梁艷，石丹，王艷萍

(1.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)液態(tài)奶事業(yè)部研發(fā)部，呼和浩特010110)

高效液相色譜法檢測乳制品的酪蛋白磷酸肽

梁艷1，石丹1，王艷萍2

(1.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)液態(tài)奶事業(yè)部研發(fā)部，呼和浩特010110)

采用高效液相色譜法對乳制品中的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide,CPP）質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測。樣品通過提取、凈化和上機(jī)測定，可以完全定性和定量分析CPP。結(jié)果表明，采用該方法可以使乳制品中的CPP得到很好的分離，且方法簡單、安全，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢驗數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。

高效液相色譜；乳制品；酪蛋白磷酸肽

0 引言

酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛奶酪蛋白為原料經(jīng)蛋白酶水解、分離純化而得到的生理活性肽[1]，具有結(jié)合鈣和促進(jìn)鈣吸收的功能[2-3]。

目前國內(nèi)外對原料中CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測方法一般采用BaCl2—乙醇法，且乳制品中CPP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)完全靠誠信添加。國內(nèi)報道的乳制品中CPP的檢測方法主要有毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[4-5]、液—質(zhì)聯(lián)用法[6]和高效液相色譜法[7]。但毛細(xì)管區(qū)帶電泳法的干擾因素多、液—質(zhì)聯(lián)用法的檢測成本高、高效液相色譜法沒有CPP標(biāo)準(zhǔn)品[9]。

目前檢測成品中的CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，要先用BaCl2—乙醇法檢測原料CPP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再以原料的添加量來推算成品中的CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)，操作步驟繁瑣，耗時較長，不適于現(xiàn)代化生產(chǎn)的要求。鑒于此，本研究開發(fā)了一種操作簡單，省時，結(jié)果準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

酪蛋白磷酸肽。

BaCl2(分析純)，無水乙醇（色譜純），鹽酸（分析純），硫酸（分析純），三氯乙酸（色譜純），甲醇（色譜純），乙酸（色譜純），乙腈（色譜純）。

高效液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18 250×4.6 mm，5 μm；

柱溫為25℃；

流動相A為質(zhì)量濃度為10 g/L的乙腈甲醇溶液，流動相B為質(zhì)量濃度10 g/L的乙酸水溶液；

梯度洗脫的條件為：0～25 min流動相A由0%→100%；

流速為1.00 mL/min；

進(jìn)樣量為20 μL，紫外檢測器波長為280 nm。

1.2.2 CPP原料的純化

（1）將CPP原料溶解后，調(diào)整pH值為4.6，定容為0.2 g/mL的CPP原料溶液，靜置30 min；

（2）將上述溶液在4℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液，加入BaCl2使其濃度為0.05 mol/L，混勻后，得到一含有BaCl2的CPP原料溶液；

（3）以上述含有BaCl2的CPP原料溶液：無水乙醇=1∶2的體積比，在上述含有BaCl2的CPP原料溶液中加入無水乙醇，混勻后，在4℃靜置12～16 h；

（4）將上述靜置后的溶液在4℃、5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，以上述含有BaCl2的CPP原料溶液∶H2SO4=1∶0.4的體積比，在沉淀中濃度為0.125 M的H2SO4，用濾紙過濾；

（5）取上清液在60～70℃烘干60 min，之后在105℃烘干至恒重，得到純化的CPP原料。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將上述純化的CPP原料用超純水制備質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1，5，10，20 mg（每100 mL中）的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用高效液相色譜儀對該系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行檢測分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 樣品前處理

(1)提取。當(dāng)樣品為液態(tài)乳制品時：稱取20 g樣品，用質(zhì)量濃度為10 g/L的三氯乙酸（質(zhì)量濃度10 g/L的三氯乙酸水溶液）定容至50 mL，超聲10 min，靜置過濾得待凈化液。

當(dāng)樣品為固態(tài)乳制品時：稱取5 g樣品，用質(zhì)量濃度為10 g/L的三氯乙酸溶解后定容至50 mL，超聲10 min，靜置過濾得待凈化液。

（2）凈化。將固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，取適當(dāng)體積的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，棄去淋洗液后用6 mL氨化甲醇洗脫至10 mL具塞試管中，整個固相萃取過程流速不超過1 mL/min，將洗脫液于50℃下用氮氣吹干，得到殘留物；將吹干后得到的殘留物用適當(dāng)體積流動相A定容，過微孔濾膜后，將得到的上清液采用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。

1.3樣品中CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算

樣品中CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/100g）=[CPP上機(jī)質(zhì)量濃度（mg/100 mL）×50 mL]/樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1樣品純化方法的確定

