李雪珂，劉 秋，許治良，周 軍，曹 亮，丁 崗，王振中，蕭 偉1,

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001)

銀杏二萜內酯葡胺注射液通過抑制p38/p53通路保護氧糖剝奪SY5Y細胞的機制

李雪珂1,3，劉 秋2,3，許治良2,3，周 軍2,3，曹 亮2,3，丁 崗2,3，王振中2,3，蕭 偉1,2,3

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001)

目的 探討銀杏二萜內酯葡胺注射液(diterpene ginkgolides meglumine injection, DGMI)對缺糖/缺氧損傷(oxygen-glucose deprivation，OGD)的人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SY5Y)保護的作用及可能的機制。方法 SY5Y細胞OGD損傷4 h后，予藥物復氧1 h，然后測定細胞存活率(CCK-8法)、凋亡壞死比率、線粒體膜電位(ΔΨm)；蛋白質免疫印跡檢測細胞中p-p38、p-p53、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白量的變化。結果 DGMI能明顯提高OGD損傷的SY5Y細胞的存活率，降低細胞凋亡比率，挽救下降的線粒體膜電位(ΔΨm)。下調p-p38、p-p53、Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3等蛋白量，抑制p38和p53活性，保護神經(jīng)細胞。結論 DGMI對OGD損傷的SY5Y細胞具有明顯的保護作用，其保護機制可能與細胞內p38/p53/Bcl-2/caspase-9/caspase-3 信號通路的抑制有關。

銀杏二萜內酯葡胺注射液；氧糖剝奪；細胞凋亡；p38； p53；Bax/Bcl-2

腦卒中俗稱中風，其中缺血性卒中約占85%，是危害人類生存健康的高危疾病。缺血性卒中系由局部腦組織區(qū)域血液供應障礙，導致神經(jīng)細胞缺血/缺氧性病變凋亡和壞死，進而產(chǎn)生臨床上對應的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，因此保護腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞是其治療的關鍵因素之一。銀杏二萜內酯葡胺注射液(diterpene ginkgolides meglumine injection, DGMI)是含銀杏內酯B(GB，60%)、銀杏內酯A(GA，35%)、銀杏內酯K(GK，2%)、銀杏內酯C(GC，2%)的5類新藥，用于腦卒中的治療。研究表明，各單體除作為血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑[1]外，還可通過抑制炎癥反應、線粒體凋亡和氧化應激等[2-5]途徑保護神經(jīng)細胞。本實驗室已有研究表明，DGMI可通過激活PI3K/Akt和PKA通路，促進Bad(Ser 136)和Bad(Ser 112)磷酸化，抑制氧糖剝奪SY5Y細胞線粒體途徑凋亡[6]。p38 MAPK是有絲分裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)的重要成員，激活后發(fā)生核轉位，對許多蛋白激酶和轉錄因子具有磷酸化激活的作用，參與體內多種過程，不僅在炎癥反應中，也在細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[7-8]。p53是體內的一種檢測基因組完整性，調控凋亡的蛋白，在腦缺血神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用，其活性受磷酸化、乙?；⒓谆?、泛素化等翻譯修飾后調控，特別是Ser15位點磷酸化能抑制泛素化降解，增強其穩(wěn)定性活性。本研究選用人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SY5Y)缺糖/缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型模擬缺血性腦卒中，研究DGMI對OGD損傷細胞凋亡的抑制作用及抑制p38/p53信號通路治療腦卒中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 SY5Y購自中科院上海細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購自 Biotopped公司；胰蛋白酶購自美國Amresco公司；CCK-8試劑盒購自上海貝博公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司；羅丹明123購自美國Sigma公司；p-p38(Thr 180/Tyr 182) antibody、p-p53(Ser 15) antibody、Bcl-2 antibody、cleaved caspase-3 antibody、GAPDH antibody、tublin antibody、HRP標記二抗購自美國CST公司；Bax antibody、caspase-3 antibody購自美國Santa Cruz公司；caspase-9 antibody購自英國Abcam公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；三氣培養(yǎng)箱購自德國BINDER公司；微板檢測系統(tǒng)Flex Station 3購自美國MD公司；ChemiDoc XRS系統(tǒng)購自美國Bio Rad公司；銀杏二萜內酯葡胺注射液(DGMI)為江蘇康緣藥業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為141201；金納多注射液(JND)產(chǎn)品批號為H4040。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、OGD模型和給藥 SY5Y細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素)中，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將SY5Y細胞接種至細胞板中培養(yǎng)24 h，以無糖RPMI 1640完全置換RPMI 1640培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中，控制95% N2和5% CO2混合氣體條件，待氧氣濃度降為0.2%時計時，培養(yǎng)4 h后，取出細胞板置于含氧細胞培養(yǎng)箱中，給一定濃度DGMI和JND藥物，復氧1 h。然后進行細胞活力、凋亡和相關激酶蛋白的測定。

