孕中期胎兒患唐氏綜合征(DS)、18-三體綜合征(ES)和神經(jīng)管畸形(ODNT)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估。方法 運(yùn)用時(shí)間分辨熒光法定量測定孕婦干血斑中AFP DBS、Free-βhCG DBS濃度，采用Life cycle 3.2軟件計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果 5 001例孕婦中高齡65例，占總篩查人數(shù)的1.3%，其中DS、ES和ONTD的陽性篩查率分別為3.7%(185/5 001)、0.4%(20/5 001)和4.3%(215/5 001)。確診陽性病例8例，其中高齡5例。結(jié)論 孕婦孕中期干血斑DS產(chǎn)前篩查對實(shí)現(xiàn)質(zhì)控統(tǒng)一管理，提高篩查覆蓋度，降低出生缺陷有重要意義。

孕中期； 唐氏綜合征； 干血斑產(chǎn)前篩查

唐氏綜合征(DS)產(chǎn)前篩查是采用簡單、方便、易行、無創(chuàng)的檢測方法，在廣大孕婦人群中篩查出懷有某些先天缺陷的高危胎兒的高危個(gè)體。DS是先天缺陷的主要疾病之一，目前尚無有效治療手段，唯一可行的干預(yù)措施是通過產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷盡早發(fā)現(xiàn)，及時(shí)終止妊娠，有效預(yù)防和減少DS患兒出生，降低出生缺陷，提高人口素質(zhì)。目前，我國DS產(chǎn)前篩查的主要模式為孕中期孕婦血清二聯(lián)或三聯(lián)篩查，但覆蓋率不高，偏遠(yuǎn)貧困地區(qū)仍無法開展DS篩查。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國發(fā)達(dá)地區(qū)篩查率可達(dá)50%，篩查覆蓋率全國平均僅為13%，明顯落后發(fā)達(dá)國家[1-2]。同時(shí)，血樣轉(zhuǎn)運(yùn)困難，篩查中心分散，質(zhì)控管理難度大、成本高。DS干血斑產(chǎn)前篩查技術(shù)由于其具有標(biāo)本采集簡單、轉(zhuǎn)運(yùn)成本低廉、標(biāo)本穩(wěn)定性增強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一性提高、便于質(zhì)控管理等優(yōu)勢，適合偏遠(yuǎn)不發(fā)達(dá)地區(qū)提高產(chǎn)篩覆蓋率。本研究通過對2015年1～6月甘肅地區(qū)孕婦孕中期干血斑產(chǎn)前篩查的結(jié)果進(jìn)行分析，闡明其在產(chǎn)前篩查中的優(yōu)勢及局限。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1～6月甘肅省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行孕中期干血斑產(chǎn)前篩查的孕婦5 001例。孕婦知情同意并填寫產(chǎn)前篩查申請單，孕周15～20周+6，其中65例年齡大于35歲，平均年齡28.65歲。月經(jīng)規(guī)律者根據(jù)末次月經(jīng)推算孕周，月經(jīng)不規(guī)律者以B超測得胎兒雙頂徑(BPD)推算孕周。

1.2 標(biāo)本采集 制作濾紙干血片標(biāo)本，參照2010年《新生兒篩查技術(shù)規(guī)范》要求制作保存血膜，濾紙采用貴州里定生物科技有限公司生產(chǎn)的血標(biāo)本采集卡，血斑制作采用可控式點(diǎn)血器法(DIFF-SAFE)[3]，制備直徑大于10 mm的濾紙血斑3個(gè)，于室溫下干燥后，密封于4 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 試劑與方法 儀器采用芬蘭Wallac公司生產(chǎn)的DELFLA-1235型全自動時(shí)間分辨免疫熒光分析儀進(jìn)行測定。檢測試劑盒運(yùn)用蘇州新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的干血斑甲胎蛋白與游離人絨毛膜促性腺激素-β亞基(AFP/Freeβ-HCG DBS)雙標(biāo)試劑盒。

