王興華，楊文飛

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母活性蛋白提取工藝

王興華1，楊文飛2

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母活性蛋白提取工藝，為進一步研究釀酒酵母提供理論依據(jù)。以超聲波破壁法提取釀酒酵母活性蛋白，采用單因素試驗和星點試驗設(shè)計，研究超聲總時間、工作時間/間歇時間、超聲功率對釀酒酵母活性蛋白得率的影響。結(jié)果表明，釀酒酵母活性蛋白提取最佳工藝：超聲總時間為15.32 min，工作時間/間歇時間為17.96 s/17.96 s，超聲功率為461.45 W，期望值37.53 μg/mL；按最佳提取條件提取后測得的實際蛋白含量為36.48 μg/mL。星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化超聲波破壁法提取釀酒酵母活性蛋白工藝，方法簡便，預(yù)測性良好。

星點設(shè)計；超聲破壁；釀酒酵母；活性蛋白

早在1996年真核生物釀酒酵母基因組測序便率先完成。酵母細胞是目前被人們了解最多的生物之一，也是生物界的模式生物之一，在很多方面都有一定的研究應(yīng)用[1]。它富含的人體必需8種氨基酸的組成比例接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）推薦的理想氨基酸的比例。近些年來，酵母提取物需求量也開始呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[2-4]。

酵母細胞壁是由葡聚糖和甘露糖蛋白組成的位于酵母細胞最外層的一層保護層，對維持細胞滲透壓，保護細胞免受外部傷害起著重要作用。酵母細胞壁的存在極大地影響酵母蛋白被利用，且已經(jīng)有很多學(xué)者對如何進行酵母破壁做了大量的研究工作。使酵母細胞破壁釋放蛋白質(zhì)的方法，有反復(fù)凍融法、化學(xué)法、酶解法和機械破壁法等[5-8]。超聲波破壁法是其中廣泛應(yīng)用的一種方法，通過在溶劑中產(chǎn)生的振動、攪拌和空化作用使細胞破裂，進而使其有效成分溶出[9-11]。李聰?shù)萚12]研究表明，超聲破碎酵母細胞法與其他方法相比，更為簡便、快捷、經(jīng)濟、實用，而且可以在保證其提取率的前提下保護所提取蛋白的活性。

國際上在工藝優(yōu)化時，常使用均勻設(shè)計和正交設(shè)計，但這2種試驗方法在精度和數(shù)學(xué)模型預(yù)測能力方面較差。近幾年，國外常運用將數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法融于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法（Response Surface Methodology，RSM）進行設(shè)計優(yōu)化[13-15]，其精度高、預(yù)測能力好，是目前常用的設(shè)計方法[16]。星點設(shè)計（Central Composite Design，CCD）是在析因設(shè)計的基礎(chǔ)上，由析因點及中心點而形成的可進行線性或非線性擬合的試驗設(shè)計方法，由于其試驗精度高、試驗次數(shù)少及預(yù)測值接近真實值等特點，近年來常用于優(yōu)化設(shè)計。

本試驗利用星點設(shè)計來優(yōu)化超聲波破壁法提取釀酒酵母活性蛋白的工藝，旨在為釀酒酵母活性蛋白的研究及應(yīng)用提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）EGY48菌株保存于山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 試劑

YPD培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，pH自然?？捡R斯亮藍試劑和標準蛋白質(zhì)溶液，參照趙卓等[17]的方法進行配制。

1.3 儀器

THZ-82A恒溫振蕩器，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 釀酒酵母蛋白提取及測定

挑取保存于固體培養(yǎng)基上的酵母單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；取適量活化的菌液接種到新的YPD培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至對數(shù)期后于4℃收集菌體，稀釋至106個/mL后按給定條件進行超聲波處理，取超聲處理后的菌懸液適量，低溫離心15 min（4℃，1 000 r/min）后取上清液得粗提液，然后用考馬斯亮藍法測定其蛋白含量。

