姚 旺， 顧炎斌， 吳古遠(yuǎn)， 曾曉起??

(1.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003； 2.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院漁業(yè)資源增殖與保護(hù)實驗室，山東 青島 266003； 3.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116000)

西沙群島6種海參骨片的超顯微結(jié)構(gòu)研究?

姚 旺1,2， 顧炎斌3， 吳古遠(yuǎn)1,2， 曾曉起1,2??

(1.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003； 2.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院漁業(yè)資源增殖與保護(hù)實驗室，山東 青島 266003； 3.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116000)

利用掃描電子顯微鏡觀察中國西沙群島的玉足海參(Holothurialeucospilota)、虎紋海參(Holothuriapervicax)、黑赤星海參(Holathuriacinerascens)、黃疣海參(Holathuriahilla)、格皮氏海參(Pearsonothuriagraeffei)、糙刺參(Stichopushorrens)6種海參的背脊中部和腹部的骨片，獲得了6種海參骨片的超顯微結(jié)構(gòu)圖像。研究發(fā)現(xiàn)，6種海參的骨片分為桌形體、扣狀體、穿孔板、桿狀體、C形體、花紋樣體、顆粒體7種類型。研究發(fā)現(xiàn)了新的海參骨片：玉足海參的穿孔板；虎紋海參的具橫梁桌形體；黑赤星海參的II型桌形體；黃疣海參的II型扣狀體；格皮氏海參的餅干形穿孔板和II型花紋樣體；糙刺參中部具扇形突起的桿狀體和I型花紋樣體。本研究進(jìn)一步豐富了我國海參骨片形態(tài)學(xué)研究的資料。

西沙群島；海參；掃描電鏡；骨片；形態(tài)；超顯微結(jié)構(gòu)

海參綱(類)(Holothuroidea或Holothurioidea)屬棘皮動物門(Echinodermata)，種類甚多，全世界約有1693種[1]，中國有海參綱6目15科58屬147種[2]，其中21種海參可供食用[3]。海參中含有多糖、海參皂苷、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂等多種生物活性物質(zhì)，具有提高免疫活性、抗腫瘤、抗癌、抗真菌等生理藥理活性[4]。

海參綱根據(jù)觸手的形狀、管足和呼吸樹的有無分為6個目：枝手目(Dendroehirotida)、指手目(DactyIoehirotida)、楯手目(Aspidochirotida)、平足目(Elasipodida)、芋參目(Molpadiida)和無足目(Apodida)[5]。海參骨片是存在于海參體壁真皮層中的一種內(nèi)骨骼，主要成分是碳酸鈣，是海參種類鑒定的重要的參考特征。海參骨片主要包括以下類型：桌形體(Table)、扣狀體(Button)、穿孔板(Plate)、C型體(C-shaped)、花紋樣體(Rosette)、桿狀體(Rod)、顆粒體(Grain)、錨形體(Archor)等[6]。Stricker對細(xì)錨參屬海參體壁內(nèi)的骨片進(jìn)行研究，認(rèn)為海參骨片在保護(hù)血管與神經(jīng)結(jié)構(gòu)以及支持觸手運動方面具有重要作用[7]。Kerr等結(jié)合分子生物學(xué)方法對10種海參骨片的發(fā)育演化進(jìn)行了研究，認(rèn)為海參骨片由復(fù)雜的桌形體等向簡單花紋樣體等演化[8]。Kamarudin等通過基于骨片的形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法對2種馬來西亞海參進(jìn)行了研究，認(rèn)為2種方法結(jié)合使海參種類的鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠[9]。

