戴雪梅， 黃天帶， 李 季， 楊先鋒， 辛士超， 黃華孫

( 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/國家橡膠樹育種中心， 海南 儋州 571737 )

AgNO3對橡膠樹花藥愈傷組織形態(tài)及體胚發(fā)生的影響

戴雪梅， 黃天帶， 李 季， 楊先鋒， 辛士超， 黃華孫*

( 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/國家橡膠樹育種中心， 海南 儋州 571737 )

橡膠樹的花藥愈傷組織在長期繼代過程中，胚性易下降甚至喪失；而AgNO3作為乙烯活性抑制劑，被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中。該研究以繼代培養(yǎng)4 a以上的熱研7-33-97花藥愈傷組織為材料，在繼代培養(yǎng)基中添加2.5 mg·L-1AgNO3預(yù)培養(yǎng)35 d后，觀察預(yù)培養(yǎng)前后愈傷組織表形及其細胞形態(tài)的變化，并設(shè)計不同濃度AgNO3及不同處理時間對其進行體胚誘導(dǎo)，90 d后分別統(tǒng)計胚狀體總數(shù)和正常胚數(shù)。結(jié)果表明：淺黃色質(zhì)地柔軟的愈傷組織在含AgNO3的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)后能轉(zhuǎn)變成鮮黃色易碎愈傷組織，在倒置顯微鏡下前者大多表現(xiàn)為不規(guī)則多邊形，細胞內(nèi)含物較稀?。欢笳邉t呈圓形或橢圓形，細胞內(nèi)含物豐富，屬于典型的胚性細胞。在體胚誘導(dǎo)的第1個月添加5 mg·L-1AgNO3能顯著促進體胚的發(fā)生，AgNO3濃度升至10 mg·L-1時體胚發(fā)生受到抑制，且畸形胚的形成率顯著增加；在含5 mg·L-1AgNO3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月以上，體胚發(fā)育明顯受阻，大部分形成畸形胚。該研究結(jié)果在一定程度上恢復(fù)了橡膠樹長期繼代花藥愈傷組織的胚性能力，并提高了其體胚發(fā)生頻率，為橡膠樹花藥胚性愈傷組織長期繼代培養(yǎng)過程中胚性的保持提供了參考。

橡膠樹， 花藥愈傷組織， AgNO3， 細胞形態(tài)， 體胚發(fā)生

巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)所產(chǎn)的天然橡膠是極其重要的工業(yè)原料和四大戰(zhàn)略物資之一，品種改良一直是橡膠產(chǎn)業(yè)的首要任務(wù)。傳統(tǒng)的人工授粉有性雜交育種在橡膠樹品種改良上有著舉足輕重的地位，但存在工作量大、周期長、容易受環(huán)境因素影響等問題。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生物技術(shù)育種方式如工廠化組培苗繁育、基因轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細胞雜交等愈來愈受到科研工作者的青睞，成為傳統(tǒng)雜交育種的重要輔助手段。這些生物技術(shù)育種方式的開展均有賴于胚性愈傷組織的獲得及通過體胚發(fā)生途徑再生完整植株。在橡膠樹中，胚性愈傷組織的獲得主要有花藥培養(yǎng)和內(nèi)珠被培養(yǎng)兩種途徑。其中，花藥培養(yǎng)是橡膠樹離體培養(yǎng)中研究最多的一個方向，也是橡膠樹生物技術(shù)育種的主要途徑(譚德冠等，2005)。經(jīng)由花藥培養(yǎng)獲得的易碎胚性愈傷組織可通過繼代培養(yǎng)快速增殖，再進行批量的體胚誘導(dǎo)和植株再生(Hua et al，2010)，或者進行懸浮培養(yǎng)建立胚性懸浮細胞系，以此作為原生質(zhì)體培養(yǎng)的最佳分離材料(戴雪梅等，2014)。然而，在研究過程中胚性愈傷組織隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加胚性特征逐漸消失，體胚發(fā)生能力逐年下降甚至完全喪失，導(dǎo)致難于進行下一步的科學研究。因此，在獲得良好的胚性愈傷組織后如何維持其胚性特征并提高體胚發(fā)生能力具有重要的研究意義。

