李穎平

（晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600）

間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測(cè)豬肺炎支原體

李穎平

（晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600）

研究介紹了間接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)豬肺炎支原體的方法。具體操作為：先進(jìn)行Hep-2細(xì)胞和豬肺炎支原體菌株的培養(yǎng)，然后進(jìn)行間接熒光抗體檢測(cè)試驗(yàn)，確定抗體工作濃度之后，取病料刮取菌液進(jìn)行菌株檢測(cè)。結(jié)果表明，檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果一致，這種方法可以用于難確診病例的診斷，同時(shí)根據(jù)黏附計(jì)數(shù)，可以推斷感染菌株的毒力，為臨床診斷提供有力的依據(jù)。

Hep-2細(xì)胞；間接免疫熒光；檢測(cè)；豬肺炎支原體

豬肺炎支原體（Mhp）是豬地方流行性肺炎（Enzootic Pneumoniae of Pigs，EPP）的病原，也是一種全球性廣泛傳播的病菌，經(jīng)常與藍(lán)耳病病毒、細(xì)小病毒混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也是豬的重大疫病之一[1]。豬肺炎支原體屬于原核生物，沒(méi)有細(xì)胞壁，細(xì)胞里沒(méi)有細(xì)胞核，DNA，RNA和蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞里，核糖體是其唯一的細(xì)胞器，繁殖方式同其他支原體一樣，有出芽、裂解、分枝等[2-3]。在實(shí)驗(yàn)室通常用吉姆薩或者瑞氏染色的方法檢測(cè)Mhp，但視野中只能找到淡染的菌體，且由于Mhp呈多型性，很難詳細(xì)記錄菌體數(shù)目。如果采用間接免疫熒光技術(shù)，情況就大不相同，由于熒光的亮度能清楚觀察菌體形態(tài)而且可進(jìn)行客觀計(jì)數(shù)。Mhp侵入動(dòng)物體時(shí)首先黏附于氣管上皮細(xì)胞和纖毛上，隨后對(duì)器官組織進(jìn)一步侵害，利用細(xì)胞黏附來(lái)檢測(cè)豬肺炎支原體的方法逐漸被采用。本研究介紹了間接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)豬肺炎支原體的方法。

1 材料和方法

1.1 兔抗豬肺炎支原體免疫血清

兔抗豬肺炎支原體免疫血清由江蘇省農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 Hep-2細(xì)胞的培養(yǎng)[4]

Hep-2細(xì)胞由江蘇省農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞所有的營(yíng)養(yǎng)液是含10%NCS的無(wú)抗生素的RPML1640，置含5%CO2的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)[5-6]，待長(zhǎng)成單層后，用0.25%胰酶消化，以104ceus/mL的量接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孔中預(yù)先加入蓋玻片，每孔加入細(xì)胞懸液1 mL，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%豐度時(shí)，以0.1 mol/L的PBS（pH值7.2）洗滌細(xì)胞3次后待用。

1.3 兔抗豬肺炎支原體免疫血清及FITC標(biāo)記羊抗兔IgG工作濃度確定[7]

以純培養(yǎng)的豬肺炎支原體在Hep-2細(xì)胞上黏附4 h，甲醇固定→分別滴加1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160稀釋的陽(yáng)性兔抗豬肺炎支原體免疫血清，置37℃作用30 min后以PBS洗3次，每次3 min→分別滴加1∶5，1∶10和1∶20稀釋的FITC標(biāo)記羊抗兔IgG（購(gòu)自博士德），37℃作用30 min，用PBS洗3次，晾干后檢查菌體熒光染色情況[8-9]。

1.4 特異性檢測(cè)[10]

以乳酸桿菌的純培養(yǎng)物在Hep-2細(xì)胞上黏附4 h，然后將陽(yáng)性兔血清進(jìn)行1∶20稀釋，熒光抗體進(jìn)行1∶10稀釋后，對(duì)黏附到細(xì)胞上的乳酸桿菌熒光抗體染色并觀察染色結(jié)果[11]。

1.5 抗體檢測(cè)試驗(yàn)

將陽(yáng)性豬血清進(jìn)行1∶10稀釋，加入純培養(yǎng)的豬肺炎支原體，搖勻后，37℃培養(yǎng)2 h，10 000 r/min離心5 min，棄沉淀，留上清然后進(jìn)行5倍稀釋，按1.4方法染色，并做陽(yáng)性豬血清試驗(yàn)，以陰性豬血清試驗(yàn)為對(duì)照[12-13]。

1.6 病料中致病菌的檢查

刮取發(fā)病動(dòng)物豬的肺及氣管組織上皮細(xì)胞病料，按以下步驟操作進(jìn)行熒光抗體染色檢查。

（1）Hep-2細(xì)胞黏附豬肺炎支原體30 min，甲醇固定。（2）棄培養(yǎng)液后，PBS洗1次，自然干燥，滴加1∶20稀釋的陽(yáng)性兔抗豬肺炎支原體免疫血清后置37℃恒溫培養(yǎng)箱，作用1 h，PBS洗滌3次。加1∶10稀釋的FITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，37℃作用1 h后，以PBS洗3次[14]。（3）等充分晾干后，置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體最佳工作濃度測(cè)定

在檢查豬肺炎支原體涂片時(shí)，由表1可知，陽(yáng)性兔血清進(jìn)行1∶20稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔抗體進(jìn)行1∶10稀釋時(shí)效果較好。

表1 FITC標(biāo)記羊抗兔IgG和豬肺炎支原體血清最佳稀釋度的測(cè)定結(jié)果[15]

2.2 特異性檢測(cè)