廖玉麟全面系統(tǒng)地描述了中國134種海參，幾乎全部種類都附了外形及骨片的手繪圖例[10]。趙世民報道描述了臺灣巖岸潮間帶30種海參，并用掃描電鏡研究了它們骨片的超顯微結(jié)構(gòu)[11]。Toral-Granda對棕色等刺參(Isostichopusfuscus)的新鮮、鹽漬和干制品進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過這3種處理方法的海參用NaClO方法制備的骨片樣品都非常清晰完整，其形態(tài)和骨片類型的比例并沒有變化，說明海參骨片組成結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，鹽漬、干制等保存處理方法均不會對其造成破壞[12]。李赟等對15種海參干品中的骨片進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的觀察，并對各種骨片在海參體內(nèi)的相對比例進(jìn)行了研究，通過光學(xué)顯微鏡下觀察的背脊部骨片形態(tài)結(jié)構(gòu)對這15種海參進(jìn)行區(qū)分鑒定，認(rèn)為僅比較背脊部的骨片來鑒定海參是可行的[13]。文菁等、范嗣剛等使用掃描電子顯微鏡對中國南海的14種海參進(jìn)行了觀察[14-15]，發(fā)現(xiàn)了一些新的骨片類型。尤豐等基于骨片結(jié)構(gòu)，結(jié)合外部形態(tài)與分子生物學(xué)方法鑒定了一個海參新種(Ocnussanya)[16]。文菁等使用掃描電子顯微鏡對市售6種海參骨片進(jìn)行觀察，結(jié)合分子生物學(xué)方法鑒定假冒仿刺參商品[17]。

掃描電子顯微鏡(SEM)所呈圖像有立體感，具有三維形態(tài)，能夠提供比光學(xué)顯微鏡更多的信息[18]，在生物學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[19]。而利用掃描電子顯微鏡也能夠更加清晰、全面、準(zhǔn)確地對海參骨片結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、記錄與描述。本研究使用掃描電子顯微鏡對中國西沙群島6種海參的骨片進(jìn)行了觀察，旨在進(jìn)一步地豐富我國海參骨片形態(tài)學(xué)研究的資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料采自中國西沙群島，海參樣品用無水乙醇固定，6種海參均屬于海參綱楯手目，具體信息見表1。

表1 6種海參的樣品信息

1.2 實驗方法

從海參背脊中部和腹部，用刀片切取1cm2×1mm的體壁組織，每個樣品重復(fù)取樣3次，用蒸餾水沖洗干凈。加以10%NaClO溶液1～2mL，充分消化30～60s，期間不斷震蕩，待出現(xiàn)較多白色顆粒沉淀時用鑷子取出未消化的體壁，靜置1min，待沉淀完全，用吸管吸去上清液，用蒸餾水反復(fù)漂洗3次。

吸取骨片懸液，滴加在玻片上，烘干后小心轉(zhuǎn)移至膠膜上，噴金后通過掃描電子顯微鏡(型號：H-3400N)進(jìn)行觀測拍照。

選擇完整且不被遮掩的骨片進(jìn)行拍照，每種骨片至少拍攝3張照片?；诠瞧掌瑢γ糠N骨片進(jìn)行簡單測量，精確至(10±5)μm。

2 結(jié)果

2.1 玉足海參

在玉足海參中觀察到3種骨片：桌形體、扣狀體和穿孔板(見圖1A-C)。桌形體底盤近圓形，底盤直徑約為50～60μm，周緣平滑。底盤中央有1大孔，周緣有9～14個小孔。桌形體塔部適度高，有4根立柱，中央有1橫梁。頂部呈環(huán)狀，中央有1大孔，周緣具齒12個，有時周緣會有小孔(見圖1A1箭頭指示小孔)?？蹱铙w長徑約50μm，短徑約30μm，具穿孔3對，周緣光滑(見圖1B)。大型穿孔板上圓形穿孔不規(guī)則分布(見圖1C)。

(A1：桌形體頂部，箭頭指示小孔；A2：桌形體底面；A3：桌形體側(cè)面觀；B：扣狀體；C：穿孔板。比例尺=10μm。A1: Table (top view), the arrow marks the tiny hole; A2: Table (bottom view); A3: Table (side view); B: Button; C: Plate. Scale bars=10μm.)

圖1 玉足海參骨片掃描電鏡圖

Fig.1 Ossicles of body walls ofHolothurialeucospilota(SEM phtotgraphs)

2.2 虎紋海參

在虎紋海參中發(fā)現(xiàn)2種骨片：桌形體和桿狀體(見圖2A-B)。桌形體底面近圓形，直徑約30～40μm，周緣光滑，中央有3或4個大孔，周緣有3～6個小孔。桌形體塔部退化，僅有3或4個極低的立柱，其中3根立柱末端有橫梁相連，一根立柱獨立無橫梁(見圖2A1)。桿狀體骨長約20μm，形狀很特別，兩側(cè)有分枝，各分枝末端向兩邊突出，很像不完整的扣狀體，或者說是從桿狀體到扣狀體的過渡形式(見圖2B1、B2)[10]。