AgNO3是一種乙烯活性抑制劑，可能參與多胺、乙烯和鈣介導(dǎo)的信號途徑，在植物離體培養(yǎng)中具有廣泛的應(yīng)用(Kumar et al, 2009)。在木本植物中，AgNO3能夠有效地促進胚性愈傷組織的形成(范詠梅等，2003)，并能維持胚性愈傷組織的胚性特征(葉新榮等，1994；賴鐘雄等，1997)以及提高體細胞胚胎的發(fā)生頻率(Kong & Yeung, 1994; Giridhar et al, 2004)。此外，在植物離體培養(yǎng)中AgNO3具有促進不定芽分化(Uliaie et al, 2008)以及不定根形成(Ma et al, 1998)的作用。然而，在橡膠樹離體培養(yǎng)中尚未見有使用AgNO3的相關(guān)研究報道。本研究通過在繼代培養(yǎng)基及體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加不同濃度的AgNO3并設(shè)計不同處理時間，探討AgNO3對長期繼代培養(yǎng)后胚性明顯下降甚至喪失的花藥愈傷組織形態(tài)及其體胚發(fā)生的影響，以期恢復(fù)繼代培養(yǎng)長達4 a的橡膠樹花藥愈傷組織的胚性能力，并提高其體胚發(fā)生頻率，為橡膠樹花藥胚性愈傷組織長期繼代培養(yǎng)過程中胚性的保持提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為本實驗室誘導(dǎo)并持續(xù)繼代培養(yǎng)4 a以上的熱研7-33-97花藥愈傷組織，期間約每20 d用繼代培養(yǎng)基M1(表1)繼代1次。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 本研究所使用的培養(yǎng)基成分及其功用詳見表1。

1.2.2 預(yù)培養(yǎng) 將持續(xù)繼代培養(yǎng)4 a以上呈淺黃色松軟的熱研7-33-97花藥愈傷組織轉(zhuǎn)入添加2.5 mg·L-1AgNO3的繼代培養(yǎng)基M1中進行預(yù)培養(yǎng)，20 d后挑取新長出的愈傷組織繼續(xù)轉(zhuǎn)入含相同濃度AgNO3的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15 d后取預(yù)培養(yǎng)和未預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織，分別用適量液體培養(yǎng)基(成分為去除植物凝膠的繼代培養(yǎng)基)懸浮分散后吸取適量細胞懸液至載玻片上，于倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)的觀察。

1.2.3 體胚誘導(dǎo) AgNO3處理濃度篩選：取上述經(jīng)預(yù)培養(yǎng)35 d后的愈傷組織分別轉(zhuǎn)入添加0、2.5、5、10 mg·L-1AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2(表1)中進行體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，30 d后將愈傷組織轉(zhuǎn)到不含AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)進行誘導(dǎo)和成熟培養(yǎng)， 以不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)入不含AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在相同條件下培養(yǎng)作為對照(CK)。

表 1 本研究所使用的培養(yǎng)基成分及其功用

AgNO3處理時間篩選：取經(jīng)預(yù)培養(yǎng)35 d后的愈傷組織轉(zhuǎn)入添加5 mg·L-1AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2中分別培養(yǎng)30、60、90 d后，再轉(zhuǎn)入去除AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

以上均在(27 ± 1)℃、黑暗條件下進行，每30 d更新1次培養(yǎng)基，90 d后統(tǒng)計每種處理形成的胚狀體總數(shù)和正常體胚數(shù)。每處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)包括3皿，每皿起始接種量約2 g愈傷組織。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)對愈傷組織細胞形態(tài)的影響

圖版Ⅰ顯示，熱研7-33-97花藥愈傷組織在添加2.5 mg·L-1AgNO3的繼代培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)35 d后，原本呈淺黃色質(zhì)地柔軟的愈傷組織逐漸變成鮮黃色且易碎。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)預(yù)處理的愈傷組織細胞大多為不規(guī)則多邊形，細胞內(nèi)含物較稀薄，而經(jīng)預(yù)處理后的愈傷組織細胞呈圓形或橢圓形，細胞內(nèi)含物豐富，屬于典型胚性愈傷組織的細胞形態(tài)。說明在繼代培養(yǎng)基中添加AgNO3能促進胚性愈傷組織形成，使原本胚性特征消失的愈傷組織朝著胚性愈傷組織的方向轉(zhuǎn)變，重新恢復(fù)胚性特征。

