覃威 葉水芬 范雯 魏維 許茜 蔡晶

蓯蓉精對MPP+誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細胞損傷后GSK-3β表達的影響

覃威 葉水芬 范雯 魏維 許茜 蔡晶

目的 觀察蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉對1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)損傷的多巴胺能神經(jīng)細胞MES23.5細胞中帕金森病相關(guān)蛋白α-突觸核蛋白(α-synuclein)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Tau蛋白表達的影響，探討蓯蓉精治療帕金森病的作用機制。方法 分別將蓯蓉精水提物及納米微粉經(jīng)PBS溶解后加入培養(yǎng)基使終濃度為100、200、250 μg/mL，孵育MPP+誘導(dǎo)的PD模型細胞24 h后，并設(shè)模型對照(MPP+誘導(dǎo)的PD模型細胞，不加干預(yù))及空白對照組(未經(jīng)任何處理的MES23.5細胞)，以MTT法檢測細胞的存活率，Western Blot法測定各組細胞內(nèi)α-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白表達。結(jié)果 同空白對照組比較，模型組及蓯蓉精水提物及納米微粉100、200、250 μg/mL組α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均升高(分別P<0.01、P<0.05)；與模型組比較，蓯蓉精水提物及納米微粉100、200、250 μg/mL組α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均顯著降低(分別P<0.01、P<0.05)。除蓯蓉精納米微粉100 μg/mL組GSK-3β磷酸化水平與蓯蓉精水提物100 μg/mL組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)外，其余各蓯蓉精納米微粉組α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均低于相同濃度的蓯蓉精水提物組(分別P<0.01、P<0.05)。結(jié)論 蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉均能夠減輕MPP+誘導(dǎo)的PD模型細胞的損傷，且蓯蓉精納米微粉的效果相對較好。其機制可能與蓯蓉精可以減少α-synuclein的聚集，降低GSK-3β的活性，抑制Tau蛋白的過度磷酸化有關(guān)。

蓯蓉精水提物；蓯蓉精納米微粉；帕金森??；MES23.5細胞；神經(jīng)保護

帕金森病(Parkinson disease，PD)是以黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進行性變性壞死、多巴胺遞質(zhì)缺乏為主要病理基礎(chǔ)的常見老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)帕金森相關(guān)蛋白α-突觸核蛋白(α-synuclein)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Tau蛋白對于PD的發(fā)病和發(fā)展以及多巴胺神經(jīng)元的保護具有重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]。本課題組前期研究表明蓯蓉精水提物能夠通過調(diào)控神經(jīng)凋亡因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，抑制多巴胺神經(jīng)細胞的凋亡，起到神經(jīng)保護的作用[4]。本文以多巴胺能神經(jīng)細胞MES23.5細胞為研究對象，用1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridinium，MPP+)誘導(dǎo)建立PD的體外細胞損傷模型，觀察蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉對MPP+損傷的MES23.5細胞的存活率以及PD相關(guān)蛋白α-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白表達的影響，并初步探討其神經(jīng)保護作用機制，以期為防治PD提供相關(guān)實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 MES23.5多巴胺能神經(jīng)細胞系首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)實驗室陳彪教授贈送。蓯蓉精方(由肉蓯蓉10 g，淫羊藿10 g，黃精18 g三味中藥組成，購于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院)，MPP+、4-甲基耦氮唑藍(MTT)、谷氨酰胺為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；α-synuclein、GSK3β、Tau蛋白、磷酸化的Tau蛋白(Phospho-Tau)、磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(Phospho-GSK3β)等抗體均購自于美國的cell signaling Technolegy公司。ELX800酶標儀(美國BioTek公司)，CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraeus)，Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀、電泳槽(美國 Bio-Rad公司)，DU-650型蛋白分析儀(美國 Beckman公司)，5417R高速冷凍離心機(德國 Eppendorf公司)，SXQM型雙行星式球磨機(長沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司)，混合球磨儀(Retsch MM400，德國)。

