許尤厚，周洪波

（1.欽州學(xué)院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535000；2.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南長沙410083）

產(chǎn)絮凝劑微桿菌的絮凝特性及印染廢水處理應(yīng)用

許尤厚1，2，周洪波2

（1.欽州學(xué)院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535000；2.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南長沙410083）

篩選獲得一株高效產(chǎn)絮凝劑菌株WX-7，通過16s rDNA鑒定，該菌株隸屬于微桿菌屬。在pH為8.0、接種量1%、30℃、170 r/min條件下，添加蔗糖、玉米漿干粉，培養(yǎng)16~24 h生長最佳。WX-7菌株的絮凝活性主要分布于菌體，最佳助凝劑為Ca2+。在pH＞11條件下，向0.5%的高嶺土懸液投加3 mL菌液和3 mL 1%的CaCl2溶液，絮凝活性最高可達(dá)98%。絮凝劑成分對熱處理不敏感。WX-7菌株所產(chǎn)絮凝劑能有效去除印染廢水的色度和COD，脫色率和COD去除率分別為81%、42%，在廢水處理中具有一定的應(yīng)用前景。

微生物絮凝劑；絮凝活性；印染廢水處理

印染廢水排放量大，具有成分復(fù)雜、COD及色度高、pH高、可生化性差等特點(diǎn)。在水資源極度緊張的情況下，印染廢水的處理和回用尤為重要〔1〕。目前印染廢水處理藥劑主要為化工合成產(chǎn)品，包括脫色劑和傳統(tǒng)絮凝劑。傳統(tǒng)的印染廢水處理藥劑由于安全性及二次污染的問題，逐漸被綠色環(huán)保的新型藥劑替代。新型藥劑的開發(fā)與應(yīng)用已成為目前水污染問題的核心研究領(lǐng)域。微生物絮凝劑是微生物生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有高效專一性，且安全、無毒，無二次污染。微生物種類繁多、生長快，能采用生物工程手段實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化〔2〕。微生物絮凝劑有效去除印染廢水的色度及降低其COD的能力已逐漸被人們所認(rèn)可。已有研究主要側(cè)重于發(fā)酵培養(yǎng)脫色菌的篩選〔3〕，對于微生物絮凝劑直接用于印染廢水的脫色和降低COD的研究報(bào)道還很少〔4〕。

筆者篩選了一株產(chǎn)絮凝劑的微桿菌WX-7，所產(chǎn)絮凝劑定為MBWX-7，對其生長特性及絮凝特性進(jìn)行了研究，初步探索其在印染廢水處理中的脫色及降低COD的效果，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株產(chǎn)生微生物絮凝劑的工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及處理

菌株來源于金霞污水處理廠好氧曝氣池內(nèi)的活性污泥。取一定量活性污泥稀釋于滅菌后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%生理鹽水中，快速攪拌30 min后過濾，取濾液備用。

1.2 培養(yǎng)基

（1）篩選培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH為8.0（121℃滅菌20 min）。

（2）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。蔗糖5g，MgSO4·7H2O0.1g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eCl30.005 g，Na3PO42 g，酵母粉0.5 g，蒸餾水1000mL，pH為8.0~8.2（121℃滅菌20min）。

1.3 菌株分離篩選方法

（1）初篩。用0.85%無菌生理鹽水將濾液制成10-1~10-4的懸液。分別吸取0.1 mL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24~36 h。挑取單菌落于液體篩選培養(yǎng)基中，在30℃、170 r/min條件下震蕩培養(yǎng)20 h，取3 mL菌液加入到含3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% CaCl2的100 mL 0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的高嶺土懸液中，觀察其絮狀顆粒，有絮狀顆粒者保存菌株備用。

（2）分離純化。初篩所得有絮凝活性的菌株經(jīng)稀釋涂平板5次獲得純菌株后斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）復(fù)篩。挑取純菌落于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min條件下培養(yǎng)20 h后測定絮凝活性。

1.4 絮凝率的測定方法

取pH調(diào)至11.5的0.5%高嶺土懸液94 mL，向其中加入3 mL CaCl2、3 mL菌液，攪拌1 min、靜置3 min后，于液面下1 cm處取上清液，550 nm處用分光光度計(jì)測定樣品的吸光度（OD），以不加菌液的高嶺土懸液作空白對照。絮凝率（η）通過式（1）計(jì)算〔5〕。

