李 娟，劉曉紅，宋 潔，李 莉

(1.遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003；2.遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所，遼寧 丹東 118003)

人工栽培蛹蟲草致病木霉CCBH-M2的鑒定及生物學(xué)特性

李 娟1, 2，劉曉紅1, 2，宋 潔1, 2，李 莉1

(1.遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003；2.遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所，遼寧 丹東 118003)

自人工栽培蛹蟲草培養(yǎng)料中分離得到1株致病木霉CCBH-M2，通過對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該木霉菌株為鉤狀木霉Trichodermahamatum(Bon.)Bain.。實(shí)驗(yàn)對(duì)該致病菌進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，結(jié)果表明，溫度、pH值及培養(yǎng)料含水量對(duì)該鉤狀木霉生長影響顯著(P<0.05)，其最適生長溫度為26 ℃，最適pH值為6.0，培養(yǎng)料最適含水量為50 %～60 %。該研究結(jié)果是鉤狀木霉對(duì)人工栽培蛹蟲草具有致病性的首次報(bào)道。

蛹蟲草；致病木霉；鉤狀木霉；生物學(xué)特性

蛹蟲草Cordycepsmilitaris(L.: Fr.)Link，屬蟲草科Cordycipitaceae，蟲草屬Cordyceps[1]，是珍貴的食藥用真菌。該菌含蟲草素、多糖、蟲草酸、超氧化物歧化酶等多種生物活性成分，具有抗腫瘤、抑菌、提高免疫力、清除自由基等功效[2]。蛹蟲草子實(shí)體已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化人工栽培，然而在栽培過程中，常發(fā)生病害。食用菌病害是指在栽培過程中，食用菌受到其他有害微生物的侵染，其正常的生長發(fā)育受到影響和抑制，導(dǎo)致菌絲體和子實(shí)體異常甚至死亡，對(duì)食用菌生產(chǎn)造成損失的現(xiàn)象，引起食用菌病害的微生物主要包括真菌、細(xì)菌及病毒[3]。

木霉TrichodermaPers.屬于半知菌類的絲孢綱Hyphomycetes，絲孢目Hyphomycetales，叢梗孢科Moniliaceae，其有性階段若發(fā)現(xiàn)一般為子囊菌門Ascomycota，肉座菌目Hypocreales，肉座菌科Hypocreaceae的肉座菌屬HypocreaFr.[4-5]。木霉是香菇、平菇、金針菇、木耳等食用菌生產(chǎn)中主要的競(jìng)爭(zhēng)性雜菌和病原菌，對(duì)多種食用菌子實(shí)體具有很強(qiáng)的寄生性，常在食用菌的制種和栽培過程中污染培養(yǎng)料和菌絲體，影響產(chǎn)品質(zhì)量并造成減產(chǎn)[6]。根據(jù)調(diào)查，木霉亦是蛹蟲草栽培過程中的常見真菌病害，一旦發(fā)病會(huì)造成減產(chǎn)，甚至絕收。但至今尚未見關(guān)于蛹蟲草木霉病害病原菌的系統(tǒng)研究報(bào)道。

本文自被木霉侵染的蛹蟲草栽培料中分離木霉菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析確定其種屬，并研究了溫度、pH值和培養(yǎng)料含水量對(duì)木霉菌株生長的影響，以期為該菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 木霉菌株CCBH-M2分離自遼寧省丹東市金山蟲草合作社感染木霉的蛹蟲草栽培盒，現(xiàn)保存于遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖10.0 g、瓊脂20.0 g、水1000 mL；小麥培養(yǎng)基：小麥70 %、蠶蛹粉23 %、蔗糖5 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉 0.5 %、VB1微量、含水量60 %。

