苗雨田 楊悠悠 王 浩 劉 佟 楊永壇

氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食用油中3-氯丙醇酯

苗雨田 楊悠悠 王 浩 劉 佟 楊永壇

（中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院北京市營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

采用堿水解方式，基于苯基硼酸（PBA）衍生化方法并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀測(cè)定了食用油中3-氯丙醇（3-MCPD）酯的含量。經(jīng)試驗(yàn)可知，水解時(shí)間是堿水解樣品前處理方法的關(guān)鍵因素，經(jīng)優(yōu)化，大豆油等不同品類的食用油的最佳水解時(shí)間為1～6 min。另外，以大豆油為基質(zhì)，考察了基于堿水解方式的分離分析方法的回收率、重復(fù)性以及檢出限。其中，在150～1 500μg／kg范圍內(nèi)進(jìn)行3水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率為94%～105%、RSD 為3.7%～10.8%、檢出限為15 μg／kg，定量限為50 μg／kg。本方法能夠滿足日常樣品中3-氯丙醇（3-MCPD）酯的檢測(cè)。

3-氯丙醇（3-MCPD）酯 食用油 堿水解 水解時(shí)間 氣相色譜-質(zhì)譜

3-氯丙醇（3-MCPD）酯是由甘油酯中1號(hào)或者3號(hào)位的羥基被氯原子取代而形成的一氯取代物，無(wú)色，具有愉快性香味。易溶于乙醇，水，乙醚，丙酮［1］。1980 年Davidek 等［1］在酸水解植物蛋白（HVP）中發(fā)現(xiàn)3-氯丙醇（3-MCPD）酯，此后陸續(xù)有研究者在各類熱加工食品中發(fā)現(xiàn)不同水平的3-MCPD酯［2-6］。3-MCPD酯主要形成于食品的加工過(guò)程中，尤其是熱加工過(guò)程，如油脂的精煉、氫化、脫臭等［7］。3-MCPD酯目前引起人們的廣泛關(guān)注主要是由于3-MCPD酯被人體攝入后，會(huì)被脂肪酸酶水解成游離的3-MCPD，3-MCPD具有潛在的致癌性，并且能抑制雄性激素的分泌，使精子數(shù)減少，精子活性降低，生殖能力減弱，甚至不育［8］。

3-MCPD酯測(cè)定方法的研究已經(jīng)成為食品安全檢測(cè)的熱點(diǎn)之一［9］，目前對(duì)油脂中3-MCPD的測(cè)定主要有間接測(cè)定和直接測(cè)定的方法，間接測(cè)定的原理是將3-MCPD酯水解形成游離的3-MCPD，再將3-MCPD進(jìn)行衍生，使用GC-MS進(jìn)行測(cè)定，而直接測(cè)定是將樣品凈化后經(jīng)液相色譜分離再使用質(zhì)譜測(cè)定［10］。直接分析的方法比較難獲得所需要的標(biāo)準(zhǔn)品且費(fèi)用較高。間接法經(jīng)濟(jì)，所需標(biāo)準(zhǔn)品種類少，且靈敏度較高。間接法測(cè)定過(guò)程中，衍生化試劑有丙酮、全氟?；溥颍℉FBI）和苯基硼酸（PBA）等［11］。丙酮在衍生時(shí)，需要利用甲苯-4-磺酸進(jìn)行催化［12］；HFBI可與許多氯丙醇作用，在羥基上引入七氟丁?；?，HFBI法衍生前需要確保溶液經(jīng)過(guò)充分的脫水，此外還要采用硅藻土基質(zhì)固相分散萃取法凈化，操作復(fù)雜、繁瑣，并且HFBI試劑價(jià)格很高［13］；PBA只能與二醇類發(fā)生專一性化學(xué)反應(yīng)，可直接在水溶液中與3-MCPD反應(yīng)［14］，所需前處理步驟較少，成本較低，在3-MCPD酯檢測(cè)中較為常用。目前間接法測(cè)定3-MCPD酯的檢出限為27 ～1 000 μg／kg［15］。