式中：A——空白對照上清液在550 nm處的OD；

B——樣品上清液在550 nm處的OD。

1.5 菌種鑒定

對數(shù)生長期的菌液在6 000 r/min條件下離心20 min收集菌體，采用天根試劑盒進(jìn)行DNA的提取。PCR擴(kuò)增采用16srDNA通用引物27F和1492R，PCR擴(kuò)增條件為：94℃4 min；94℃1 min，56℃1 min，72℃1.5 min，26個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳，所得產(chǎn)物直接送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行比對，并采用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 絮凝劑的產(chǎn)生菌培養(yǎng)條件

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別測定WX-7菌株的生長曲線和絮凝曲線。改變培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、初始接種量，按1.5方法分別測定其絮凝活性，得出WX-7菌株的最佳產(chǎn)絮凝劑條件。

1.7 絮凝劑的絮凝特性

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，取3mL菌液于4℃、10 000 r/min條件下離心30 min，上清轉(zhuǎn)管，所得菌體加入3 mL滅菌水，分別測定上清、菌體及菌液的絮凝率，研究MBWX-7絮凝劑活性成分的分布情況。改變作用環(huán)境的pH，測定pH對MBWX-7絮凝劑活性的影響。改變絮凝劑及助凝劑的投加用量，得出最佳投加量。改變培養(yǎng)基中的碳源和氮源種類，得出WX-7菌株培養(yǎng)基的廉價(jià)碳氮源替代品。采用不同處理溫度測定MBWX-7絮凝劑活性成分的熱穩(wěn)定性。

1.8 對印染廢水的脫色效果

印染廢水由東莞市永佳合成材料有限公司提供，其pH為11.3、色度420倍、COD 2 400 mg/L。取2 L菌液在4℃、10 000 r/min條件下離心30 min后棄上清，所得菌體融于200 mL自來水后備用。各取印染廢水100 mL，一組投加一定量的傳統(tǒng)脫色劑及絮凝劑，另一組投加一定量的菌體和助凝劑，均勻攪拌1 min后靜置10 min，取上清液備用。對照組投加同等量的水。測定所得上清液的pH、色度、COD。

色度的測定采用稀釋倍數(shù)法（參考CJ/T 3018.2—1993）；COD測定采用連華科技試劑盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

實(shí)驗(yàn)篩選共獲得菌株223株，初篩獲得具有絮凝活性的菌株15株。經(jīng)復(fù)篩、傳代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)菌株WX-7絮凝活性最好，最佳活性可達(dá)98%以上。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以WX-7為實(shí)驗(yàn)菌株。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌呈短桿狀，具有運(yùn)動能力。革蘭氏染色結(jié)果為陽性，莢膜染色結(jié)果為陽性。菌落為黃色，1.5~3 mm，表面光滑，濕潤，凸起。

將測序獲得的16s rDNA核苷酸序列（GenBank ID：JN226405.1）在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，通過系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建軟件Mega4構(gòu)建發(fā)育樹。序列同源性分析表明，WX-7與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的Microbacterium sp.141-3同源性最高，可達(dá)99%。在進(jìn)化樹中（見圖1），同樣與Microbacterium sp.141-3最近，與它的同源性高達(dá)99%，因此確認(rèn)該菌隸屬于微桿菌屬。

圖1 WX-7與其他相關(guān)分類單位間基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株產(chǎn)絮凝劑條件的優(yōu)化

2.2.1 生長曲線和絮凝曲線的測定

統(tǒng)計(jì)48 h內(nèi)菌株的生長情況，前24 h每4 h取樣用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。圖2為WX-7的生長曲線，可以看出WX-7首先經(jīng)歷一個停滯期，從12 h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后進(jìn)入衰亡期。