2.3 黑赤星海參

黑赤星海參中觀察到3種骨片：桌形體，桿狀體和穿孔板(見圖3A～C)。桌形體有2種，I型桌形體底盤很小，直徑約30～40μm，周緣光滑，中央有4個大孔，周緣有6～8個小孔(見圖3A1)。塔部適度高，有4根立柱，橫梁1根(見圖3A3)。頂部呈馬耳他十字形(見圖3A4)，有小齒12～13個。II型桌形體塔部退化，僅有底盤，底盤直徑約50μm，周緣光滑，中央有4個大孔，周緣10個小孔(見圖3A5)。桿狀體很強大，長約90～140μm，分枝或不分枝，表面粗糙，有許多小顆粒(見圖3B1、B2)。大型穿孔板上圓形穿孔不規(guī)則分布(見圖3C1、C2)。

(A1：桌形體頂部；A2：桌形體底面；B1，B2：桿狀體。比例尺=10μm。A1: Table (top view); A2: Table (bottom view); B1, B2: Rods. Scale bars=10μm.)

圖2 虎紋海參骨片掃描電鏡圖

Fig.2 Ossicles of body walls ofHolothuriapervicax(SEM phtotgraphs)

(A1：I型桌形體底面；A2：I型桌形體頂部；A3：I型桌形體側(cè)面；A4：I型桌形體頂部馬耳他十字；A5：II型桌形體底面；B1，B2：桿狀體；C1：穿孔板。比例尺=10μm。C2：穿孔板。比例尺=100μm。A1: I type table (bottom view); A2: I type table (top view); A3: I type table (side view); A4: The maltese cross of I type table; A5: II type table (bottom view); B1, B2: Rods; C1: Plate. Scale bars=10μm. C2: Plate. Scale bars=100μm.)

圖3 黑赤星海參骨片掃描電鏡圖

Fig.3 Ossicles of body walls ofHolothuriacinerascens(SEM phtotgraphs)

2.4 黃疣海參

黃疣海參中觀察到2種骨片：桌形體和扣狀體(見圖4A-B)。桌形體底盤呈圓形，直徑約50～60μm，周緣光滑。中央有1大孔，周緣小孔12個(見圖4A1)。塔部適度高，有4根立柱，1根橫梁(見圖4A3)。頂部呈環(huán)狀，有小齒12個(見圖4A2)。扣狀體有2種(見圖4B1、B2)，I型扣狀體周緣光滑，長徑約60μm，短徑約25μm，具穿孔3對，扣狀體邊緣常在近末端處有顯著內(nèi)凹(見圖4B1箭頭所指)。II型扣狀體巨大，周緣光滑，長徑約110μm，短徑約50μm，一側(cè)有7～8個穿孔，周緣有小的穿孔7個。

(A1：桌形體底面；A2：桌形體頂部；A3：桌形體側(cè)面；B1；I型扣狀體，箭頭指示顯著內(nèi)凹；B2：II型扣狀體。比例尺=10μm。A1: Table (bottom view); A2: Table (top view); A3: Table (side view); B1: I type button, the arrow marks the concave curve; B2: II type button.Scale bars=10μm.)

圖4 黃疣海參骨片掃描電鏡圖

Fig.4 Ossicles of body walls ofHolothuriahilla(SEM phtotgraphs)

2.5 格皮氏海參

格皮氏海參中觀察到3種骨片：假桌形體，大型顆粒體和花紋樣體(見圖5A～C)。假桌形體長約55μm，無明顯底盤，僅有由2～4根立柱延伸匯合而成的基部。塔部長而不規(guī)則，由基部伸出(見圖5A1箭頭所指)，假桌形體外部無規(guī)則地分布著許多棘狀突起。大型顆粒體為餅干型，直徑約20μm，僅有3個極小的穿孔(見圖5B)?；y樣體有2種(見圖5C1～C3)，I型花紋樣體長約20～30μm，分枝多而復(fù)雜(見圖5C1,C2)；II型花紋樣體長約15～20μm，分枝少而簡單，末端膨脹(見圖5C3)。