本研究采用間接測(cè)定方式，利用堿水解對(duì)樣品進(jìn)行樣品前處理，優(yōu)化了不同食用油的水解時(shí)間；使用PBA作為衍生化試劑，評(píng)價(jià)了衍生化時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響；最后，使用GC-MS進(jìn)行了目標(biāo)化合物的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆油、花生油、菜籽油等9種食用油：市售；3-MCPD酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%、氘代同位素3-MCPD-d5酯（3-MCPD-1，2-dilaurate-d5）標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲基叔丁基醚（MTBE，色譜純）、苯基硼酸（PBA，分析純）：德國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫GC 7890B-5977MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS色譜柱（30 m ×0.25 mm ×0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；TTL-DCⅡ氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 堿水解

分別稱?。?00±5）mg大豆油等9種食用油樣品，加入氘代同位素內(nèi)標(biāo)3-MCPD-d5酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液和100μL甲基叔丁基醚（MTBE），漩渦使其充分溶解并混勻。向其中加入200μL 25 g／L NaOH甲醇溶液（25 g NaOH溶解到1 L甲醇中，現(xiàn)用現(xiàn)配），漩渦震蕩0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、7、10 min 后立即加入600 μL NaBr-H2SO4混合溶液（3.5 mL 25%H2SO4溶解在100 mL 600 g／L的NaBr溶液），渦旋充分混勻。其后加入600μL正己烷，充分渦旋后靜置至少5 min，待溶液分層后，棄去上層正己烷溶液，重復(fù)萃取2次。最后加入600μL乙醚-乙酸乙酯混合溶液（3∶2），充分渦旋后靜置，將上層溶液轉(zhuǎn)移至10 mL裝有少量無(wú)水MgSO4玻璃試管中，重復(fù)萃取3次。合并萃取液待用。

1.3.2 衍生化

向堿水解萃取液中加入100μL飽和苯基硼酸（PBA）溶液（溶劑為乙醚），渦旋混勻，反應(yīng)時(shí)間為1～12 min。

1.3.3 純化

將衍生液用氮?dú)饩徛蹈桑? mL正己烷復(fù)溶，渦旋1 min，靜置1 min。將上清液過(guò)膜轉(zhuǎn)移至2 mL小瓶中，GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS 分析

色譜條件：進(jìn)樣口溫度：280℃；程序升溫條件：初始溫度85℃，保持12 min，以20℃／min升至165℃，保持10 min，然后再以20℃／min升至300℃，保持8 min；載氣：高純氦氣，流速為1 mL／min；進(jìn)樣方式：脈沖不分流；進(jìn)樣體積：1μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃；溶劑延遲6 min；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 3-MCPD和3-MCPD-d5衍生物定性離子與定量離子的確定

樣品中的3-MCPD酯在水解后會(huì)生成游離的3-MCPD，經(jīng)過(guò)PBA衍生后形成相應(yīng)的衍生物。m／z＝196，198分別為3-MCPD衍生物氯35和氯37的分子離子峰，m／z＝201，203分別是3-MCPD-d5衍生物氯35和氯37的分子離子峰。m／z＝147，150分別是3-MCPD衍生物和3-MCPD-d5衍生物分子離子峰失去-CH2Cl和-CD2Cl后形成的基峰［16］。因此，選用m／z＝147 和m／z＝150 分別作為3-MCPD衍生物和3-MCPD-d5衍生物的定量離子，具有干擾小，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。定性離子則分別為：m／z＝91、147、196、198 和m／z 149、150、201、203。另外，如圖1所示，采用SIM模式時(shí)，3-MCPD衍生物和3-MCPD-d5衍生物的分離情況較好，且互不干擾，滿足高靈敏度高準(zhǔn)確度的要求。

圖1 3-MCPD和3-MCPD-d5選擇離子圖

2.2 堿水解樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 水解時(shí)間

水解時(shí)間過(guò)短，可能會(huì)造成水解反應(yīng)不徹底，不能得到全部的游離3-MCPD，若水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，3-MCPD酯已經(jīng)被完全水解，在強(qiáng)堿性條件下，3-MCPD會(huì)進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，衍生化時(shí)間的優(yōu)化至關(guān)重要。