按照同樣的取樣時(shí)間和取樣方法統(tǒng)計(jì)了48 h內(nèi)不同時(shí)間段WX-7菌株的產(chǎn)絮凝劑情況，見圖3。結(jié)果顯示，16~24 h WX-7均能保持較高的絮凝率，24 h后其絮凝率開始下降。16 h為WX-7菌株對數(shù)生長期的中后期，20~24 h為穩(wěn)定期的前期，24~32 h為穩(wěn)定期的后期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株的對數(shù)生長期后期至穩(wěn)定期前期為最佳產(chǎn)絮凝劑階段。

圖2 WX-7菌株的生長曲線

圖3 WX-7培養(yǎng)液的絮凝曲線

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH對絮凝活性的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11，在30℃、170 r/min條件下培養(yǎng)20 h后測定其絮凝活性。結(jié)果顯示W(wǎng)X-7生長最適pH介于7~9之間，培養(yǎng)20 h后其絮凝活性保持在80%以上，其中以pH為8的活性最好。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對絮凝活性的影響

在170 r/min條件下分別測定20、25、30、35、40℃培養(yǎng)20 h后的WX-7菌株的絮凝活性。不同溫度下的絮凝率分別為26%、83%、98%、82%、19%，結(jié)果表明WX-7最適生長溫度為30℃，過低和過高的溫度都不利于菌株生長，進(jìn)而影響絮凝劑的產(chǎn)出。

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對絮凝活性的影響

30℃下，分別測定50、100、130、150、170、200、250 r/min培養(yǎng)20 h后WX-7菌株的絮凝活性。不同轉(zhuǎn)速下的絮凝率分別為39%、61%、70%、83%、97%、86%、80%。搖床的轉(zhuǎn)速決定搖瓶培養(yǎng)基的溶氧，在170 r/min轉(zhuǎn)速下WX-7菌株具有最佳絮凝率，說明此條件有利于WX-7菌株絮凝劑的產(chǎn)出。轉(zhuǎn)速太低則供氧不足，不利于WX-7的生長，轉(zhuǎn)速提高雖能增加培養(yǎng)基內(nèi)的溶氧，但不利于絮凝劑產(chǎn)出。

2.2.5 接種量對絮凝活性的影響

測定種子培養(yǎng)基的原始菌約為1×109，接種量分別為0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%，在30℃、170 r/min條件下培養(yǎng)20 h后測其絮凝活性。不同接種量的絮凝率分別為65%、94%、96%、93%、92%，表明接種量對WX-7菌株產(chǎn)絮凝劑的影響不明顯。接種量＜0.5%時(shí)菌株生長速度較慢，直接導(dǎo)致絮凝劑產(chǎn)量低，相同菌液用量下活性低。接種量＞0.5%后，MBWX-7的絮凝活性基本無明顯差異，說明接種量處于一定范圍內(nèi)菌株生長和絮凝劑產(chǎn)出能達(dá)到平衡。

2.3 絮凝特性研究

2.3.1 絮凝活性的分布

培養(yǎng)基、菌液、菌液上清、菌體的絮凝率分別為38%、97%、60%、96%，表明WX-7菌株的絮凝劑活性成分主要分布于菌體。培養(yǎng)基具有部分活性主要因?yàn)楹蠪e3+、Mg2+、Ca2+金屬離子。菌液上清的活性部分來自于未完全離心的菌體。

2.3.2 反應(yīng)體系pH對絮凝活性的影響

對0.5%的高嶺土懸液分別調(diào)節(jié)pH為3.03、3.84、4.96、5.9、6.9、7.9、9.04、10.1、11.17，測定菌液在不同pH下的絮凝率，結(jié)果表明，作用環(huán)境的pH對微生物絮凝劑的活性影響較大。WX-7在pH為11以上、4以下時(shí)具有較好的絮凝活性，而pH在7~9之間基本無絮凝活性。WX-7菌株的這一特性可在某些極端工業(yè)廢水處理中發(fā)揮一定作用，如印染廢水在調(diào)節(jié)pH之前的脫色混凝處理。