2.2 AgNO3對愈傷組織體胚誘導(dǎo)的影響

在體胚誘導(dǎo)的第1個月于培養(yǎng)基中添加不同濃度的AgNO3對愈傷組織的體胚發(fā)生有很大影響。圖版Ⅱ顯示，在含不同濃度AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d后均有白色球形胚的出現(xiàn)， 其中5 mg·L-1AgNO3處理體胚發(fā)生情況明顯優(yōu)于其余濃度；轉(zhuǎn)入去除AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)60 d后，從5 mg·L-1AgNO3處理的愈傷組織獲得的胚狀體總數(shù)和正常體胚數(shù)均顯著高于其余濃度處理，而10 mg·L-1AgNO3處理雖然獲得的胚狀體總數(shù)顯著高于2.5 mg·L-1AgNO3處理，但大部分胚狀體發(fā)育緩慢或畸變，最終僅獲得極少數(shù)的正常體胚(表2)；低于5 mg·L-1AgNO3處理，獲得的正常體胚數(shù)占胚狀體總數(shù)在30%以上，而10 mg·L-1AgNO3處理獲得的正常體胚數(shù)尚不足胚狀體總數(shù)的10%，表明在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加低濃度(0～5 mg·L-1)的AgNO3不僅能促進花藥愈傷組織的體胚發(fā)生，且體胚畸形化的發(fā)生幾率相對較低，而高濃度(10 mg·L-1)的AgNO3雖然在一定程度上也能促進體胚發(fā)生，但不利于其正常發(fā)育，極大增加了畸形化的幾率。對照則完全沒有體胚的形成，表明經(jīng)過4 a以上的繼代培養(yǎng)，其體胚發(fā)生能力已完全喪失，而AgNO3處理使其體胚發(fā)生能力得到了一定恢復(fù)。

2.3 AgNO3處理時間對愈傷組織體胚形成的影響

表3和圖版Ⅲ顯示，在體胚誘導(dǎo)的第1個月添加5 mg·L-1AgNO3，不僅可以顯著提高體胚發(fā)生的頻率， 而且90 d后正常體胚的形成頻率較高； 當愈傷組織在含有5 mg·L-1AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d再轉(zhuǎn)入不含AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，大部分體胚發(fā)生畸變，僅獲得極少數(shù)的正常胚；當愈傷組織一直在含有5 mg·L-1AgNO3的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)90 d后，幾乎所有體胚均畸形化或褐化。這表明只有在體胚誘導(dǎo)的初期即第1個月內(nèi)添加適量的AgNO3才能有效促進體胚的發(fā)生以及正常胚的形成。

圖版 I AgNO3預(yù)培養(yǎng)前后愈傷組織的細胞形態(tài) A. 未預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織(標尺=5 mm)； B. 未預(yù)培養(yǎng)愈傷組織的細胞形態(tài)(標尺=25 μm)； C. 經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織(標尺=5 mm)； D. 經(jīng)預(yù)培養(yǎng)愈傷組織的細胞形態(tài)(標尺=25 μm)。Plate I Cell morphology of callus before and after pre-culture with AgNO3 A. Callus before pre-culture (Bar=5 mm); B. Cell morphology of callus before pre-culture (Bar=25 μm); C. Callus after pre-culture (Bar=5 mm); D. Cell morphology of callus after pre-culture (Bar=25 μm).

圖版 Ⅱ 不同濃度AgNO3處理30 d后體胚發(fā)生情況 (標尺=10 mm) A. 對照； B. AgNO3 0；C. AgNO3 2.5 mg·L-1； D. AgNO3 5 mg·L-1； E. AgNO3 10 mg·L-1。Plate Ⅱ Somatic embryogenesis from different concentrations of AgNO3 treatments for 30 d (Bar=10 mm)A. CK; B. AgNO3 0; C. AgNO3 2.5 mg·L-1; D. AgNO3 5 mg·L-1; E. AgNO3 10 mg·L-1.

