岳紅紅, 趙 亮, 姜 威

表達(dá)黑色素瘤抗原-A3重組質(zhì)粒的免疫原性研究

岳紅紅1, 趙 亮2, 姜 威2

目的 對(duì)新型肺癌基因疫苗的免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法 利用Furin 2A將黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)基因與GM-CSF基因進(jìn)行連接，克隆入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建基因疫苗pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF。將該疫苗體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用免疫印跡和ELISA的方法對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。然后，將疫苗及對(duì)照組分別免疫接種小鼠，通過(guò)ELISA和ELISPOT法初步檢測(cè)其誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。 結(jié)果 成功克隆并構(gòu)建了肺癌基因疫苗pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF，并證實(shí)了其在真核細(xì)胞中表達(dá)。疫苗免疫接種小鼠模型后的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照組以及單獨(dú)抗原組相比，pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)論 pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF能夠同時(shí)誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其抗腫瘤效應(yīng)將通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)深入研究。

黑色素瘤相關(guān)抗原 A3 (MAGE-A3)；肺癌；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；基因疫苗

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，已成為死亡的首要病因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年新確診肺癌達(dá)160 萬(wàn)，每年有 140 萬(wàn)人死于肺癌[1]。 肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型是非小細(xì)胞肺癌 (nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)，占肺癌總數(shù)的 81%，有 60% 患者在就診時(shí)已屬進(jìn)展期或難以治愈的Ⅲ b期或Ⅳ期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后極差[2]。尋找有效的治療方法是當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，隨著靶向治療和免疫治療等新興療法的出現(xiàn)，NSCLC 的臨床治療取得了很大的進(jìn)展。作為主動(dòng)免疫治療方式的基因疫苗由于其能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，在腫瘤的免疫治療研究中成為熱點(diǎn)之一[3]。在免疫治療中，靶抗原的選擇對(duì)治療的特異性和有效性具有重要的作用。MAGE-A3 在肺癌等多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)，是真正的腫瘤特異性抗原。MAGE-A3重組蛋白和免疫佐劑組成的蛋白疫苗用于肺癌治療的研究已有報(bào)道。本研究將MAGE-A3基因與粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)基因構(gòu)建于同一個(gè)真核表達(dá)載體，并對(duì)其誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 基因疫苗的構(gòu)建和鑒定 將MAGE-A3(GenBank：GI 29029622)的胞外段編碼區(qū)和GM-CSF(GenBank序列號(hào): M11220.1)的編碼區(qū)基因之間以Furin /2A[弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽序列進(jìn)行連接，構(gòu)成融合基因MAGE-A3-F2A-GM-CSF，融合基因的上、下游分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和 EcoRⅠ。融合基因在Invitrogen公司進(jìn)行全基因合成，然后將其克隆至基因疫苗常用表達(dá)載體pVAX1，獲得基因疫苗pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF。利用限制性?xún)?nèi)切酶的酶切和基因測(cè)序?qū)蛞呙邕M(jìn)行鑒定。主要步驟：利用NEB公司的內(nèi)切酶BamHⅠ(R0136V)和EcoRⅠ(R0101V)，對(duì)獲得的基因疫苗進(jìn)行酶切，能夠切下與目的基因MAGE-A3-F2A-GM-CSF大小一致的條帶，即為構(gòu)建成功。1.2 基因疫苗的真核表達(dá) 為了驗(yàn)證pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF的真核表達(dá)情況，利用Invitrogen公司提供的脂質(zhì)體2000將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞(購(gòu)于協(xié)和細(xì)胞庫(kù))，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和六孔板中的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)要步驟如下：轉(zhuǎn)染前一天，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，到轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度應(yīng)達(dá)到80%；利用無(wú)血清培養(yǎng)基分別配置轉(zhuǎn)染A液和B液，A液含有10 μl的轉(zhuǎn)染試劑，B液含有4 μg的轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒，A和B液在室溫下放置5 min后，將A液加入到B液中，此為C液，輕柔混勻，室溫放置20 min。將C液小心的加入到含有2 ml培養(yǎng)基和80%匯合度細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中，輕柔混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 h。孵育結(jié)束后，用新鮮培養(yǎng)基洗滌6孔板中的細(xì)胞，最后加入2 ml新鮮的完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行檢測(cè)。為了檢測(cè)MAGE-A3的表達(dá)，將收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗滌后，用RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液裂解細(xì)胞，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)方法將細(xì)胞蛋白進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，然后以鼠源抗人MAGE-A3抗體(Abcam公司)和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)分別為一抗和二抗，并分別孵育,通過(guò)化學(xué)發(fā)光試劑 (electrochemiluminescence, ECL)顯色，并用化學(xué)發(fā)光儀拍照。GM-CSF是分泌表達(dá)，所以將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液包被于96孔微板中，采用鼠源的抗人GM-CSF單克隆抗體(Abcam公司)作為一抗，二抗為辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，顯色并終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀檢測(cè)(美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)：Bio-Rad imark)波長(zhǎng)在OD450處的吸光度值，樣品孔數(shù)值大于等于陰性孔數(shù)值2倍以上，認(rèn)定為陽(yáng)性。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和免疫接種 4～6周齡的雌性BalB/c小鼠購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，體重20～25 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)按照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南”的要求執(zhí)行。32只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組(配對(duì)比較法隨機(jī)分組),空白對(duì)照組、空質(zhì)粒pVAX1組，pVAX1- MAGE-A3組和pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF組，每組8只。每只小鼠肌肉注射50 μg質(zhì)粒，并進(jìn)行電穿孔刺激，分別在一免后的第7天和第14天加強(qiáng)免疫。末次免疫后的第14天，處死小鼠后進(jìn)行免疫原性檢測(cè)。