2.3.3 助凝劑對絮凝活性的影響

分別投加3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的KCl、NaCl、CaCl2、ZnCl2、FeCl3作助凝劑，以蒸餾水作為空白對照，測定金屬離子對菌液絮凝活性的影響。發(fā)現(xiàn)其絮凝率分別為0、0、95%、98%、94%，空白對照的絮凝率為0。表明WX-7在缺失助凝劑的情況下無絮凝活性，投加Fe3+、Zn2+、Ca2+能有效提高WX-7的絮凝活性，而一價(jià)離子Na+、K+則無任何助凝效應(yīng)。由于Fe3+本身帶有顏色，在后續(xù)檢測中會影響色度結(jié)果；Zn2+助凝效果最好，但價(jià)格較貴且為重金屬離子，不利于人類健康，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以Ca2+作助凝劑。

2.3.4 處理溫度對絮凝劑活性的影響

取發(fā)酵液分別置于-20、4、25、43、78、100℃下處理30 min，測定其絮凝活性。處理后的絮凝率分別為84%、91%、96%、90%、81%、80%，可以看出MBWX-7絮凝劑對溫度不敏感，-20~100℃處理30 min后仍能保持80%以上的活性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，以多糖結(jié)構(gòu)為主的絮凝劑耐熱性均比較好，而含有蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)的耐熱性差〔1〕。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷MBWX-7絮凝劑的活性成分以多糖為主。

2.3.5 投加量對絮凝活性的影響

有報(bào)道指出，絮凝劑的投加量對絮凝活性影響較大〔2〕。保持WX-7菌液的投加量不變，分別投加0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mL 1%的CaCl2，測定其絮凝率。同時(shí)保持1%CaCl2溶液的投加量不變，分別投加0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mL菌液，測定其絮凝率。絮凝劑和助凝劑的投加量對絮凝活性的影響如圖4所示。

圖4 不同絮凝劑和CaCl2用量時(shí)的絮凝活性

圖4顯示，在缺失助凝劑條件下WX-7不具有絮凝活性，表明WX-7絮凝劑存在激活位點(diǎn)，只有與某些金屬離子相結(jié)合的情況下才能發(fā)揮絮凝特性。在100 mL高嶺土懸液體系中，投加3 mL菌液、3 mL 1%CaCl2可達(dá)到最佳絮凝效果。過量投加反而使絮凝率有所下降，這與WX-7絮凝活性分布于菌體有關(guān)，過量投加后菌體與菌體之間以及菌體與CaCl2之間形成細(xì)小而難以沉降的懸浮物，從而影響絮凝率的測定。

2.3.6 碳氮源對絮凝活性的影響

分別以玉米淀粉、麩皮、葡萄糖、乳糖、甘油、檸檬酸鈉替代培養(yǎng)基中的蔗糖，培養(yǎng)20 h后測定絮凝率。分別以硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、尿素、豆渣、蛋白胨、玉米漿干粉替代培養(yǎng)基中的酵母粉，培養(yǎng)20 h后測定絮凝率。所有工業(yè)級的碳氮源直接以同等量替代，未計(jì)算其碳氮含量，結(jié)果見表1。

表1 不同碳氮源對絮凝活性的影響

WX-7菌株在無機(jī)氮培養(yǎng)基中基本不能生長，有機(jī)氮中以玉米漿干粉的絮凝效果較好，可以作為酵母粉的廉價(jià)替代氮源。從表1可以看出，碳源對絮凝率的影響比較明顯，玉米淀粉、蔗糖、甘油、麩皮為良好碳源，其中蔗糖的絮凝效果最好，考慮蔗糖的成本問題，在發(fā)酵生產(chǎn)中可以采用玉米淀粉替代。

2.4 絮凝劑對印染廢水的脫色效果

在100 mL印染廢水處理體系中，投加10 mL菌體懸液和5 mL 10%CaCl2溶液，處理后印染廢水色度從420倍降至80倍，COD由2400mg/L降至1400 mg/L，色度去除率、COD去除率分別為81%、42%，pH為11.4，基本保持不變。而將印染廢水調(diào)節(jié)pH至8.0后投加0.8 mL 5%的脫色劑、1 mL 1%的聚合氯化鋁和10 mL 0.1%的聚丙烯酰胺后，印染廢水色度從420倍降至60倍，COD僅降至2 200 mg/L，色度去除率和COD去除率分別為86%、9%。