圖2結(jié)果顯示，不同食用油最佳水解時(shí)間不相同。以棕櫚油為例，當(dāng)水解時(shí)間為2 min時(shí)，響應(yīng)值為最大響應(yīng)值的78.6%。當(dāng)水解時(shí)間為2.5 min時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最大，相應(yīng)值為12 402。水解時(shí)間延長(zhǎng)后，響應(yīng)值逐漸降低，當(dāng)水解時(shí)間為10 min時(shí)，響應(yīng)值僅為最大響應(yīng)值的41.9%。因此在0.5～2.5 min，3-MCPD 酯處于水解階段，而在2.5～10 min是3-MCPD的消除階段。因此水解時(shí)間選擇為2.5 min。由圖2可知，大豆油的最佳水解時(shí)間為1 min?；ㄉ驮谒鈺r(shí)間為1.5 min時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最大。芝麻油和橄欖油的最佳水解時(shí)間分別為2.5 min和1.5 min，而玉米油、葵花籽油和葡萄籽油的最佳水解時(shí)間都為2 min。本研究中菜籽油在水解時(shí)間為2.5 min時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最大，而傅武勝等［17］對(duì)菜籽油的水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果為1 min，與本試驗(yàn)結(jié)果的2.5 min不相同，這是由于NaOH甲醇溶液的用量或NaOH濃度不同造成。

圖2 水解時(shí)間對(duì)9種食用油3-MCPD衍生物響應(yīng)值的影響

2.2.2 衍生化時(shí)間

3-MCPD是含有2個(gè)醇羥基，極性較大，容易造成襯管內(nèi)的吸附。另外，分離時(shí)會(huì)造成色譜峰的拖尾。因此，測(cè)定時(shí)需要先將3-MCPD衍生化，本研究采用PBA為衍生化試劑，可與3-氯丙醇反應(yīng)為極性較小的苯基硼酸3-氯丙二醇酯。

以棕櫚油為研究對(duì)象，分別衍生1～12 min，重復(fù)試驗(yàn)3次（圖3）。結(jié)果顯示，3-MCPD衍生物的響應(yīng)與衍生時(shí)間并無(wú)線性關(guān)系，隨著衍生時(shí)間的變化，衍生物響應(yīng)值無(wú)明顯變化，因此本試驗(yàn)衍生時(shí)間選用1 min。

圖3 衍生時(shí)間對(duì)3-MCPD酯衍生物響應(yīng)的影響

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 回歸方程、檢出限和定量限

以內(nèi)標(biāo)3-MCPD-d5衍生物和3-MCPD衍生物面積比值Y和折算后樣品中3-MCPD酯的濃度X（μg／kg）（以3-MCPD 濃度計(jì)）計(jì)算線性回歸方程。以3倍信噪比（S／N＝3）作為檢出限，10倍信噪比（S／N＝10）作為定量限。在最優(yōu)條件下，線性回歸方程、檢出限和定量限的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 堿水解方法回歸方程

2.3.2 精密度和回收率

以大豆油為基質(zhì)，進(jìn)行3個(gè)水平的3-MCPD酯的加標(biāo)回收試驗(yàn)，各加標(biāo)水平重復(fù)6次，堿水解方法下，3-MCPD的加標(biāo)回收率為94%～105%，3-MCPD酯測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.7%～10.8%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3-MCPD酯堿水解前處理方法回收率

通過(guò)回歸方程、檢出限、定量限、精密度及回收率等方法學(xué)參數(shù)可知，回收率和精密度均符合GB／T 27404—2008的要求。本方法對(duì)食用油中3-MCPD酯的測(cè)定具有靈敏度高，特異性好，精密度高的特點(diǎn)，能夠滿足日常檢測(cè)的需求。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用堿水解樣品前處理方法建立的食用油中3-MCPD酯的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)中常見(jiàn)9種植物油中的3-MCPD酯含量進(jìn)行了檢測(cè)分析，如表3所示，大豆油和橄欖油中未檢出3-MCPD酯。而花生油等食用油中3-MCPD酯均有檢出。其中，葵花籽油含量最低，棕櫚油中含量最高，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)食用油中3-MCPD酯的監(jiān)測(cè)和管理。植物油脂中3-MCPD酯的形成尚未完全清晰，多數(shù)研究表明是以?；视蜑榍绑w生成3-MCPD酯［18］?？赡苁窃谟椭摮暨^(guò)程中甘油三酯直接被氯化生成3-MCPD酯［18-20］，或者甘油三酯先生成了環(huán)酰氧鎓離子再與氯離子反應(yīng)生成3-MCPD酯［21］。