1.4 檢測方法 用直徑為3.2 mm的打孔器在血斑半徑1/2 處打下待檢血斑1個(gè)于反應(yīng)微孔中，其中將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品各2個(gè)(復(fù)孔)于相應(yīng)反應(yīng)微孔中，上機(jī)選擇相應(yīng)AFP/Free-hCGbβDBS程序進(jìn)行檢測。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評估 采用PE公司提供的Life cycle3.2軟件結(jié)合孕婦年齡、體質(zhì)量、孕周、是否吸煙及相關(guān)病史等因素，將血斑測定值換算成中位數(shù)倍數(shù)值(MOM值)，計(jì)算胎兒患DS、18-三體綜合征(ES)及神經(jīng)管畸形(ONTD)的風(fēng)險(xiǎn)率。DS風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀禐?/270；ES風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀禐?/350,ONTD風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀禐镸OM≥2.5。對篩查出的高危妊娠孕婦，在本人知情同意的情況下，建議接受羊膜腔穿刺，進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析，對篩查對象追蹤隨訪至胎兒出生。

2 結(jié) 果

2.1 篩查結(jié)果 本中心共接收5 001例進(jìn)行DS孕中期產(chǎn)前篩查的干血斑，其中篩出DS高風(fēng)險(xiǎn)185例，ES高風(fēng)險(xiǎn)20例,ONTD高風(fēng)險(xiǎn)215例。其中年齡大于35歲的孕婦共65例，占篩查人群的1.3%。DS的初篩陽性率為3.7%(185/5 001)，ES的初篩陽性率為0.4%(20/5 001)，ONTD的初篩陽性率為4.3%(215/5 001)，總陽性篩查率為8.4%(470/5 001)。見表1。

表1 各年齡組DS陽性篩查率

2.2 各孕周不同標(biāo)記物的中位數(shù)濃度及MOM值 本研究中所有待檢孕婦的孕周均介于15～20周+6，干血斑甲胎蛋白(AFP DBS)與干血斑游離絨毛膜促性腺激素-β亞基(free-βhCG DBS)兩種標(biāo)記物在各孕周均有差異，其中AFP DBS隨孕周的增加而逐漸增高，妊娠15周的中位數(shù)濃度為24.16 mU/L，妊娠20周升高至43.25 mU/L；free-βhCG DBS隨孕周的增加中位數(shù)濃度逐漸降低，妊娠15周的中位數(shù)濃度為36.53 ng/mL，妊娠20周下降至15.75 ng/mL。見表2。

表2 各孕周不同標(biāo)記物的中位數(shù)濃度及MOM值

2.3 陽性確診病例結(jié)果分析 初篩陽性患者在本院產(chǎn)前診斷中心接受羊膜腔穿刺，進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析，妊娠結(jié)局是確診陽性患者8例，其中高齡5例，確診21-三體胎兒5例，18-三體胎兒1例，超雌胎兒1例，克氏綜合征1例。篩查低風(fēng)險(xiǎn)孕婦中至今無DS、ES及ONTD患兒出生。其染色體核型分析結(jié)果見表3。

表3 染色體異常兒的篩查結(jié)果

續(xù)表3 染色體異常兒的篩查結(jié)果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

3.1 實(shí)施產(chǎn)前篩查在我國普及難度大,而以濾紙干血斑作為母血載體進(jìn)行DS產(chǎn)前篩查經(jīng)濟(jì)簡便[4],成為目前的研究熱點(diǎn)之一。干血斑DS產(chǎn)前篩查結(jié)果顯示，生育患兒風(fēng)險(xiǎn)隨年齡增長而增長。Wald等[5]報(bào)道，僅通過年齡對DS產(chǎn)前篩查檢出率可達(dá)30%。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，所有出生的DS患兒中35歲以前婦女娩出的占30%,35歲以后的婦女娩出70%[6]。Merkatz等[7]將血清甲胎蛋白(AFP)應(yīng)用于DS產(chǎn)前篩查,結(jié)合年齡因素可將檢出率提高20%。將不同標(biāo)志物的擬然比相乘，再乘以孕婦年齡特異性風(fēng)險(xiǎn)得到孕婦DS風(fēng)險(xiǎn)值,若評估風(fēng)險(xiǎn)等于或高于截?cái)嘀?/270，為篩查高風(fēng)險(xiǎn)，需行羊水穿刺；若風(fēng)險(xiǎn)介于1/270～1/1 000，為臨界風(fēng)險(xiǎn)，需行羊水穿刺或無創(chuàng)產(chǎn)前篩查；若風(fēng)險(xiǎn)低于1/1 000，則為低風(fēng)險(xiǎn)，需后續(xù)觀察，做好妊娠隨訪。