1.1.3 分子生物學(xué)試劑 真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、引物ITS1/ITS4、TaqPCR Master Mix (2x，without dye)、DNA Marker(D2000)、6×loading bufffer均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株CCBH-M2的形態(tài)學(xué)鑒定 將木霉菌株CCBH-M2活化后，用直徑0.6 cm的打孔器制備菌餅，接種至PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d，每天觀察菌落形態(tài)、顏色等性狀。采用插片法培養(yǎng)菌株CCBH-M2，具體方法為：在距離菌餅2 cm處，將滅菌蓋玻片以45°角插入培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)。5 d后用鑷子取出蓋玻片，有菌面朝上置于載玻片上，顯微鏡下觀察孢子、分生孢子梗及瓶梗的形態(tài)特征。按照楊合同[7]的分類方法對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 菌株CCBH-M2的ITS序列分析 參照潘力[8]方法培養(yǎng)菌株CCBH-M2獲得菌絲體，按照基因組DNA快速抽提試劑盒的步驟要求提取木霉菌株的基因組DNA，采用通用引物(ITS1: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG- 3’；ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3’)進(jìn)行ITS序列的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系(50 μl)：1×TaqPCR Master Mix 25 μl，DNA模板2 μl(0.1～10 ng)，引物(10 μmol/L)各2 μl，ddH2O 19 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后于-20 ℃冰箱保存，送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行純化，雙向測(cè)序并拼接輸出全序列。通過NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中的Blast檢測(cè)并下載已測(cè)序列的相似序列和參考序列，運(yùn)用ISTH(www.isth.info)數(shù)據(jù)庫中的TrichOKey2.0[9]檢測(cè)下載序列的準(zhǔn)確性。運(yùn)用軟件ClustalX(Version 1.83)對(duì)多序列進(jìn)行比對(duì)。運(yùn)用分析軟件Mega6.06中的鄰位相連法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.3 菌株CCBH-M2的生物學(xué)特性研究 (1)溫度對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響：菌株CCBH-M2在PDA平板活化后，用直徑0.6 cm的無菌打孔器制備菌餅，接種至直徑9.0 cm的PDA平板中央，分別置于20、24、26、28、30、32、35、40 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

(2)pH值對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響： PDA培養(yǎng)基滅菌前用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值分別至2、3、4、5、6、7、8、9、10。按照(1)中的方法接種木霉菌株CCBH-M2，在最適溫度下培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

(3)培養(yǎng)料含水量對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響：培養(yǎng)料為小麥培養(yǎng)基，按照吳小平[10]的方法，先將小麥烘干，再按比例加水拌料，配制成含水量分別為45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %的培養(yǎng)料，自然pH值，等量分裝于20 mm×200 mm的試管中，滅菌后接種木霉菌株CCBH-M2，在最適溫度下培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。5 d后測(cè)量試管中菌絲生長前端至培養(yǎng)料表面的距離，計(jì)算菌絲生長速度。

儒家思想之內(nèi)涵、處事原則及方式，無不體現(xiàn)著對(duì)經(jīng)與權(quán)的闡釋。權(quán)，從字面意思來理解是變化，似乎與原則相悖，但卻是對(duì)經(jīng)的完美補(bǔ)充，于是便有君子之中庸，有經(jīng)有權(quán)，小人反中庸。權(quán)，這一尺度生于人心權(quán)衡機(jī)能，生成固定之經(jīng)后，又可以反過來幫助人在具體情境中進(jìn)行尺度的判斷和運(yùn)用。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理及作圖采用Excel(Word2003)。運(yùn)用軟件SPSS 18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性分析采用鄧肯氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

菌株CCBH-M2的侵染主要出現(xiàn)在蛹蟲草栽培的轉(zhuǎn)色提溫階段。發(fā)病初期，被木霉菌株CCBH-M2侵染的蛹蟲草培養(yǎng)料長出白色菌絲，生長較快。5～7 d后，病原菌產(chǎn)生黃綠色孢子，菌絲和孢子覆蓋整個(gè)培養(yǎng)料。蛹蟲草菌絲和子實(shí)體的生長完全被病原菌抑制，導(dǎo)致子實(shí)體難以形成或子實(shí)體矮小畸形，采收期蛹蟲草子實(shí)體出現(xiàn)倒伏，造成產(chǎn)量大減。