1.2 方法

1.2.1 蓯蓉精水提物的制備：精確稱取蓯蓉精中藥材(肉蓯蓉10 g，淫羊藿10 g，黃精18 g)，并進行傳統(tǒng)凈化、干燥；將藥品混勻粉碎，浸泡于藥材體積10倍的超純水中1 h，加熱回流2 h，紗網(wǎng)過濾，收集第一次蓯蓉精水提液，再加入藥材體積10倍的蒸餾水，加熱回流2 h，過濾收集第二次蓯蓉精水提液，合并兩次液體，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮藥。濾液濃縮為浸膏，-20℃保存。使用時將蓯蓉精浸膏用PBS溶解配成25 mg/mL母液，超聲波震蕩儀超聲震蕩30 min促進浸膏的溶解，高壓滅菌，-20℃保存待用。

1.2.2 蓯蓉精納米微粉的制備：精確稱取蓯蓉精中藥材(肉蓯蓉10 g，淫羊藿10 g，黃精18 g)，并進行傳統(tǒng)凈化、干燥；將凈化干燥的蓯蓉精中藥材進行常規(guī)粉碎，要求達到可通過200目篩的細粉；將蓯蓉精細粉經(jīng)進一步的冷凍干燥后，采用溫度可控真空高能球磨法制備蓯蓉精納米微粉。具體步驟是：原料蓯蓉精細粉置于配有深冷外套的真空球磨罐中，同時裝入硬質(zhì)合金磨球，使球與蓯蓉精細粉的體積比保持在15︰1～5︰1范圍，高能球磨機以轉(zhuǎn)速300 r/min磨制20 min，得到微粉，稱取適量微粉進行納米級材料加工。將上述研磨粉末于混合球磨儀中加工，以25次/s振蕩20 s，重復(fù)3次。使用時用PBS將蓯蓉精納米微粉溶解配成25 mg/mL母液，超聲30 min，高壓滅菌，-20℃保存待用。

1.2.3 體外PD模型細胞的建立：MES23.5細胞接種于含5%(體積分數(shù))胎牛血清、1%(質(zhì)量濃度)谷氨酰胺、2%(質(zhì)量濃度)50×Sato’s溶液和2%(體積分數(shù))青/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%(體積分數(shù))CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%(質(zhì)量濃度)胰酶消化傳代，收集對數(shù)生長期細胞制成細胞懸液。將細胞以細胞密度1×105接種到96孔板中，加入終濃度為100 μmol/L的MPP+培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，建立體外PD模型細胞。

1.2.4 選取適宜的蓯蓉精水提物和納米微粉的干預(yù)濃度及干預(yù)時間：取上述PD模型細胞，分別加入終濃度為10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL的蓯蓉精水提物和蓯蓉精納米微粉培養(yǎng)液，作為藥物干預(yù)組；未加藥物的細胞為模型對照組；未加MPP+以及未加藥物的正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的MES23.5細胞為空白對照組，每個組別均設(shè)6個復(fù)孔。各組細胞培養(yǎng)24 h和48 h后進行MTT檢測細胞存活率，步驟如下：向96孔板中加入5 mg/mL的MTT，37℃培養(yǎng)4小時后，加入150 μL的DMSO，震蕩10 min，在酶標儀上選擇490 mm的波長，檢測各個孔的吸光值，計算細胞的存活率。細胞存活率(%)=實驗組吸光度均值/空白對照組吸光度均值×100%。選取各蓯蓉精水提物和納米微粉組中細胞存活率最高三組的濃度、最短時間進行后續(xù)的實驗。