1.5 總工作時間對釀酒酵母蛋白含量的影響

為了降低對超聲波細胞破碎儀的耗損，選定其破碎功率為325 W、工作時間/間歇時間為1 s/1 s，并設(shè)定超聲破碎細胞時間分別為10，20，30，40，50，70 min。破碎后離心取上清，提取酵母蛋白，最后測定蛋白含量。

1.6 工作時間/間歇時間對釀酒酵母蛋白含量的影響

工作時間/間歇時間在超聲破碎過程中不僅影響細胞破碎率，而且影響目的蛋白的活性[12]。破碎功率設(shè)定為325 W、總工作時間設(shè)定為10 min，設(shè)定工作時間/間歇時間分別為5 s/5 s，10 s/10 s，15 s/15 s，20 s/20 s，25 s/25 s進行超聲細胞破碎，然后離心取上清，提取酵母蛋白，最后測定蛋白含量。

1.7 超聲破碎功率的確定

超聲破碎功率的大小會影響細胞破碎的完全度及樣品的蛋白活性[12]。工作時間/間歇時間設(shè)定為1 s/1 s，總工作時間設(shè)定為10 min，超聲功率分別以130，260，390，520，650 W進行細胞破碎，然后離心取上清，提取酵母蛋白，最后測定蛋白含量。

1.8 星點設(shè)計-效應(yīng)面法對超聲破壁條件的優(yōu)化

在單因素考察的基礎(chǔ)上，以超聲總時間（X1，min）、工作時間（X2，s）及功率（X3，W）作為考察因素，粗提液蛋白含量作為考察指標，進行3因素5水平的星點設(shè)計。應(yīng)用Design-Expert 6.0.5軟件進行數(shù)據(jù)擬合，以±1.68，±1，0代表自變量水平。試驗設(shè)計列于表1。

表1 因素水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波功率對提取釀酒酵母蛋白的影響

從圖1可以看出，當(dāng)破碎功率為260～520 W時，提取到的蛋白含量變化趨勢較130～260 W變小且趨于平直。而當(dāng)超聲波功率大于520 W時又開始出現(xiàn)顯著的上升趨勢，考慮到用考馬斯亮藍測定蛋白含量時，溶液吸光值會隨蛋白變性而上升[17-20]，本研究認為第2次開始呈現(xiàn)出上升趨勢時，蛋白已經(jīng)開始變性。所以，在后續(xù)試驗中選擇破碎功率在390～520 W來進行優(yōu)化。

2.2工作時間/間歇時間對提取釀酒酵母蛋白的影響

從圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著工作時間/間歇時間的增大，樣品提取液中蛋白含量逐步增高；當(dāng)工作時間/間歇時間為20 s/20 s時，蛋白含量達到2.1中520 W超聲處理后的水平；且在20 s/20 s～25 s/25 s蛋白含量變化的不大。因此，選擇工作時間/間歇時間為20 s/20 s左右進行超聲破碎。

2.3 超聲總時間對釀酒酵母活性蛋白提取的影響

從圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著總工作時間的增加，粗提液蛋白含量逐漸升高，且在20 min時蛋白水平已達到2.2中最高水平。因此，選擇小于10～20 min的時間段進行優(yōu)化超聲破碎。

2.4 星點設(shè)計試驗設(shè)計與結(jié)果

通過Design Expert 6.0.5軟件生成20組試驗組合，試驗設(shè)計和結(jié)果列于表2。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

以粗酶液蛋白含量為響應(yīng)值，對各因素進行回歸擬合，得到響應(yīng)值Y和各因子之間的回歸方程：Y＝2.25X1＋0.798X2＋0.177X3－92.9，該方程P＜0.000 1，R2＝0.916，所以，該模型是顯著的，可用來預(yù)測超聲破碎釀酒酵母細胞壁提取活性蛋白的最佳提取工藝。該模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