2.6 糙刺參

糙刺參中觀察到4種骨片：桌形體、桿狀體、C形體和花紋樣體(見圖6A～E)。桌形體有2種，疣足內(nèi)有巨大的I型桌形體(見圖6A1～A3)，底盤巨大，呈圓形，周緣光滑，直徑約80～120μm，中央有4個大孔，周緣有許多大小不一的穿孔(見圖6A3，箭頭指示花紋樣體)，塔部高，有4根立柱，1～2根橫梁，末端愈合呈尖狀(見圖6A1、A2)。II型桌形體(見圖6B1～B3)底盤呈圓形，周緣光滑，直徑約30～50μm，中央有1個大孔，周緣有6～12個小孔(見圖6B2)，塔部適度高，有4根立柱，1根橫梁(見圖6B3)，頂部呈馬耳他十字形，中央有1穿孔，具小齒24個(見圖6B1)。桿狀體長約250μm，表面光滑，中部有數(shù)枚扇形突起，突起末端有小棘，桿狀體末端也有小棘不規(guī)則分布(見圖6C)。C形體長約80μm(見圖6D)?；y樣體有2種，分枝皆少而簡單，I型花紋樣體骨長約20μm，末端膨脹(見圖6E1)，II型花紋樣體骨長約25μm，末端不膨脹(見圖6E2)。

(A1：假桌形體側(cè)面，箭頭指示塔部；A2：假桌形體頂部；B：大型顆粒體；C1，C2：I型花紋樣體；C3：II型花紋樣體。比例尺=10μm。A1: Pseudo table (side view); A2: Pseudo table (top view); B: Grain; C1, C2: I type rosette; C3: II type rosette. Scale bars=10μm.)

圖5 格皮氏海參骨片掃描電鏡圖

Fig.5 Ossicles of body walls ofPearsonothuriagraeffei(SEM phtotgraphs)

(A1：I型桌形體側(cè)面；A2：I型桌形體頂部；A3：I型桌形體底面，箭頭指示附著的花紋樣體；B1：II型桌形體頂部；B2：II型桌形體底面；B3：II型桌形體側(cè)面；C：桿狀體；D：C形體；E1：I型花紋樣體；E2：II型花紋樣體。比例尺=10μm。A1: I type table (side view); A2: I type table (top view); A3: I type table (bottom view), the arrows mark the adherent rosettes; B1: II type table (top view); B2: II type table (bottom view);B3: II type table (side view); C: Rod; D: C-shape; E1: I type rosette; E2: II type rosette. Scale bars=10μm.)

圖6 糙刺參骨片掃描電鏡圖

Fig.6 Ossicles of body walls ofStichopushorrens(SEM phtotgraphs)

3 討論

海參骨片位于海參體壁的真皮層，主要成分是碳酸鈣，形狀和大小因種而異，是海參綱動物分類的重要特征[10]。

對6種海參的研究表明，同屬的海參骨片之間存在一定共性。如同屬海參屬的玉足海參、虎紋海參、黑赤星海參和黃疣海參都具有桌形體，玉足海參與黃疣海參都具有扣狀體等。同時，同屬不同種的骨片均有差異，如玉足海參的某些桌形體頂部呈環(huán)狀且有小型穿孔，虎紋海參的桿狀體有獨特的分枝，黑赤星海參的桿狀體強大，表面粗糙，而黃疣海參的某些扣狀體具有顯著的內(nèi)凹等。不同屬的海參之間也有較大差異，如格皮氏海參具有獨特的假扣狀體，而糙刺參疣足內(nèi)大型的桌形體塔部愈合，且具有獨特的C型體。

本次研究還發(fā)現(xiàn)一些新骨片，并且對之前研究發(fā)現(xiàn)的新骨片進(jìn)行了驗證。文菁等發(fā)現(xiàn)玉足海參桌形體底盤中央是1個大孔而非4個大孔，有的桌形體頂部周緣具有小孔[14]。本次研究對玉足海參進(jìn)行的觀察驗證了文菁等的發(fā)現(xiàn)，且新發(fā)現(xiàn)大型穿孔板。范嗣剛等對我國南海8種海參背脊中部體壁內(nèi)的骨片進(jìn)行了結(jié)構(gòu)觀察，新發(fā)現(xiàn)格皮氏海參具有大型穿孔板，未發(fā)現(xiàn)糙刺參的新骨片[15]。本次研究對格皮氏海參進(jìn)行的觀察新發(fā)現(xiàn)餅干型顆粒體以及分枝少而簡單且末端膨脹的II型花紋樣體。對糙刺參進(jìn)行的觀察新發(fā)現(xiàn)了中部具有扇形突起的桿狀體以及末端不膨脹的II型花紋樣體。本次研究首次使用掃描電子顯微鏡對虎紋海參、黑赤星海參、黃疣海參進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)了一些新骨片，包括虎紋海參立柱頂端相連呈橫梁的桌形體，黑赤星海參塔部退化、僅有底盤的II型桌形體，黃疣海參，巨大且具有多對穿孔、周緣具小孔的II型扣狀體。具體見表2。