1.2.2 細胞活力的測定 將SY5Y細胞以每孔2×104的密度接種至96孔板，OGD 4 h后加入終濃度為6.25、12.5、25、50 mg·L-1的DGMI，一起復氧1 h，采用CCK-8試劑盒，按說明書每孔加入底物10 μL，細胞培養(yǎng)箱中孵育2.5 h后，于450 nm處測定各組吸光度值OD450 nm，計算細胞相對活力。

1.2.3 Annexin V-FITC檢測細胞凋亡 將SY5Y細胞以每孔5×105的密度接種至6孔板，OGD 4 h后加入終濃度為25 mg·L-1的藥物，一起復氧1 h，應用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，參考說明書，測定細胞凋亡比率。將細胞培養(yǎng)液吸出至一滅菌離心管內，胰酶消化收集，合并液體，1 000×g離心5 min，棄上清，PBS重懸計數(shù)，取10萬重懸細胞至1.5 mL離心管內。1 000×g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液，輕輕重懸，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，隨即進行流式細胞儀檢測。獲取散點圖后，調節(jié)四分象限，計算各組細胞凋亡比率。

1.2.4 羅丹明123染色 將SY5Y細胞以每孔2×104的密度接種至96孔板，OGD 4 h后加入終濃度為25 mg·L-1的藥物，一起復氧1 h，吸除細胞培養(yǎng)液，加PBS洗滌1次，加入100 μL的Rhodamine123染色液，輕輕混勻，細胞培養(yǎng)箱中避光孵育15 min，PBS洗滌2次，于熒光倒置顯微鏡下拍照觀察。1.2.5 Western blot檢測蛋白質水平 將SY5Y細胞以每孔5×106的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，應用BCA法，測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉蛋白至PVDF膜，封閉，加入1 ∶1 000稀釋的兔抗人的一抗，4 ℃孵育過夜，回溫2 h，TBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1 ∶1 500)溶液室溫 孵育2 h后洗滌膜，ECL法顯影，應用ChemiDoc XRS系統(tǒng)拍照，采用Quantity One圖像分析軟件進行顯影條帶灰度值分析。

Fig 1 DGMI improves viabilities of

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

A

B

DetectionerrorLateapoptoticanddeadcells/%Livingcells%Earlyapoptoticcells/%Control1.091.1196.301.50Model1.858.8265.3324.00DGMI0.172.0484.1313.66JND0.132.8074.7522.32

Fig 2 Effect of DGMI on OGD-induced apoptosis of SY5Y cells

A：Preventive effects of DGMI and JND on OGD-induced apoptosis. The cells were stained by Annexin V-FITC/PI and detected by flow cytometry.B：The diagram describes the percentage of cells in each quadrant.