由表3可知，模型各項差異均極顯著，可見超聲總時間、工作時間/間歇時間和超聲功率對活性蛋白提取量的主效應(yīng)明顯。并且依據(jù)系數(shù)值X1＝610.05，X2＝76.95，X3＝639.4，可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為：超聲功率＞超聲總時間＞工作時間/間歇時間。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析結(jié)果

2.5 提取工藝條件的驗證

由于在單因素確定階段，在37.53μg/mL之前蛋白含量的變化趨勢已經(jīng)趨于穩(wěn)定，且大于37.53μg/mL后的值開始急劇增大，考慮到過度的破碎可能會引起蛋白質(zhì)失去活性，而在生化測驗中需要用有活性的蛋白質(zhì)，故本研究在優(yōu)化的時候沒有選取最大值，而是以37.53 μg/mL為目標值進行優(yōu)化，以得到最多的活性蛋白。

由軟件分析得到最佳提取條件：X1＝15.32 min，X2＝17.96 s/17.96 s，X3＝461.45 W，期望值Y＝37.53 μg/mL（圖4）；按給出的最佳提取條件提取后測得的平均蛋白含量為36.48 μg/mL（n＝3），與預(yù)測值接近，說明了愿望函數(shù)優(yōu)化所得到的理論最佳工藝的可行性和有效性。

3 討論

本研究以釀酒酵母活性蛋白含量為指標，將超聲破碎功率、工作時間/間歇時間及總工作時間列為考察因素，通過單因素試驗及星點設(shè)計探究酵母細胞的最佳條件?？紤]到考馬斯亮藍法具有靈敏度高、測定快速、穩(wěn)定性好、干擾物質(zhì)少等優(yōu)點[21-22]，所以，在測定蛋白含量時選擇考馬斯亮藍法，但是考馬斯亮藍會與蛋白變性后暴露出來的基團反應(yīng)致使測定值變大[20]，故在進行期望函數(shù)優(yōu)化時沒有選擇最大值而是選擇一個恰當(dāng)?shù)闹祦磉M行優(yōu)化，最后得出在提取的過程中，對粗提液蛋白含量影響程度為超聲功率＞超聲總時間＞工作時間/間歇時間，這與屈慧鴿等[23]的結(jié)論一致，試驗優(yōu)化后的超聲破碎條件為超聲功率461.45 W，總工作時間15.32 min，工作時間/間歇時間17.96 s/17.96 s。按給出的最佳提取條件提取后測得的實際蛋白含量為36.48 μg/mL，與預(yù)測值接近，說明了用星點設(shè)計優(yōu)化所得的理論最佳工藝的可行性和有效性。

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Optimization of Active Protein Extraction from Saccharomyces cerevisiaeby Central Composite Design-response Surface Method

WANGXinghua1，YANGWenfei2
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute of Biotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

This experiment was to optimize Saccharomyces cerevisiae active protein extraction process with central composite design-response surface method,provide theoretical basis for further research on Saccharomyces cerevisiae.This experiment extracted Saccharomyces cerevisiae active protein with ultrasonic wall-breaking method,using the single factor experiment and the star design,to study the influence of ultrasonic power,working time/pause time and total time on the yield of protein from Saccharomyces cerevisiae activity.The result showed that optimal extraction process on Saccharomyces cerevisiae active protein,was ultrasonic total time of 15.32 min,working time/pause time 17.96 s/17.96 s,ultrasonic power 461.45 W,and the expected value was 37.53 μg/mL,actual protein concentration was 36.48 μg/mL after the extraction of the best extraction conditions.To optimize the ultrasonic wall-breaking method to extract the Saccharomyces cerevisiae active protein with central composite design-response surface method,the method is simple and has a good predictability.

central composite design;ultrasonic wall-breaking;Saccharomyces cerevisiae;active protein

TS261.1＋1

A

1002-2481（2016）11-1715-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.33

2016-08-04

山西省科技攻關(guān)項目（20140311021-5）

王興華（1958-），男，天津人，副教授，主要從事微生物代謝與發(fā)酵工程研究工作。