1.4 抗體滴度檢測(cè)和ELISPOT檢測(cè) 免疫結(jié)束后2周，分離血清，小鼠眼眶取血100 μl左右，室溫下自然沉淀2～3 h，然后1500 r/min，離心5 min后分離血清，檢測(cè)小鼠血清中的抗體滴度。將l0 μg重組MAGE-A3抗原(Abcam公司)包被于96孔微板中，然后加入系列稀釋的各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清，孵育洗滌后，加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體，孵育洗滌后，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色，反應(yīng)終止后，酶標(biāo)儀OD450波長(zhǎng)處讀取數(shù)值。實(shí)驗(yàn)組OD450的數(shù)值大于等于陰性對(duì)照2倍為陽(yáng)性。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme linked immunospot，ELISOPT)的實(shí)驗(yàn)步驟為：用抗IFN-γ抗體包被PVDF板，將分離的小鼠脾細(xì)胞分別加入到包被孔中，MAGE-A3抗原疫苗組加入MAGE-A3蛋白作為刺激物，無(wú)刺激抗原的做為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照加入佛波酯(Phorbol ester，PMA)，具體操作過(guò)程按照ELISPOT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因疫苗的構(gòu)建和抗原表達(dá)檢測(cè) 基因疫苗構(gòu)建如前所述，進(jìn)行測(cè)序鑒定正確后，將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后分別收獲細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。收獲的細(xì)胞裂解后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，分別與鼠源抗人MAGE-A3抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG進(jìn)行孵育，并經(jīng)過(guò)ECL顯色，化學(xué)發(fā)光儀能檢測(cè)到特異性條帶，表明MAGE-A3在293T細(xì)胞中能夠表達(dá)(圖1A)。GM-CSF是分泌表達(dá)，可以用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清。將轉(zhuǎn)染上清包被ELISA板孔以后，用鼠源的抗GM-CSF單克隆抗體作為一抗進(jìn)行孵育，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為第二抗體進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)TMB顯色后，檢測(cè)表達(dá)情況。ELISA檢測(cè)的結(jié)果顯示，GM-CSF(圖1B)檢測(cè)組OD平均值明顯高于空白對(duì)照組和空載體組，證明GM-CSF在293T細(xì)胞內(nèi)能夠有效分泌表達(dá)。