圖版 Ⅲ 5 mg·L-1AgNO3處理不同時間體胚發(fā)生情況 (標尺=5 mm) A. 處理30 d； B. 處理60 d； C. 處理90 d。Plate Ⅲ Somatic embryogenesis from different treating time with 5 mg·L-1 AgNO3 (Bar=5 mm)A. Treated by AgNO3 for 30 d; B. Treated by AgNO3 for 60 d; C. Treated by AgNO3 for 90 d.

AgNO3濃度ConcentrationofAgNO3(mg·L?1)愈傷組織接種量Inoculationquantityofcallus(g)胚狀體總數(shù)Totalnumberofembryoid正常體胚數(shù)Numberofnormalsomaticembryo024d2bc2．5213c4b5235a13a10221b2bcCK20e0c

注： 同列數(shù)字不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

Note: Different small letters in the same column indicate significant differences at 0.05 level. The same below.

表 3 AgNO3處理不同時間對體胚發(fā)生的影響

3 討論與結(jié)論

從橡膠樹花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的黃色易碎胚性愈傷組織在長期的繼代保存過程中，顏色逐漸變淺，且容易衰老褐化，雖然在繼代培養(yǎng)基中仍能旺盛生長，但其體胚發(fā)生能力逐年下降甚至完全喪失。類似的現(xiàn)象在其他植物的組織培養(yǎng)過程中也普遍存在(薛美鳳等，2002；肖望等，2008；劉清波等，1998；劉德華，1995)。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其細胞形態(tài)也發(fā)生了變化，多為不規(guī)則多邊形，胞質(zhì)內(nèi)含物較稀薄。本研究在繼代培養(yǎng)基中添加2.5 mg·L-1AgNO3處理一段時間后能使胚性特征消失的橡膠樹花藥愈傷組織重新朝胚性愈傷組織的方向發(fā)展，表明AgNO3在一定程度上能恢復(fù)橡膠樹長期繼代花藥愈傷組織的胚性能力。但有研究指出持續(xù)多代在繼代培養(yǎng)基中添加AgNO3會抑制細胞的生長，使愈傷組織出現(xiàn)褐變衰老的現(xiàn)象，與長期在不含AgNO3的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)有相同的趨勢，只是程度相對較輕(葉新榮等，1994；賴鐘雄等，1997)。因此，在胚性愈傷組織的長期繼代保存過程中宜采用添加和去除AgNO3的繼代培養(yǎng)基交替進行培養(yǎng)，這樣既能維持愈傷組織的胚性能力，同時也可在一定程度上防止愈傷組織由于生長旺盛而過快衰老和褐化。

王澤云等(1984)在橡膠樹花藥培養(yǎng)過程中通過定期連續(xù)切片觀察表明橡膠樹花藥愈傷組織起源于花藥斷口處、藥端、藥隔及藥壁的薄壁細胞，愈傷組織、胚狀體和植株的染色體計數(shù)結(jié)果顯示90%以上屬于二倍體，花藥植株的遺傳表現(xiàn)也進一步證實其起源于體細胞。Hua et al(2010)通過花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織及體細胞胚并通過次生體胚發(fā)生途徑獲得了一批可作為橡膠樹新型種植材料的自根幼態(tài)無性系植株。然而橡膠樹花藥愈傷組織的體胚發(fā)生頻率普遍不高，且因品種和花期的不同而有很大差異(王澤云等，1980)。Modeste et al(2013)在對橡膠樹愈傷組織體胚誘導(dǎo)的研究中優(yōu)化了生長素2,4-D和細胞分裂素KT的濃度及配比，本文則著重于研究在植物生長發(fā)育過程中可能參與多種信號途徑的AgNO3對橡膠樹體胚發(fā)生的影響。研究結(jié)果表明在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加較低濃度的AgNO3可有效促進橡膠樹花藥愈傷組織體胚的形成及正常發(fā)育，而使用高濃度的AgNO3雖然也能誘導(dǎo)出胚狀體，但其后發(fā)育受到嚴重阻礙，最終引發(fā)畸變，這在其它物種中也有類似的報道(Fernandez et al, 1999；Fuentes et al，2000)。而在水曲柳未成熟合子胚為外植體的體胚誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，AgNO3對其體胚誘導(dǎo)的頻率影響不大，但在培養(yǎng)基中添加1 mg·L-1AgNO3的能促進體胚發(fā)生的同步化，并有效阻止畸形胚的形成(Kong et al, 2012)。此外，AgNO3處理時間對體胚發(fā)生及其后的發(fā)育也有很大影響。張鵬等(1997)認為AgNO3處理時間的長短取決于原基形成的時間，培養(yǎng)物一旦形成原基后即可去除AgNO3，長時間在含AgNO3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會產(chǎn)生毒害作用，增加畸變的風險。本研究結(jié)果證實了這一觀點，發(fā)現(xiàn)在橡膠樹花藥愈傷組織的體胚誘導(dǎo)中，球形胚形成后即移除AgNO3能獲得更多的正常胚，而一直在含AgNO3的培養(yǎng)基中進行體胚誘導(dǎo)和成熟培養(yǎng)，將導(dǎo)致所有的胚狀體發(fā)生畸變。