1.2.5 Western Blot法測定帕金森病相關(guān)蛋白α-synuclein、GSK-3β、Tau：取體外PD模型細胞，按上述預(yù)實驗中選擇的蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉濃度及時間進行干預(yù)。然后收集細胞，向上述細胞加入含有RIPA、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的混合裂解液冰上裂解30 min，收集細胞碎片和裂解液于4℃下12000 r/min離心5 min，取上清，提取蛋白，按照同樣的方法重復(fù)提取蛋白3次。BCA蛋白定量；SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入α-synuclein單克隆抗體(1︰1000)、GSK-3β單克隆抗體(1︰1000)、Phospho-GSK3β單克隆抗體(1︰800)、Tau單克隆抗體(1︰1000)、Phospho-Tau單克隆抗體(1︰800)、β-actin單克隆抗體(1︰1000)， 4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1︰5000)反應(yīng)1 h；膜上加ECL顯影劑，反應(yīng)2 min，常規(guī)顯影，用Image Lab軟件對蛋白的表達進行半定量分析，分別計算目標蛋白與β-actin、P-GSK-3β與GSK-3β、P-Tau與Tau蛋白的灰度值比。目標蛋白與β-actin的比值表示各個目標蛋白的相對表達量，P-GSK-3β與GSK-3β的比值表示GSK-3β的磷酸化水平，P-Tau與Tau蛋白的比值表示Tau蛋白磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，用均數(shù)±標準差(x2±s)表示。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD法；方差不齊則采用Games-Howell法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物干預(yù)的濃度和時間的選擇 結(jié)果見表1、表2。與空白對照組比較，模型組及各蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉組細胞存活率顯著降低(均P<0.01)；與模型組比較，各蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉組細胞存活率均有一定程度的升高(均P<0.01)，而且蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉100、200、250 μg/mL組的細胞存活率均高于其他濃度組及模型組(均P<0.01)。因此，在后續(xù)試驗中，選擇濃度為100、200、250 μg/mL蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉干預(yù)24 h作為干預(yù)條件。

表1 各組MPP+誘導(dǎo)的PD模型細胞存活率比較(n=6，%，±s)

注：與空白對照組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與水提物 10組比較：ΔP<0.01；與水提物50組比較：○P<0.05，○○P<0.01；與水提物 100組比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01；與水提物 200組比較，▲P<0.01；與水提物 250組比較，▼P<0.01；與水提物 500組比較，★P<0.05；水提物10、50、100、200、250、500、1000分別表示蓯蓉精水提物濃度為10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL

表2 不同濃度蓯蓉精納米微粉對MPP+誘導(dǎo)MES23.5細胞損傷后細胞存活率的影響(n=6，%，±s)

注：與空白對照組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.01；與納米微粉 10組比較：ΔP<0.01；與納米微粉50組比較：○P<0.05，○○P<0.01；與納米微粉 100組比較：☆P<0.01；與納米微粉 200組比較，▲P<0.01；與納米微粉 250組比較，▼P<0.01；與納米微粉 500組比較，★P<0.05；水提物10、50、100、200、250、500、1000分別表示蓯蓉精納米微粉濃度為10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL

2.2 各蓯蓉精水提物組各及蓯蓉精納米微粉組帕金森病相關(guān)蛋白表達 與空白對照組比較，模型組α-synuclein蛋白表達量及GSK-3β蛋白和Tau蛋白的磷酸化水平均顯著升高(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，各蓯蓉精水提物組及各蓯蓉精納米微粉組α-synuclein蛋白表達量、GSK-3β蛋白和Tau蛋白的磷酸化水平降低(P<0.01或P<0.05)；蓯蓉精納米微粉100、200、250 μg/mL組α-synuclein蛋白表達量、Tau蛋白磷酸化水平均低于同濃度蓯蓉精水提物組(均P<0.01)；蓯蓉精納米微粉200、250 μg/mL組GSK-3β蛋白的磷酸化水平亦低于同濃度蓯蓉精水提物組(均P<0.01)，但蓯蓉精納米微粉100 μg/mL與蓉精水提物100 μg/mL組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體見圖1、表3。

3 討論

注：1表示空白對照組；2表示模型組；3、4、5分別表示蓯蓉精水提物濃度為100、200、250 μg/mL，6、7、8分別表示蓯蓉精納米微粉濃度為100、200、250 μg/mL 圖1 蓯蓉精水提物及納米微粉干預(yù)后MES23.5細胞中a-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白的表達及磷酸化水平

PD是一種慢性、進展性的、多因素的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂性疾病，病理過程包括炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)失衡、細胞凋亡等[1]。PD的治療方法主要包括口服左旋多巴、多巴胺受體激動劑和B型單胺氧化酶抑制劑，外科手術(shù)植入電極深部刺激丘腦底核和蒼白球，或?qū)⑸窠?jīng)干細胞移植到紋狀體。近年來，神經(jīng)干細胞用于PD的治療逐漸受到重視[5]。本文將在以往的研究基礎(chǔ)上進一步探討補腎復(fù)方蓯蓉精對多巴胺能神經(jīng)細胞的保護作用。