圖1 黑色素瘤抗原-A3流式細(xì)胞術(shù)和

ELISA法檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)

A.利用免疫印記法(western blot)檢測(cè)基因疫苗中抗原MAGE-A3的表達(dá)；B.利用ELISA法檢測(cè)基因疫苗中佐劑分子GM-CSF的表達(dá)

2.2 ELISA檢測(cè)疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答 末次免疫后的第2周，處死各實(shí)驗(yàn)組的小鼠，并收集血清，檢測(cè)疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性抗體反應(yīng)。將各組血清進(jìn)行系列稀釋后，與包被于微板上的MAGE-A3蛋白抗原進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行標(biāo)記，酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果如圖2A所示，單獨(dú)抗原組pVAX1- MAGE-A3和融合抗原組pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF都能產(chǎn)生一定強(qiáng)度的抗體反應(yīng)，然而融合抗原組pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF誘導(dǎo)的抗體水平顯著高于單獨(dú)抗原組(P<0.05)(圖2B)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，將MAGE-A3抗原與GM-CSF融合表達(dá)，能夠顯著提高M(jìn)AGE-A3誘導(dǎo)的特異性抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)了體液免疫反應(yīng)。

2.3 ELISPOT法檢測(cè)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答 末次免疫后的第2周，處死各實(shí)驗(yàn)組的小鼠，手術(shù)解剖小鼠并取其脾臟淋巴細(xì)胞，檢測(cè)疫苗誘導(dǎo)的IFN-γ分泌的特異細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過(guò)圖3可以看出，與對(duì)照組相比，無(wú)論是單獨(dú)抗原組還是融合抗原組免疫小鼠后的脾臟淋巴細(xì)胞，經(jīng)特異性抗原MAGE-A3刺激后，均能產(chǎn)生IFN-γ分泌的斑點(diǎn)。而與單獨(dú)抗原對(duì)照組相比，表達(dá)融合抗原的基因疫苗免疫后的小鼠能夠產(chǎn)生更加強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。融合抗原疫苗組的小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力要顯著高于單獨(dú)抗原對(duì)照組(P<0.001)。

圖2 黑色素瘤抗-A3各實(shí)驗(yàn)組抗體滴度分析

圖3 黑色素瘤抗原-A3各實(shí)驗(yàn)組ELISPOT檢測(cè)分析

3 討 論

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率在逐年提高，尤其是非小細(xì)胞肺癌治療難度較大。傳統(tǒng)的肺癌治療方法，如放療、化療和手術(shù)等，雖然能在一定程度上減輕病痛，但是預(yù)后往往較差，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。免疫治療是發(fā)展非常迅速的腫瘤治療的新型手段，并取得了一些重要突破性進(jìn)展[4]。其中腫瘤治療性疫苗，由于其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫作用，逐漸成為研究熱點(diǎn)之一[5]。在治療性疫苗的研究中，由于以質(zhì)粒DNA為載體的疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，如Th1和CTL殺傷反應(yīng)[6]，其被多用于研發(fā)針對(duì)惡性腫瘤和一些慢性感染性疾病的治療性疫苗。然而，由于DNA疫苗的免疫原性較低，其研究和發(fā)展受到了一定的限制，曾經(jīng)一度出現(xiàn)停滯不前的現(xiàn)象。但是，自從將在體電脈沖轉(zhuǎn)染這種高效的基因疫苗遞送方式用于基因疫苗的免疫接種后，其發(fā)展非常迅速[7]。當(dāng)然，提高基因疫苗效果的方法很多，將具有免疫刺激和調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，以分子內(nèi)佐劑的方式與腫瘤抗原融合，也是研究熱點(diǎn)之一。GM-CSF是當(dāng)前研究最多最具發(fā)展?jié)摿Φ拿庖叽碳し肿又?，它能夠刺激多種免疫細(xì)胞，例如樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)、巨噬細(xì)胞等發(fā)育和活化，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。目前，已經(jīng)有很多學(xué)者將其以輔助分子或者分子內(nèi)佐劑的方式加以應(yīng)用，都體現(xiàn)了其良好的抗腫瘤或者提高抑瘤效果的能力[8]。