乳酸桿菌的培養(yǎng)物黏附Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)物中未見(jiàn)有特異性的熒光著染，只有少量細(xì)菌呈暗淡的紅黃色。在熒光顯微鏡下豬肺炎支原體呈單個(gè)球狀或成堆以橢球形聚集，菌體周邊為很強(qiáng)的藍(lán)綠色熒光，極易與其他雜菌分開(kāi)，后者較大[2]。

2.3 抗體檢測(cè)試驗(yàn)

用純培養(yǎng)的豬肺炎支原體對(duì)陽(yáng)性豬血清進(jìn)行反應(yīng)處理后，特異性的熒光消失，可知間接熒光抗體檢查豬肺炎支原體具有特異性[16]。兔血清應(yīng)該選用抗兔血清的熒光抗體，豬血清應(yīng)該選用抗豬血清的熒光抗體，本試驗(yàn)選用兔血清，所以，后來(lái)用抗兔血清的熒光抗體，這種檢測(cè)方法特異性要求很高[17]。

2.4 組織中菌體檢查[5-6]

表2 肺臟細(xì)菌檢查結(jié)果

取氣管和肺進(jìn)行熒光抗體染色檢查[18]，結(jié)果列于表2。沒(méi)有感染豬肺炎支原體的豬肺部和氣管沒(méi)有檢測(cè)到豬肺炎支原體菌體，而發(fā)病動(dòng)物1號(hào)豬明顯檢測(cè)出豬肺炎支原體的存在，與臨床診斷結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)豬肺炎支原體菌株以及采集的發(fā)病動(dòng)物病料進(jìn)行了間接免疫熒光技術(shù)的檢測(cè)，取得了滿意的效果。與其他染色方法比較，間接免疫熒光抗體標(biāo)記的菌體形態(tài)清晰，可以為以后臨床診斷提供有力的依據(jù)。

［1］陳琳，徐秀英.EPO工程細(xì)胞株支原體檢測(cè)[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，1998，20（3）：95-96.

［2］胡清海，張知良，黃建芳，等.應(yīng)用間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測(cè)雞傳染性貧血病毒抗體[J].中國(guó)家禽，2001，23（5）：38-39.

［3］李六金，姜煥宏，李成，等.應(yīng)用電鏡技術(shù)快速檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中的支原體污染[J].中國(guó)獸藥雜志，2002，36（6）：31-33.

［4］肖國(guó)生，文心田，呂祖德，等.豬支原體肺炎診斷技術(shù)[J].中國(guó)獸藥雜志，2003，37（7）：36-39.

［5］車(chē)巧林，熊祺琰，馮志新，等.豬肺炎支原體黏附宿主細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：1069-1073.

［6］蘇敬良，黃瑜，呂艷麗，等.間接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)鴨疫里氏桿菌[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1999，33（2）：5-7.

［7］王玥，徐巍，魯繼榮，等.肺炎衣原體感染在兒童哮喘中的致病作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，30（3）：459-461.

［8］王培光，張學(xué)軍，楊森，等.牛舌粘膜間接免疫熒光法與免疫印跡法檢測(cè)天皰瘡抗體的比較[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34（2）：202-204.

［9］張貴賢.應(yīng)用間接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)兔波氏桿菌[J].粵醫(yī)科技，2007，32（2）：35-36.

［10］楊百亮，劉建泉.犬瘟熱的熒光抗體技術(shù)診斷及治療[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005（9）：46-47.

［11］龍友明，胡學(xué)強(qiáng).免疫熒光檢測(cè)人血清視神經(jīng)脊髓炎免疫球蛋白G的實(shí)驗(yàn)方法[J].中華神經(jīng)雜志，2009，42（10）：699-702.

［12］黃學(xué)勇，杜燕華，李幸樂(lè)，等.新布尼亞病毒IgG抗體間接免疫熒光檢測(cè)方法的建立[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2016，42（6）：165-168.

［13］張貴賢，郝玉蘭，高桂生，等.應(yīng)用間接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)兔波氏桿菌[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34（9）：94-95.

［14］朱函坪，朱智勇，董關(guān)木，等.冠狀病毒蛋白在免疫熒光診斷技術(shù)中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85（9）：621-624.

［15］韓凌霞，司昌德，劉懷然，等.豬2型圓環(huán)病毒原核表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，14（2）：118-121.

［16］高占成.間接免疫熒光檢測(cè)在診斷呼吸道感染性疾病中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，32（8）：697-700.

［17］樊景鳳，李光，王斌，等.間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦紅體病病原：副溶血弧菌[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2007，26（6）：501-503.

［18］姚斐，寇運(yùn)同，陳剛，等.間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測(cè)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的副溶血弧菌[J].海洋科學(xué)，2000，24（9）：10-12.

Indirect Immunofluorescence Antibody Technique to Detect the Pig Pneumonia Mycoplasma

LI Yingping
（Jinzhong Vocational and Technical College，Jinzhong030600，China）

This article introduces the Hep-2 cells adhesion pig pneumonia mycoplasma,and uses indirect fluorescent antibody technique to detect the pig pneumonia mycoplasma.Specific operation is to Hep-2 cells and pigs,the cultivation of pneumonia mycoplasma strains,and indirect immunofluorescence antibody testing experiment,determine the antibody working concentration,scrape a gas-bacilli take epidemic materials according to the determination of the concentration in front of the tested strains.The result shows that test results are consistent with clinical diagnosis,so this method can be used in the diagnosis of difficult cases confirmed,at the same time according to the attached count can infer that infected with strains of virulence.

Hep-2 cells;indirect immunofluorescence;test;swine pneumonia mycoplasma

S858.28

A

1002-2481（2016）11-1702-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.30

2016-09-02

李穎平（1980-），女，山西陽(yáng)泉人，講師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)及科研工作。