采用不同的樣品純化方法進(jìn)行了實驗，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，在沒有經(jīng)過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖（a）上在標(biāo)志峰附近也有峰出現(xiàn)，而經(jīng)過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖（b）上則少了很多干擾峰，尤其在標(biāo)志峰不明顯的情況下，干擾峰對測試結(jié)果存在極為嚴(yán)重的影響，因此，采用固相萃取對待測樣品進(jìn)行純化可以有效減少樣品中的其他物質(zhì)對檢測造成的干擾，進(jìn)而提高檢測的準(zhǔn)確度。

圖1 不同前處理得到的樣品的色譜

2.2方法的精密度

本研究共進(jìn)行了10次精密度實驗。分別在液奶和奶粉中添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50 mg/100 g和120.0 mg/100 g的CPP，檢測的平均值分別為0.49 mg/100 g和119.6 mg/100 g，相對偏差分別為3.68%和1.89%。由表1可知，采用這種方法測定乳制品中的CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有很好的穩(wěn)定性。方法的回收率如表2所示。

表1 乳制品的精密度試驗結(jié)果

表2 乳制品的回收率實驗結(jié)果

本研究對液奶和奶粉中的CPP的回收率進(jìn)行了測定。在液奶和奶粉樣品中分別加入一定量的CPP，按1.3.4的方法進(jìn)行樣品前處理，1.3.1所述的色譜條件進(jìn)行測定，測得液奶中CPP的加標(biāo)回收率為96%，奶粉中CPP的加標(biāo)回收率為97.1%，均有較好的結(jié)果。

3 結(jié)論

本方法將純化后的CPP原料作為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時間定性，外標(biāo)法定量，進(jìn)行了乳制品中CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜測定法。采用該方法使乳制品中的CPP得到很好地分離，且能夠準(zhǔn)確定量測定強(qiáng)化了CPP的乳制品中CPP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。該方法前處理簡單，實驗條件準(zhǔn)確可靠，不僅可以用來測定乳制品的CPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而且對分析乳制品中所含的其他蛋白類物質(zhì)的分析測定也具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]馮鳳琴,王博誠,倪莉,等.酪蛋白磷酸肽(CPP)分離純化及分子結(jié)構(gòu)的鑒定[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1999,18(4):33-37.

[2]馮鳳琴,王博誠,許時嬰,等.酪蛋白磷酸肽對切除卵巢后老齡雌性大鼠骨密度的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報,2003,25(1):98-100.

[3]陳亞非,陳金星,朱韶娟,等.酪蛋白磷酸肽促進(jìn)人體鈣吸收的作用研究[J].食品科學(xué),2002,23(4):130-132.

[4]牟光慶,張麗萍,王立民,等.毛細(xì)管區(qū)帶電泳測定酪蛋白磷酸肽方法的研究[J].中國食品學(xué)報,2002,2(2)：21-24.

[5]林嶸，周杏琴.毛細(xì)管電泳在HPLV制備分離酪蛋白磷酸肽中的應(yīng)用。國外分析儀器，2000，（3）：41-43.

[6]賴奕堅,陳閩軍,劉玉敏，等.LC-MS法測定鈣片中酪蛋白磷酸肽含量[J].食品科學(xué)，2006，27（12）：672-674.

[7]馮鳳琴,陳閩軍,杜永盛，等.高效液相色譜法測定奶粉中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量[J].中國食品學(xué)報，2006，6（3）：128-131.

[8]龐廣昌，朱文欣，陳慶森.酪蛋白磷酸肽（CPPs）測定方法的研究[J].食品科學(xué)，2001，22（5）：49-52.

[9]王玉瑩，陳錫威，馮風(fēng)琴，等.酪蛋白磷酸肽的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)，2014，35（5）：204-208.

Determination of casein phosphopeptide in dairy products by high performance liquid chromatography

LIANG Yan1,SHI Dan1,WANG Yan-ping2
(1.Inner Mongolia Research Institute of dairy technology C.,Ltd,Hohhot 010100,China;2.Inner Mongolia Yili Industri?al Group Co.,Ltd.liquid milk Business Unit research&development department，Hohhot 010100,China)

A high performance liquid chromatography(HPLC)method was developed and applied to determine casein phosphopeptide（CPP）in dairy products.Extraction and purification from samples were made before HPLC analysis.Excellent separation of CPP was achieved.The developed method proved to be simple,safe,accurate,reliable and reproducible.

high performance liquid chromatography(HPLC);dairy products;casein phosphopeptide（CPP）

TS252.7

A

1001-2230（2016）09-0056-02

2016-01-12

梁艷(1982-)，女，工程師，研究方向為乳品開發(fā)。