本研究表明AgNO3在一定程度上能恢復(fù)橡膠樹長期繼代花藥愈傷組織的胚性能力，并且具有促進體胚形成的作用，但受其使用濃度和處理時間的限制，只有使用合適的濃度并控制處理時間才能有效促進體胚的形成，高濃度及長時間的處理均不利于體胚的正常發(fā)育。

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Effects of AgNO3on morphology and somatic embryogenesis of anther callus ofHeveabrisiliensis

DAI Xue-Mei, HUANG Tian-Dai, LI Ji, YANG Xian-Feng,XIN Shi-Chao, HUANG Hua-Sun*

( Rubber Research Institute, CATAS/ Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry ofAgriculture/StateCenterforRubberTreeBreeding， Danzhou 571737, Hainan, China )

It is a common problem that the embryogenic competence of rubber tree anther callus might be gradually declined or even completely lost during long-term subculture. As a potent inhibitor of ethylene action, AgNO3is widely used in plant tissue culture. In this study, more than four years old anther callus was used as a material for the research of the appearance and cell morphology changes by pre-culturing on subculture medium supplemented with 2.5 mg·L-1AgNO3. In order to promote the frequency of somatic embryogenesis, different concentrations of AgNO3were added to somatic embryo induction medium, and different treatment time with AgNO3was tested. Total number of embryoid and number of normal somatic embryos were respectively counted after 90 d. The results showed that the pale yellow soft callus could turn into bright yellow fragile callus after pre-culture on medium containing 2.5 mg·L-1AgNO3. Under an inverted microscope, the former was mostly irregular polygon with relatively thin cytoplasm, and the latter was seen to be sphere or ellipsoid, rich in cytoplasm, which was considered to be typical embryogenic cell. Adding 5 mg·L-1AgNO3to somatic embryo induction medium during the first month, significantly enhanced somatic embryo production, while 10 mg·L-1AgNO3inhibited somatic embryogenesis and more abnormal embryos emerged. Development of somatic embryo was obviously hindered when callus was cultured on the induction medium containing 5 mg·L-1AgNO3for more than 2 m, and most of them were deformity. In conclusion, this study recovered the embryogenic characteristics of long-term subculture anther callus to some extent, and increased the frequency of somatic embryogenesis, which provides references for maintaining embryogenic capability during long term subculture of anther callus inHeveabrisiliensis.

Heveabrisiliensis, anther callus, AgNO3, cell morphology, somatic embryogenesis

10.11931/guihaia.gxzw201511029

2015-11-25

2016-04-01

海南省自然科學基金(20163136)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項(1630022013002) [Supported by the the natural Science Foundation of Hainan (20163136); the Fundamental Research Funds for Rubber Research Institute, CATAS (1630022013002)]。

戴雪梅(1981-)，女，廣東五華人，博士，助理研究員，從事橡膠樹組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等研究，(E-mail)xuemeidai@126.com。

*通訊作者： 黃華孫，研究員，博士生導(dǎo)師，從事橡膠樹種質(zhì)資源與品種選育，(E-mail)xjshhs@163.com。

Q945.4

A

1000-3142(2016)12-1426-06

戴雪梅， 黃天帶， 李季， 等. AgNO3對橡膠樹花藥愈傷組織形態(tài)及體胚發(fā)生的影響 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1426-1431

DAI XM, HUANG TD, LI J， et al. Effects of AgNO3on morphology and somatic embryogenesis of anther callus ofHeveabrisiliensis[J]. Guihaia， 2016， 36(12):1426-1431