圖1 菌株CCBH-M2的菌落形態(tài)Fig.1 Colony of strain CCBH-M2

圖2 菌株CCBH-M2的分生孢子梗及瓶梗(×400)Fig.2 Conidiophores and phialides of strain CCBH-M2

圖3 菌株CCBH-M2的分生孢子(×1000)Fig.3 Conidia of strain CCBH-M2

2.2 菌株CCBH-M2的形態(tài)特征

菌株CCBH-M2在PDA平板上，生長較慢，菌落呈白色，菌絲稀疏，7～10 d后產(chǎn)生黃綠色分生孢子，菌落背面無色(圖1)。

圖4 菌株CCBH-M2的ITS 序列PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 ITS amplification electrophoresis of strain CCBH-M2

分生孢子梗具不規(guī)則分枝，波狀彎曲，明顯延長成不育枝，瓶梗橢球形，分生孢子黃綠色，表面光滑，橢圓形，3.8～4.0 μm×2.2～2.5 μm(圖2～3)。

對(duì)照《木霉分類與鑒定》[7]及孫軍[11]和張廣志[12]的木霉分類檢索表，菌株CCBH-M2的形態(tài)學(xué)特征與已知的鉤狀木霉Trichodermahamatum(Bon.)Bain.一致，故將其初步鑒定為鉤狀木霉。

2.3 菌株CCBH-M2的ITS序列分析

以菌株CCBH-M2的基因組DNA為模板，對(duì)其ITS片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得600 bp左右的特異性片段(圖4)。經(jīng)測(cè)序并拼接，獲得長度為561 bp的堿基序列(圖5)。將所測(cè)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast序列檢索，運(yùn)用ISTH數(shù)據(jù)庫中的TrichOKey2.0對(duì)下載序列的準(zhǔn)確性進(jìn)行檢測(cè)。選取其中5個(gè)準(zhǔn)確、典型菌株的ITS序列，以產(chǎn)黃青霉PenicilliumchrysogenumThom和白地霉geotrichumcandidumLink為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖6)。結(jié)果表明，菌株CCBH-M2與T.hamatum聚類在一個(gè)分支上。因此，結(jié)合形態(tài)特征及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株CCBH-M2鑒定為鉤狀木霉T.hamatum。

圖5 菌株CCBH-M2的ITS 序列Fig.5 ITS sequence of strain CCBH-M2

圖6 基于菌株CCBH-M2 ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of CCBH-M2and related strains

圖7 不同溫度對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響Fig.7 Effects of different temperature on strain CCBH-M2

2.4 菌株CCBH-M2的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響 圖7表明，溫度對(duì)其生長影響顯著(P<0.05)，菌株CCBH-M2的菌落直徑隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，該菌的生長完全受到抑制。在26 ℃下菌株CCBH-M2菌落直徑顯著大于其它處理組(P<0.05)，表明該菌的最適生長溫度為26 ℃。

2.4.2 pH值對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響 如圖8所示，pH對(duì)菌株CCBH-M2的生長影響顯著(P<0.05)，其菌落直徑隨著pH值的升高同樣表現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為6時(shí)，菌落直徑顯著高于其它處理組(P<0.05)，表明該菌的最適生長pH值為6，喜微酸環(huán)境。

2.4.3 培養(yǎng)料含水量對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響 從圖9可知，培養(yǎng)料含水量在50 %～60 %，測(cè)試菌株具有較高的生長速度，且此范圍內(nèi)各組間差異不顯著(P>0.05)，此范圍即為木霉菌株CCBH-M2培養(yǎng)料的最適含水量。當(dāng)含水量過低(45 %)和過高(>70 %)時(shí)菌絲生長較慢，且試驗(yàn)過程中觀測(cè)到含水量低產(chǎn)孢量大，含水量高產(chǎn)孢能力下降。

圖8 不同pH值對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響Fig.8 Effects of different pH value on strain CCBH-M2