AFP主要來源于胎兒肝臟和卵黃囊,由胎肝細(xì)胞合成,胎兒血中AFP通過被動傳遞方式進(jìn)入母血和羊水。母血中AFP在妊娠15周開始上升,孕32～34周達(dá)到高峰。若胎兒神經(jīng)管發(fā)育異常,致使更多AFP進(jìn)入羊水，則AFP異常升高。DS胎兒由于肝臟發(fā)育不成熟,AFP合成減少,所以母血中含量相應(yīng)下降。本研究將AFP DBS作為干血斑產(chǎn)前篩查的指標(biāo)之一，其原理與血清學(xué)相同[8]。

絨毛促性腺激素(hCG)由a和β兩個(gè)亞基構(gòu)成,檢測β亞基可避免交叉反應(yīng),能更好地反映胎盤功能及胎兒狀況。大約1%的β亞基以游離形式存在。hCG受精后進(jìn)入母血并快速增殖至孕8周,隨后濃度逐漸降低至孕18～20周并保持穩(wěn)定。據(jù)報(bào)道，總hCG在產(chǎn)前篩查應(yīng)用中檢出率低于free-βhCG[9]。DS患兒的成熟度較正常胎兒晚,雖然妊娠已進(jìn)入中期,hCG及free-βhCG β仍處于高濃度水平,同時(shí)胎盤滋養(yǎng)葉中的巨噬細(xì)胞分泌的水解酶將hCG裂解成a、β亞基,DS患兒或胎盤惡性腫瘤母體的水解酶活性增加,使free-βhCG β濃度更高[10]。本研究將free-βhCG DBS作為干血斑產(chǎn)前篩查的指標(biāo)之一，其原理與血清學(xué)相同。

3.2 1963年有研究者首次將干血斑法應(yīng)用于新生兒先天性代謝性疾病的篩查,此后干血斑法由于其優(yōu)勢及可行性廣泛應(yīng)用于其他領(lǐng)域,如藥物代謝、病毒快速診斷等大規(guī)模篩查,是一項(xiàng)應(yīng)用較為成熟的方法[11-13]。近年來,由于PCR等微量擴(kuò)增及檢測技術(shù)的進(jìn)步,干血斑的應(yīng)用更取得了長足進(jìn)步。

干血斑DS產(chǎn)前篩查的優(yōu)勢如下：(1)標(biāo)本采集簡便。血斑法采用DIFF-SAFE將血斑均勻滴注至血片,自然晾干，采血量少，簡化了血清學(xué)離心、血清分離等步驟,減少了血清處理過程中病毒感染傳播的風(fēng)險(xiǎn)[14]。據(jù)報(bào)道，人類免疫缺陷病毒(HIV)-1、HIV-2、丙型肝炎病毒等在血斑自然干燥過程中已喪失傳染性,但某些高滴度病毒(如HBV)即使在干血斑中也能存活7 d[15]；(2)經(jīng)濟(jì)學(xué)優(yōu)勢。干血斑血液采集簡便,轉(zhuǎn)運(yùn)僅需密封袋密閉或郵寄,降低了血清學(xué)方法冷鏈運(yùn)輸?shù)馁M(fèi)用,適于偏遠(yuǎn)地區(qū)普及篩查度；(3)干血斑有利于檢測物質(zhì)保存。如AFP DBS血斑可在37 ℃密封保存1個(gè)月，4 ℃保存半年。free-βhCG DBS血斑可在4 ℃保存1 d,-20 ℃保存131年。但高溫過高穩(wěn)定性下降,據(jù)報(bào)道若溫度高于30 ℃，則AFP DBS 的保存不超過24 h。free-βhCG DBS于20 ℃可保存87.3 h，30 ℃以上保存不超過6 h[16-20]。