MAGE-A3是肺癌靶向治療中研究較多的一個(gè)靶抗原，其在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，以MAGE-A3為靶點(diǎn)的肺癌疫苗已經(jīng)分別有一項(xiàng)Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)[9]。而以MAGE-A3為靶抗原的基因疫苗也取得了較為理想的結(jié)果，因此，MAGE-A3被看做是肺癌免疫治療的潛在理想靶抗原之一[10]。本研究將具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的分子GM-CSF與非小細(xì)胞肺癌高表達(dá)抗原MAGE-A3進(jìn)行融合表達(dá)，旨在通過(guò)分子內(nèi)佐劑的方式來(lái)提高腫瘤抗原的免疫原性。通過(guò)ELISA和ELISPOT的方法分別檢測(cè)了該重組質(zhì)粒免疫實(shí)驗(yàn)小鼠后誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)表達(dá)抗原的質(zhì)粒對(duì)照組相比，具有分子內(nèi)佐劑的pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，這說(shuō)明以GM-CSF作為分子內(nèi)佐劑，與腫瘤抗原進(jìn)行融合表達(dá)的方式，能夠提高抗原誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力。

綜上所述，本研究結(jié)果對(duì)于腫瘤臨床治療具有一定的提示，對(duì)腫瘤的治療和治愈率的提高具有指導(dǎo)意義，聯(lián)合治療將成為腫瘤臨床治療的熱點(diǎn)發(fā)展方向之一。腫瘤患者應(yīng)用治療性疫苗效果不明顯的原因，主要是因?yàn)槊庖吣褪芎湍[瘤的免疫逃逸，而將具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等，與具有主動(dòng)免疫治療效果的免疫制劑、腫瘤疫苗進(jìn)行聯(lián)合治療，將會(huì)從很大程度上打破免疫耐受和抑制腫瘤免疫逃逸的途徑。下一步，將利用腫瘤荷瘤小鼠模型，對(duì)該疫苗抑制腫瘤的效果進(jìn)行深入研究。同時(shí)將利用其他肺癌靶抗原和成熟的佐劑分子及免疫監(jiān)測(cè)點(diǎn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的方式，進(jìn)一步提高和改善疫苗的效果，以期獲得一個(gè)良好的非小細(xì)胞肺癌治療性基因疫苗候選品種。

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(2016-05-15收稿 2016-09-28修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Immunogenicity analysis of recombinant plasmid harboring MAGE-A3 antigens

YUE Honghong1， ZHAO Liang2， and JIANG Wei2.1. Branch of Allergic Reactions, 2. Medical Department, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039,China

Objective To construct a recombinant lung cancer DNA vaccine with high expression antigen MAGE-A3 in lung cancer and to evaluate its immunogenicity.Methods MAGE-A3 genes were fused with GM-CSF by F2A and cloned into pVAX1 to construct the gene vaccine ppVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF. After the gene vaccine was transfected into 293T cells, the expression of the gene vaccine was detected by Western blot and ELISA. Then, the gene vaccine and the control group were injected into the mouse model, and the immune activity was detected by ELISA and ELISPOT.Results Gene vaccine pVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF was constructed, and the expression of the antigen was confirmed. After the mice were vaccinated with the gene vaccine, the test results of ELISA and ELISPOT showed that pVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF induced both humoral immune response and cellular immune response compared with the control group.Conclusions pVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF can induce both humoral immune response and cellular immune response, and its potential anti-tumor effect needs to be further studied.

MAGE-A3；lung cancer;granulocyte-macrophage colony-stimulating factor；gene vaccine

岳紅紅，博士，主治醫(yī)師。

100039 北京，武警總醫(yī)院：1.過(guò)敏反應(yīng)科，2.醫(yī)務(wù)部

姜 威， E-mail: wuweiwenzhang07@sohu.com

R392.11