2 結果

2.1 DGMI明顯提高OGD的SY5Y細胞的存活率 應用CCK-8試劑盒測定不同給藥濃度的SY5Y細胞活力，結果顯示(Fig 1)，與Control組相比，OGD 4 h組細胞存活率降低至54.80%，DGMI終濃度為6.25、12.5、25、50 mg·L-1時，細胞活力分別升至65.18%、66.26%、71.57%和74.45%，且呈濃度依賴性，選取25 mg·L-1作為后續(xù)試驗藥物濃度。

2.2 DGMI抑制OGD誘導的SY5Y細胞的凋亡 為了明確DGMI對細胞凋亡的抑制作用，本研究檢測了細胞凋亡比率和線粒體膜電位(ΔΨm)。Annexin V-FITC實驗結果顯示(Fig 2)，與對照組相比，SY5Y細胞OGD損傷后，細胞凋亡比率明顯升高至34.24%，復氧給藥DGMI后降至15.68%， JND組下降至24.26%。線粒體膜電位實驗熒光結果顯示(Fig 3)，氧糖剝奪后細胞綠色熒光減弱，膜電位(ΔΨm)明顯下降，孵育藥物后熒光增強，膜電位(ΔΨm)升高。說明DGMI能保護線粒體，抑制細胞凋亡。

Fig 3 Effect of DGMI on loss of MMP in SY5Y cells

A:Control;B:Model;C:DGMI;D:JND.The cells were stained by Rhodamine123 and photographed at 100×

2.3 DGMI抑制SY5Y細胞OGD激活的p38/p53活性 本研究檢測了DGMI對p38/p53通路信號通路的調節(jié)作用。蛋白質分析結果顯示(Fig 4)，缺糖/缺氧損傷后，與OGD組相比，DGMI組p38 (Thr 180/Tyr 182)和p53(Ser 15)磷酸化明顯下降(P<0.01)，抑制了SY5Y細胞中OGD誘導的p38/p53活性。

Fig 4 p-p38(Thr 180/Tyr 182) and p-p53(Ser 15) levels of OGD-induced SY5Y cells treated with ±s，n=3)

A:Protein levels of p-p38(Thr180/Tyr182) and p-p53(Ser15);B～C: The protein levels quantified by band gray value ration to GAPDH;B:p-p38, C:p-p53.##P<0.01vscontrol group.**P<0.01vsmodel group

2.4 DGMI降低OGD誘導的SY5Y細胞中的Bax/Bcl-2比率、caspase-9和caspase-3的活性 本研究檢測了DGMI對Bcl-2家族蛋白表達的影響。蛋白分析結果顯示(Fig 5, 6)，缺糖/缺氧損傷后，與OGD組相比，DGMI組Bax含量減少，Bcl-2含量增加，Bax/Bcl-2表達明顯下降(P<0.01)，procaspase- 3含量明顯下降(P<0.05)，活化caspase-9和caspase-3水平明顯下降(P<0.01)，可見其抑制了SY5Y細胞中OGD誘導的p53調控線粒體途徑的細胞凋亡。

Fig 5 Bax/Bcl-2 ratio of OGD-induced SY5Y cells treated with ±s,n=3)

A:Protein levels of Bcl-2 and Bax; B-D: The protein levels quantified by band gray value ration to β-tublin; B: Bcl-2;C:Bax; D:Bax/Bcl-2 ratio.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group

3 討論

缺血性腦卒中是常見多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，約占腦卒中的85%[9]，是世界范圍內危害人類健康的重要疾病之一，體外氧糖剝奪SY5Y細胞模擬這一病征，是研究缺血性腦卒中損傷機制及相關藥效機制的重要手段。本研究表明，缺血性卒中發(fā)生后，DGMI可濃度依賴性地提高OGD損傷SY5Y細胞活性，減少凋亡比率，且在抑制p38和p53磷酸活化方面，優(yōu)于含銀杏黃酮類的JND。

大量研究結果表明，線粒體在腦缺血神經(jīng)元凋亡中起著十分重要的作用，被認為是中樞調控者。當神經(jīng)細胞發(fā)生缺血損傷時，至少有3種因素誘導線粒體膜通透性轉運孔開放：線粒體內鈣離子超載、自由基對線粒體膜的氧化性損傷和產(chǎn)生的能量水平下降[10]。引起細胞色素C進入細胞質，與Adaf-1羧基端的WD-40重復序列結合，激活后者氨基末端的caspase募集區(qū)，剪切活化酶原caspase-9，再激活caspase-3引發(fā)凋亡[11]。除剪切活化外，腦缺血也可引起caspase-3 mRNA升高，增加表達[12]。在線粒體膜通透性轉運孔結構改變中，Bcl-2、Bax等Bcl-2家族成員起著至關重要的作用[13-15]，兩者比例影響細胞受刺激后是否凋亡。當Bax 高表達時，可形成Bax-Bax 同源二聚體，促進細胞凋亡；當Bcl-2 高表達時，可競爭形成更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2 異源二聚體，封閉Bax 形成孔道的活性，抑制細胞凋亡[16]。