MOM值是該指標(biāo)實(shí)際測定的濃度值與同孕周健康人群中位數(shù)之比，體現(xiàn)了測定值偏離正常值的程度和方向。若系統(tǒng)長期保持穩(wěn)定，中位數(shù)設(shè)置準(zhǔn)確合理，MOM值應(yīng)趨于1.0左右波動，假陽性率和檢出率波動不大；若系統(tǒng)發(fā)生調(diào)整，中位數(shù)設(shè)置不準(zhǔn)確，則MOM值將逐漸偏離1.0，降低篩查效率。本研究中，MOM的正常參考范圍分別為AFP DBS介于0.7～2.5 MOM，free-βhCG DBS介于0.25～2.5 MOM。當(dāng)AFP DBS≥2.5 MOM時(shí)，篩查結(jié)果為ONTD高風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)free-βhCG DBS≥2.5 MOM時(shí)，篩查結(jié)果為DS高風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)free-βhCG DBS<0.25時(shí)，常導(dǎo)致ES高風(fēng)險(xiǎn)。表2中各孕周free-βhCG DBS的MOM值穩(wěn)定在1.0左右波動，而AFP DBS的MOM值較1.0偏大，檢查篩查過程，徹底清潔打孔鉗，充分晾干后，于血斑中心至邊緣1/2處打孔，消除新生兒AFP暫時(shí)性增高，不同打孔部位血斑濃度差異等因素的影響。積累大量數(shù)據(jù)后，調(diào)整各項(xiàng)指標(biāo)MOM值，建立甘肅地區(qū)正常孕婦干血斑中孕期濃度的平均水平，合理修正中位數(shù)曲線標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，提高檢出率和篩查效率。同時(shí)，繪制實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控，每批實(shí)驗(yàn)free-βhCG DBS的變異系數(shù)(CV)值均低于5%，AFP DBS的CV值均低于10%，符合“新生兒篩查技術(shù)規(guī)范”中要求的CV值低于10%，證明實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性強(qiáng)，free-βhCG DBS指標(biāo)的穩(wěn)定性優(yōu)于AFP DBS。

3.3 目前我國城市居民產(chǎn)前篩查的覆蓋率僅為30%,而中小城市及偏遠(yuǎn)地區(qū)未能實(shí)現(xiàn)DS產(chǎn)前篩查的普及。因此,尋找一種方便快捷、切實(shí)可行的篩查方法,對降低我國出生缺陷勢在必行。本研究中干血斑DS產(chǎn)前篩查的總陽性篩查率為8.4%，假陽性率較高。經(jīng)妊娠隨訪后，確診8例陽性，其中5例為年齡高風(fēng)險(xiǎn)，與高齡是DS發(fā)病的主要因素相吻合。同時(shí)，篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中確診21-三體胎兒5例，18-三體胎兒1例，超雌胎兒1例，克氏綜合征1例；篩查低風(fēng)險(xiǎn)孕婦中至今無DS、ES及ONTD患兒出生。由于Life Cycle軟件自帶的中位數(shù)值來自于高加索人群干血斑濃度,與本研究人群存在地域及人種等方面的差異,且本研究的樣本量不大，可能產(chǎn)生MOM值偏移。據(jù)此，在今后的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量，獲取大樣本的本地中位數(shù)值,使MOM值分布為中值和眾數(shù)均接近1的單峰分布,從而找出最佳中位數(shù)的擬合曲線,建立更適合本地人群的風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀?，?yōu)化干血斑產(chǎn)前篩查體系,加大產(chǎn)前篩查在我國的普及力度。

[1]Massé J,Summers A,Cherian G,et al.Transportation of maternal serum specimens for screening for chromosomal aneuploidies:effect of seasonal variations,distance,and freezing on the stability of the biological markers[J].Clin Biochem,2000,33(4):273-277.

[2]De Souza E,Alberman E,Morris JK.Down′s syndrome:screening and antenatal diagnosis regionally in England and Wales 1989-2008[J].J Med Screen，2010，17(4):170-175.

[3]成艷,武雅俐,劉郁明，等.產(chǎn)前篩查干血片三種采集方法檢測結(jié)果的應(yīng)用研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2013,21(9):67.

[4]Mizejewski GJ,Bellisario R,Beblowski DW,et al.Commercial radioimmunoassay kit for measurement of alpha-fetoprotein adapted for use with dried blood specimens from newborns[J].Clin Chem，1982，28(5):1207-1210.

[5]Wald NJ,Densem JW,George L,et al.Inhibin-A in Down′s syndrome pregnancies:revised estimate of standard deviation[J].Prenat Diagn，1997，17(3):285-290.

[6]Newberger DS.Down syndrome:prenatal risk assessment and diagnosis[J].Am Fam Physician，2000，62(4):825-832.

[7]Merkatz IR,Nitowsky HM,Macri JN,et al.An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities[J].Am J Obstet Gynecol，1984，148(7):886-894.