圖9 培養(yǎng)料含水量對(duì)菌株CCBH-M2生長的影響Fig.9 Effects of different water content on strain CCBH-M2

3 討 論

據(jù)報(bào)道，危害香菇、平菇、金針菇、木耳等食用菌的木霉種類主要包括綠色木霉TrichodermaviridePers.、深綠木霉T.atroviride、康氏木霉T.koningiiOudem、哈茨木霉TrichodermaharzianumRifai、棘孢木霉TrichodermasperellumSamuels，Lieckfeldt & Nirenberg等[6,10,13～15]，而對(duì)蛹蟲草致病木霉的研究則至今尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究自人工栽培蛹蟲草培養(yǎng)料中分離到一株致病木霉，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析確定其為鉤狀木霉。在對(duì)該菌進(jìn)行ITS序列分析時(shí)，常規(guī)的方法是利用NCBI提供的搜索工具BLAST進(jìn)行相似序列檢索，但該方法對(duì)木霉種類鑒定存在明顯的缺陷，因?yàn)樵摂?shù)據(jù)庫中大約40 %的木霉種類未經(jīng)鑒定確認(rèn)，或者在種的水平上鑒別錯(cuò)誤[16]。因此，通過該方法獲得的相似序列可信度低。而ISTH數(shù)據(jù)庫是國際真菌分類委員會(huì)(國際微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì))的木霉專門委員會(huì)利用修訂和確認(rèn)的序列數(shù)據(jù)建立了一個(gè)全自動(dòng)的木霉種類鑒定方法[4]。本研究將Blast獲得相似序列，通過ISTH數(shù)據(jù)庫中的TrichOKey2.0進(jìn)行準(zhǔn)確性測(cè)定后，結(jié)合兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的信息，選取準(zhǔn)確典型的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，從而對(duì)木霉菌株進(jìn)行可靠的鑒定。

鉤狀木霉的生物學(xué)特性研究顯示，其生長的最適溫度為26 ℃，最適pH值為6.0，最適培養(yǎng)料含水量為50 %～60 %?？梢姼邷?、高濕及弱酸性環(huán)境利于該菌的生長，因此該病原菌易發(fā)生于蛹蟲草栽培的轉(zhuǎn)色提溫階段。本研究結(jié)果為蛹蟲草生產(chǎn)栽培過程中對(duì)該致病菌采取有效的防治措施提供了重要的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Identification of PathogenicTrichodermaCCBH-M2 from CultivatedCordycepsmilitarisand Its Biological Characteristics

LI Juan1, 2, LIU Xiao-hong1, 2, SONG Jie1, 2, LI Li1

(1. Agricultural College, Eastern Liaoning University, Liaoning Dandong 118003, China；2. Institute of Applied Biology, Eastern Liaoning University, Liaoning Dandong 118003, China)

A pathogenicTrichodermastrain CCBH-M2 was isolated from culture material of cultivatedCordycepsmilitaris. The morphological characteristics and phylogenetic analysis showed that strain CCBH-M2 wasTrichodermahamatum(Bon.)Bain. The biological characteristics ofT.hamatumwere studied and the results showed that temperature, pH value and water content of the culture medium significantly influenced the growth of strain CCBH-M2(P<0.05), and its optimum growth temperature was 26 ℃, the optimum pH value was 6.0 and the optimum water content of culture materials was 50 %-60 %. The result was the first report ofT.hamatumpathogenicity on cultivatedC.militaris.

Cordycepsmilitaris; PathogenicTrichoderma;Trichodermahamatum; Biological characteristics

1001-4829(2016)09-2216-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.035

2015-10-12

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目 (L2012472)；丹東市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(農(nóng)業(yè)公關(guān)及產(chǎn)業(yè)化)(201402)

李 娟(1980-)，女，遼寧朝陽人，博士，講師，主要從事食用菌栽培及病害防治，E-mail: smilejuanzili@sina.com。

S646.9

A