本研究與先前的研究相比有一定的新發(fā)現(xiàn)，分析原因有以下兩點：第一，本研究利用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察拍照，相比光學(xué)顯微鏡來說放大倍數(shù)更大，分辨率更高，成像更立體，對于骨片結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)觀察更為細(xì)致，如虎紋海參新發(fā)現(xiàn)了具橫梁桌形體，虎紋海參桌形體立柱極低，因此通過光學(xué)顯微鏡觀察很難觀察到立柱的相關(guān)細(xì)節(jié)；第二，海參骨片在大多數(shù)海參體壁內(nèi)均有分布，不同部位分布的骨片種類與數(shù)量均有差異，本研究在不僅在海參背部取樣，還在密集分布管足的腹部或疣足部分取樣，因此能夠發(fā)現(xiàn)一些新的骨片，如糙刺參新發(fā)現(xiàn)的桿狀體，僅在腹部有觀察到。

表2 與先前研究結(jié)果的對比

Note:①Holathurialeucospilota; ②Holathuriapervicax; ③Holathuriacinerascens; ④Holathuriahilla; ⑤Pearsonothuriagraeffei; ⑥Stichopushorrens

4 結(jié)論

(1)6種海參的骨片包括桌形體、扣狀體、穿孔板、桿狀體、C形體、花紋樣體、顆粒體等7種類型。

(2)發(fā)現(xiàn)了以前未報道的新骨片：玉足海參穿孔板；虎紋海參具橫梁的桌形體；黑赤星海參II型桌形體；黃疣海參II型扣狀體；格皮氏海參餅干形顆粒體和II型花紋樣體；糙刺參中部具扇形突起的桿狀體和I型花紋樣體。

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責(zé)任編輯 朱寶象

The Ultrastructure of Ossicles of Six Holothurians in Xisha Islands, China

YAO Wang1, 2, GU Yan-Bin3, WU Gu-Yuan1, 2, ZENG Xiao-Qi1, 2

(1.The Institute for Biodiversity and Evolution, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Laboratory of Fishery Resources Multiplication and Protection, College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3.National Marine Environment Monitoring Center, Dalian 116000, China)

The ossicles of six holothurians in Xisha Islands of China have been observed with scanning electronic microscope (SEM). Some ultrastructure images were taken, so that the details of those micro ossicles could be clearly observed. Seven types of ossicles were found, namely table, button, rod, plate, C-shaped, rosette and grain. Comparing with the previous reports, some new ossicles were discovered, including the plate inHolothurialeucospilota, a type of table inHolothuriapervicax, a type of table inHolathuriacinerascens, a type of button inHolathuriahilla, a type of rosette and a type of plate inPearsonothuriagraeffei, a type of rod and a type of rosette inStichopushorrens. This study provided new data of ossicles in the form of ultrastructure images. And it is convenient to do the morphological identification for sea cucumbers in China with the aid of these types of ultrastructure.

Xisha Islands; holothurian; scanning electron microscope; ossicle; morphology; ultrastructure

海洋公益專項項目(201505004)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目(201262037)資助 Supported by Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201505004)； The Fundamental Research Funds for the Central Universities (201262037)

2016-01-20；

2016-05-23

姚 旺(1990-)，男，碩士生，研究方向為棘皮動物生物學(xué)。

?? 通訊作者：E-mail：zengxq@ouc.edu.cn

Q174

A

1672-5174(2017)01-076-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160012

姚旺， 顧炎斌， 吳古遠(yuǎn)， 等. 西沙群島6種海參骨片的超顯微結(jié)構(gòu)研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2017, 47(1): 76-81.

YAO Wang, GU Yan-Bin, WU Gu-Yuan, et al. The ultrastructure of ossicles of six holothurians in Xisha Islands, China[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(1): 76-81.