表3 9種食用油中3-MCPD酯的含量（以3-MCPD計(jì)）

研究顯示，當(dāng)溫度超過(guò)200℃時(shí)，3-MCPD酯的形成急劇增加，尤其是超過(guò)240℃［22］。在大豆油精煉過(guò)程中采用的是水化脫膠，在脫臭過(guò)程中酸性物質(zhì)較少，與氯離子的反應(yīng)較少。而在棕櫚油等植物油的精煉過(guò)程中采用的是磷酸脫膠和活化白土脫色的工藝［23］，高溫脫臭過(guò)程中酸性條件較強(qiáng)，加大了氯離子的取代反應(yīng)，增加了3-MCPD酯的生成。因此，大豆油中未檢測(cè)到3-MCPD酯，而在棕櫚油中3-MCPD 酯的含量較高，為7.31 mg／kg。從國(guó)內(nèi)外近年來(lái)的相關(guān)報(bào)道可以知道，油脂精煉過(guò)程是產(chǎn)生3-MCPD酯的主要途徑，因此，在油脂精煉工序中，要加強(qiáng)對(duì)一些工藝因素如加水量、酸用量、酸種類、脫臭溫度、脫臭時(shí)間等的控制和優(yōu)化。

3 結(jié)論

本方法針對(duì)不同食用油對(duì)堿水解中所需水解時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，經(jīng)優(yōu)化的堿水解方法具有定性準(zhǔn)確，精密度高，靈敏度高等特點(diǎn)，能滿足對(duì)食用油中3-MCPD酯分析的要求。采用本方法對(duì)市場(chǎng)中9種食用油的分析結(jié)果顯示，除大豆油、橄欖油外，均含有不同含量的3-MCPD酯，其中，棕櫚油含量最高，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食用油中3-MCPD酯的監(jiān)管。

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Determination of 3-chloropropanol-1，2-diol（3-MCPD）Esters in Edible Oil by Gas Chromatography and Mass Spectrometry

Miao Yutian Yang Youyou Wang Hao Liu Tong Yang Yongtan
（China Oil Nutrition and Health Research Institution，Beijing Nutrition Health and Food Safety Key Laboratory，Beijing 102209）

3-chloropropanol-1，2-diol（3-MCPD）esters in edible oil was determined by alkaline hydrolysis method and gas chromatography／mass spectrometry （GC-MS）based on derivatization with phenylboronic acid（PBA）.The experiment shows that the hydrolysis time was a critical factor in alkaline hydrolysis sample pretreatment procedures.The optimum hydrolysis time of different edible oils ranges from 1min to 6 min upon optimization.The recovery，repeatability and detection limit of the separation and analysis method based on alkaline hydrolysis method were evaluated with soybean oils as the research model.Based on the three levels marking recovery experiment in the range of 150～1 500 μg／kg，the recovery was between 94%and 105%，while the relative standard deviation ranges from 3.7%～10.8%.In addition，the limit of detection （LOD）and the limit of quantification were 15 μg／kg and 50 μg／kg，respectively.This method could meet with requirements of the routine detection of 3-chloropropanol-1，2-diol（3-MCPD）esters in edible oil.

3-chloropropanol-1，2-diol esters，edible oil，alkaline hydrolysis，hydrolysis time，gas chromatography／mass spectrometry

TQ646.4

A

1003-0174（2016）11-0135-05

中糧集團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2013-C2-F007）

2015-03-24

苗雨田，女，1988年出生，碩士，食品質(zhì)量與安全

楊永壇，男，1971年出生，研究員，食品質(zhì)量與安全