MES23.5細胞是一種雜交瘤性多巴胺能神經(jīng)元細胞系，是由大鼠的胚胎中腦細胞與小鼠神經(jīng)母細胞瘤一膠質(zhì)瘤細胞系N18TG2雜交而成，可替代原代培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元用于研究神經(jīng)變性疾病PD[6]。本文采用MPP+誘導(dǎo)MES23.5細胞建立體外PD模型，為研究蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉的神經(jīng)保護作用及其相關(guān)的機制提供了良好的載體。

中藥可以通過各種機制發(fā)揮著神經(jīng)保護作用，包括抗氧化、抗炎、清除自由基、抗凋亡等[7]。本研究中所用蓯蓉精水提物及其納米微粉制劑是由肉蓯蓉、淫羊藿、制黃精組成的復(fù)方補腎制劑。中藥納米制劑由于其特有的理化性質(zhì)，具有細胞破壁率高、有效物質(zhì)溶出率高的優(yōu)點，可提高生物利用度，增加藥物對血腦屏障或生物膜的通透性，增強藥物靶向性，從而降低給藥劑量，提高藥效[8]。本實驗中采用蓯蓉精水提物和納米微粉對MPP+誘導(dǎo)損傷的多巴胺能神經(jīng)細胞MES23.5進行干預(yù)，同模型組相比各濃度的蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉組細胞存活率均有一定程度的的升高，其中以100、200、250 μg/mL三組升高最為顯著。表明時當蓯蓉精濃度超過250 μg/mL時，細胞毒性增強。因此，選擇濃度為100、200、250 μg/mL蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉干預(yù)24 h作為干預(yù)條件。上述結(jié)果也提示在未來研究中藥的神經(jīng)保護作用的同時也應(yīng)該注重毒理學(xué)研究，充分考慮毒性作用給實驗結(jié)果帶來的影響。

表3 各蓯蓉精水提物組及各蓯蓉精納米微粉組目的蛋白表達量及磷酸化水平比較(n=3，±s)

注：與空白對照組比較：*P<0.05, **P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與水提物100比較：ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；與水提物200比較：○P<0.05，○○P<0.01；與水提物250比較：☆P<0.01；水提物100、200、250分別表示蓯蓉精水提物濃度100、200、250 μg/mL，納米微粉100、200、250分別表示蓯蓉精納米微粉的濃度為100、200、250 μg/mL

α-synuclein是由140個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，正常生理狀況下能形成穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)。PD患者α-synuclein的突變可破壞α螺旋結(jié)構(gòu)，使之形成β折疊，進而聚集并產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性作用的寡聚體，最終導(dǎo)致神經(jīng)變性[9]。Tau蛋白是神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達的微管相關(guān)蛋白，其生物學(xué)功能是促進微管形成和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的作用，參與神經(jīng)元的生長發(fā)育，維持軸突的形態(tài)。Tau的過度磷酸化與細胞凋亡以及神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂有重要的聯(lián)系[10]。糖元合成酶激酶3β(GSK-3β)是GSK-3兩種形式中較小的蛋白，是一段具有482個氨基酸組成的單鏈多肽，相對分子質(zhì)量(Mr)為47 000，其結(jié)構(gòu)中包含一個中心蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域。GSK-3β是最重要的催化Tau蛋白磷酸化的蛋白激酶之一，它可催化Tau蛋白上多個絲氨酸或蘇氨酸位點的磷酸化。GSK-3β活性表達增加，可以使Tau蛋白的磷酸化增強[11]。進一步的研究表明α-synuclein和Tau兩者之間存在著密切的聯(lián)系。α-synuclein蓄積很可能誘發(fā)了GSK-3β的活性，進而促進Tau蛋白的磷酸化水平的增加，α-synuclein充當調(diào)節(jié)Tau蛋白和GSK-3β的連接，引導(dǎo)GSK-3β對Tau蛋白磷酸化[12]。