[8]劉霞,張莉,周玉霞.唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查的研究進(jìn)展[J].中國婦幼保健，2010,25(6):859-863.

[9]Stevenson HP,Leslie H,Sheridan B.Serum free beta-human chorionic gonadotrophin concentrations increase in unseparated blood specimens[J].Ann Clin Biochem，1993，30(1):99-100.

[10]George JK.HCG and the freeP-subunit as screening tests for down syndrome[J].Prenat Diagn,1998,18(2):235-245.

[11]Heam TL,Hannon WH.Interlaboratory surveys of the quantitation of thyroxin and thyrotropin in dried blood-spot specimens[J].Clin Chern,1982,28(2):2022-2025.

[12]Hoffillan BR,Yu H,Diamandis EP.Assay of prostate-specific antigen from whole blood spotted on filter paper and applieation to prostate cancer sereening[J].Clin Chern,1996,42(4):536-544.

[13]Castro AC,Borges LG,Souza RS,et al.Evaluation of the human immunodeficiency virus type 1 and 2 antibodies detection in dried whole blood spots (DBS) samples[J].Rev Inst Med Trop Sao Paulo,2008,50(3):151-156.

[14]Hoffman BR,Yu H,Diamandis EP.Assay of prostate-specific antigen from whole blood spotted on filter paper and application to prostate cancer sereening[J].Clin Chern,1996,42(4):536-544.

[15]Castro AC,Borges LG,Souza RS,et al.Evaluation of the human immunodeficiency virus type1 and 2 antibodies detection indried whole blood spots (DBS) samples[J].Rev Inst Med Trop Sao Paulo,2008,50(3):151-156.

[16]Gerald JM,Ronald B,Diane WB,et al.Commercial Radioimmunoassay Kit for Measurement of Aipha-Fetoprotein Adapted for Use with Dried Blood Speeimens from Newborns[J].Clin Chem,1982,28(5):1207-1210.

[17]Rashed MS,Ozand PT,Bucknall MP,et al.Dignosis of inborn errors of metabolism from blood spots by acylcarnitines and amino acids Profiling using antomated eleetrospray tandem mass spectrometry[J].PediatrRes,1995,38(3):324-331.

[18]Wu JT,Knight JA.In-vitro stability of human alpha-fetoprotein[J].Clin Chem,1985,31(10):1692-1697.

[19]SpencerK,MacriJN,CarpenterP,etal.

Stability of intact chorionic gonadotropin (hCG) in serum,liquid whole blood,and dried whole-blood filter-paper spots:impact on screening for Down syndrome by measurement of free hCG subunit[J].Clin Chem，1993,39(6):1064-1068.

[20]Lambert-Messerlian GM,Eklund EE,Fergal D,et al.Stability of first- and second-trimester serum markers after storage and shipment[J].Prenatal Diagnosis,2006,26(1):17-21.

Analysis on results of middle pregnancy dried blood spots prenatal screening among pregnant women in Gansu area

LIUFurong,HAOShengju△,WANGXing,ZHENGLei,YANYousheng

(MedicalGeneticCenter,GansuProvincialMaternityandChildHealthCareHospital,Lanzhou,Gansu730050,China)

Objective To evaluate the risk of Down′s syndrome(DS),Edward′s syndrome(ES) and open neural tube defect (ONTD) at the second-trimester by detecting the concentrations of AFP and free-βhCG in dried blood spots (DBS).Methods The concentrations of AFP and free-βhCG in DBS were quantitatively determined by using time-resolved fluorescence method.The risk was calculated by adopting the Life cycle 3.2 software.Results Among 5 001 screened pregnant women,65 cases were advanced age pregnant women,accounting for 1.3%.The positive screening rates of DS,ES and ONTD were 3.7%(185/5 001),0.4%(20/5 001) and 4.3%(215/5 001) respectively.Eight cases were confirmed positive,in which 5 cases were advanced age pregnancies.Conclusion Second-trimester DBS for screening DS has an important significance in realizing the uniform management of quality control,increasing the screening coverage degree and reducing birth defects.

second-trimester; Down syndrome; dried blood spots prenatal screening

劉芙蓉，女，技師，主要從事醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究。△

，E-mail:76108060@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.016

A

1673-4130(2016)24-3426-04

2016-09-01

2016-10-20)