p38/p53通路是機體內調控凋亡的重要信號通路。研究報道活化的p38能促進p53在Ser 15位磷酸化[17.18]，從而抑制p53泛素化降解，促進其激活和積累?；罨膒53可直接作用于Bax啟動子，也可減少Bcl-2的mRNA含量，上調Bax/Bcl-2比率，促進細胞凋亡[19-20]。由本研究結果看出，DGMI可抑制OGD損傷SY5Y細胞p38激酶磷酸化，降低p53的Ser 15位點活化，下調氧糖剝奪引起的Bax/Bcl-2升高，調控線粒體凋亡途徑促進在氧糖剝 奪SY5Y細胞的存活?？梢姡种苝38/p53通路是DGMI抑制氧糖剝奪SY5Y細胞凋亡的重要機制之一。

A:Protein levels of cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3;B～E:The protein levels quantified by band gray value ration to β-tublin;B:cleaved caspase-9; C:eleaved caspase-3;D:procaspase-3;E:cleaved caspase-3/procaspase-3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

(致謝: 本實驗全部在江蘇康緣藥業(yè)藥理毒理所許治良老師課題組獨立完成，感謝我的導師蕭偉老師、許治良老師及劉秋研究員在實驗思路設計上提出的建議和意見及實驗技術上給予的指導！)

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Involvement of p38-p53 signal pathway in neuroprotective effects of DGMI on SH-SY5Y cells damaged by oxygen-glucose deprivation

LI Xue-ke1,2,LIU Qiu2,3,XU Zhi-liang2,3,ZHOU Jun2,3, CAO Liang2,3, DING Gang2,3,WANG Zhen-zhong2,3, XIAO Wei1,2,3

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210000,China;2.JiangsuKanionPharmaceuticalCo.Ltd,LianyungangJiangsu222001,China;3.StateKeyLaboratoryofNew-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess,LianyungangJiangsu222001,China)

Aim To investigate the protective effects of Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection(DGMI) on SY5Y cells damaged by oxygen-glucose deprivation and its functional mechanisms.Methods After 4 h of OGD, the cells were treated with 25 mg·L-1drugs for 1 h. Subsequently, cell viabilities were measured by cell counting kit-8(CCK-8 kit) and cell apoptosis was measured by flow cytometric analysis. Furthermore, the mitochondrial membrane potential was detected by rhodamine123 staining. The levels of phospho-p38， phospho-p53， Bcl-2， Bax and cleaved caspase-9/3 were evaluated by western blot.Results DGMI significantly increased the cell viabilities of SY5Y cells damaged by OGD, and reduced OGD-elicited dissipation of mitochondrial membrane potential and cell apoptosis. Furthermore, DGMI also reduced p-p38,p-p53,Bax/Bcl-2 ratio,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3.Conclusion DGMI shows good neuroprotective effects on SY5Y cells after oxygen-glucose deprivation. The underlying mechanisms may be associated with the suppression of p38/p53/Bcl-2 /caspase-9/caspase-3 signaling pathway.

DGMI; oxygen-glucose deprivation; apoptosis; p38; p53; Bax/Bcl-2

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.026.html

2016-07-22,

2016-08-29

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助項目(No 2013ZX09402203)

李雪珂(1993-)，女，碩士生，研究方向：藥物分子藥理學，E-mail: xkl9347@163.com； 蕭 偉(1959-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥新劑型的研究與開發(fā)，通訊作者，E-mail: wzhzh-nj@163.net

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.013

A

1001-1978(2016)12-1699-06

R282.71；R329.25；R341；R743.31；R845.22