本實驗顯示，采用MPP+誘導(dǎo)MES23.5細胞損傷，建立體外PD模型細胞，然后通過蓯蓉精水提物或蓯蓉精納米微粉干預(yù)后，細胞的存活率相對于模型組有顯著的上升，模型組細胞內(nèi)的α-synuclein以及磷酸化的GSK-3β、Tau蛋白的表達量均明顯增高；而通過蓯蓉精水提物或蓯蓉精納米微粉干預(yù)后，α-synuclein以及磷酸化的GSK-3β、Tau蛋白的表達量均明顯降低，且蓯蓉精納米微粉的效果更好，其可能機制為蓯蓉精水提物或蓯蓉精納米微粉干預(yù)模型組細胞后，α-synuclein的聚集減少，抑制了GSK-3β的活性，從而抑制了Tau蛋白的過度磷酸化，提高了細胞的存活率，起到神經(jīng)保護的作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示在神經(jīng)保護以及PD的防治方面，蓯蓉精納米微粉較蓯蓉精水提物具有較好的效果，為帕金森的防治提供了新的思路。本實驗的不足之處是對高濃度藥物配方的毒理作用沒有進行進一步測試。中藥的毒性對藥物的治療干預(yù)效果可能有一定的拮抗作用，因此未來應(yīng)進行更深入的探索，以更好的發(fā)揮中藥的優(yōu)勢。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Effects of Congrongjing on the expression of GSK-3β protein after the injury of dopaminergic neurons induced by MPP+

QINWei，YEShuifen，F(xiàn)ANWen，WEIWei，XUQian，CAIJing*.

*DepartmentofNeurology，CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，F(xiàn)ujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhouFujian350122，China

Corresponding author：CAI Jing，Email：caij1@163.com

Objective To observe the effect of Congrongjing aqueous extract and Congrongjingnano-powders on the expression of Parkinson’s disease(PD)associated proteins,α-synuclein，GSK-3βand Tau in injured dopaminergic neurons induced by 1-methyl-4-phenyl-pyridinium(MPP+)and investigate the mechanism of Congrongjing in the treatment of PD. Methods Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders dissolved by PBS medium were added into the culture medium and different concentrations of solution(100，200，250 μg/mL)were prepared. Then the PD model cells induced by MPP+were cultured by the above culture medium for 24 h，model control group(PD model cells were induced by MPP+，without intervention)and blank control group(MES23.5 cells without any treatment)were set up，MTT method was used to detect the cell survival rate，changes in expression of a-synuclein，GSK-3β and Tau protein in cells were determined by Western blot. Results Compared with the blank control group，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein increased in the model control group，Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders 100，200，250 μg/mL groups(P<0.01，P<0.05，respectively).Compared with the model control group，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein decreased in the Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders 100，200，250 μg/mL groups (P<0.01，P<0.05，respectively).Except for the phosphorylation level of GSK-3β protein between the Congrongjing aqueous extract 100 μg/mL groupand the Congrongjin gnano-powders 100 μg/mL group(P>0.05)，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein of Congrongjing nano-powders groups were significantly lower than those of the Congrongjing aqueous extract group(P<0.01，P<0.05，respectively).Conclusions Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders can reduce the injury of MES23.5 cells induced by MPP+and the effect of Congrongjing nano-powders is better. The mechanism may be related to reducing the accumulation of the α-synuclein and theactivity of GSK-3β, inhibiting the excessive phosphorylation of Tau protein.

Congrongjing aqueous extract；congrongjing nano-powders；Parkinson's disease；MES23.5 cells；neuroprotective

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.06.007

國家衛(wèi)生和計劃生育委員會科研基金項目(WKJ-FJ-38)；福建省自然科學(xué)基金面上項目(2015J01686)；校管重點學(xué)科專項資助(X2014010-學(xué)科)

350122 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院(覃威)；364000福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院老年病科(葉水芬)；361026 廈門市海滄醫(yī)院綜合內(nèi)科(范雯)；441003湖北省襄陽市第四七七醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(魏維)；350122 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院(許茜、蔡晶)

蔡晶，Email：caij1@163.com

R742.5

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1006-2963(2016)06-0415-06

2015-11-06)