與傳統(tǒng)印染廢水處理藥劑相比，MBWX-7絮凝劑在廢水脫色的同時(shí)，一定程度上有效降低了廢水COD，從而降低后續(xù)物化池、生化池的負(fù)荷，大大提高了整個污水處理過程的效率。然而與傳統(tǒng)脫色劑和絮凝劑相比，微生物絮凝劑的成本是目前亟待解決的問題。就該實(shí)驗(yàn)而言，2 L菌液濃縮10倍后的菌懸液在處理100 mL印染廢水時(shí)仍需投加10 mL，與傳統(tǒng)工藝僅投加0.8 mL 5%脫色劑相比，距離實(shí)際應(yīng)用仍有相當(dāng)大的差距。

3 結(jié)論

（1）通過初篩和復(fù)篩，從污水廠的活性污泥中獲得一株高效穩(wěn)定的產(chǎn)絮凝劑菌株WX-7，經(jīng)鑒定該菌株隸屬于微桿菌屬。（2）通過單因素實(shí)驗(yàn)得到WX-7最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：碳源為蔗糖、氮源為玉米漿干粉，pH為8.0，接種量為1%，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min，培養(yǎng)時(shí)間為16~24 h。（3）WX-7菌株的絮凝活性主要分布于菌體，必須在助凝劑存在下才能發(fā)揮其絮凝特性；在pH＞11條件下投加3 mL菌液和3 mL 1%的CaCl2溶液，其絮凝活性最高可達(dá)98%，絮凝劑成分對熱處理不敏感。（4）MBWX-7絮凝劑在一定條件下能有效去除印染廢水的色度和COD，脫色率和COD去除率分別為81%、42%，比傳統(tǒng)印染廢水處理藥劑更能有效去除COD，在廢水處理中具有一定應(yīng)用前景。

［1］耿云波，劉永紅，趙鵬飛.印染廢水生物處理技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及研究進(jìn)展［J］.工業(yè)用水及廢水，2010，41（4）：1-4.

［2］胡勇有，高寶玉.微生物絮凝劑［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：2-8.

［3］吳贊敏，甕亮，魏乃福，等.印染廢水脫色菌的培育及脫色工藝的研究［J］.染料與染色，2005，42（1）：60-62.

［4］Fu Yuzhu，Viraraghavan T.Fungal decolorization of dye wastewater：a review［J］.Bioresource Technology，2001，79（3）：251-262.

［5］Nakamura J，Miyashiro S，Hirose Y.Screening，isolation and some properties of microbial cell flocculants［J］.Agricultural and Biological Chemistry，2014，40（2）：377-383.

［作者介紹］許尤厚（1980—），博士，副教授。電話：0777-2807282，E-mail：36714447@qq.com。

Flocculation characterization of flocculant-producing micro-bacteria and its application to dyeing wastewater treatment

Xu Youhou1，2，Zhou Hongbo2
（1.Key Laboratory of Guangxi Beibu（Northern）Gulf Marine Biodiversity Conservation，Qinzhou University，Qinzhou 535000，China；2.School of Resource Processing and Bioengineering，Central South University，Changsha 410083，China）

An efficiently flocculant-producing bacterial strain WX-7 has been screened out and obtained as Microbacterium sp.，through 16s rDNA determination.It grows best under the following conditions：pH is 8.0，inoculum concentration 1%，temperature 30℃，and rotational speed 170 r/min，by adding sucrose and dried corn steep liquor powder and culturing for 16-24 h.The flocculating activity of Strain WX-7 mainly distributes on thallus.The best coagulant aid is Ca2+.When pH is higher than 11，and 3 mL of bacterial liquid，and 3 mL of CaCl2solution（1%）are added to kaolin suspension（0.5%），the maximum flocculating activity can reach 98%.The flocculant ingredient is not sensitive about heat treatment.The flocculant produced from Strain WX-7 can effectively remove the chroma and COD from dyeing wastewater.The decolorization rate and COD removing rate are 81%and 42%，respectively.It indicates that this strain has certain application prospect in wastewater treatment fields.

microbial flocculants；flocculation activity；dyeing wastewater treatment

X703

A

1005-829X（2016）12-0059-05

2016-10-28（修改稿）

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013GXNSFBA019104）；廣西高校優(yōu)秀人才資助計(jì)劃項(xiàng)目；欽州學(xué)院博士啟動經(jīng)費(fèi)