陳瓊　許美鳳　余勇

[摘要] 目的 對(duì)6群型肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。 方法 應(yīng)用分子生物學(xué)方法將6群肺炎鏈球菌分為6A型、6B型、6C型和6D型，提純其莢膜多糖，并采用核磁共振氫譜（1H NMR）對(duì)6群肺炎鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，比較6A型、6B型、6C型和6D型多糖結(jié)構(gòu)1H NMR譜的端基質(zhì)子區(qū)和環(huán)質(zhì)子區(qū)化學(xué)位移的差異。 結(jié)果 6A型譜圖中，三個(gè)特征質(zhì)子峰化學(xué)位移值分別為？啄5.62、？啄5.13和？啄5.05；6C型譜圖中，三個(gè)特征質(zhì)子峰化學(xué)位移值分別為？啄5.59、？啄5.13和？啄5.05；6B型譜圖中，三個(gè)特征質(zhì)子峰化學(xué)位移分別為？啄5.62、？啄5.17和？啄5.15；6D型譜圖中，三個(gè)特征質(zhì)子峰化學(xué)位移分別為？啄5.59、？啄5.17和？啄5.15。6A、6B、6C和6D型的環(huán)質(zhì)子區(qū)（？啄4.40～3.30）化學(xué)位移表現(xiàn)出不同的位移特性。 結(jié)論 獲得6A型、6B型、6C型和6D型肺炎鏈球菌莢膜多糖1H NMR譜圖，其端基質(zhì)子區(qū)和環(huán)質(zhì)子區(qū)化學(xué)位移存在差異，為莢膜多糖質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 肺炎鏈球菌莢膜多糖；核磁共振氫譜；端基質(zhì)子；環(huán)質(zhì)子；化學(xué)位移

[中圖分類號(hào)] R914 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（b）-0016-04

[Abstract] Objective To analyze the structures of the capsular polysaccharides from streptococcus pneumoniae serogroup 6. Methods Serotypes of streptococcus pneumonia were determinated as 6A， 6B， 6C and 6D using the molecular biological technologies， then the capsular polysaccharides were extracted and the structures were analyzed by 1H nuclear magnetic resonance （NMR）. The chemical shifts of anomeric proton regions and ring proton regions of 1H NMR spectrums were analyzed and compared among different serotypes of capsular polysaccharides. Results The chemical shifts of all characteristic protons peaks of the pneumococcal capsular polysaccharides serotype 6A were ？啄5.62， ？啄5.13 and ？啄5.05 separately； serotype 6C were ？啄5.59， ？啄5.13， and ？啄5.05； serotype 6B were ？啄5.62， ？啄5.17 and ？啄5.15； serotype 6D were ？啄5.59， ？啄5.17， and ？啄5.15. The chemical shifts of ring proton regions （？啄4.40-3.30） of 4 serotypes were different. Conclusion The 1H NMR spectrums of pneumococcal capsular polysaccharides serotype 6A， 6B， 6C and 6D were determinated， and the chemical shifts of anomeric proton regions and ring proton regions were different in each serotype. It provides data for the quality control of different capsular polysaccharide.

[Key words] Pneumococcal capsular polysaccharide； 1H NMR； Anomeric proton； Ring proton； Chemical shift

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病原菌之一，能夠引起肺炎、急性呼吸道感染、中耳炎、腦膜炎和菌血癥等侵襲性和非侵襲性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)道，在發(fā)展中國(guó)家每年約有160萬(wàn)例死于肺炎鏈球菌感染，其中100萬(wàn)例是<5歲的兒童[1]。

肺炎鏈球菌莢膜多糖既是毒力因子又是保護(hù)性抗原，已成功用來(lái)制備肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗及多糖蛋白結(jié)合疫苗。6A和6B型肺炎鏈球菌作為導(dǎo)致侵襲性鏈球菌感染的常見血清型，23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗和7價(jià)肺炎球菌多糖疫苗中均包含6B型莢膜多糖，10價(jià)和13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中均包含6A和6B型莢膜多糖。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，對(duì)莢膜多糖合成相關(guān)基因（cps loci）的深入研究，發(fā)現(xiàn)6群肺炎鏈球菌可分為6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G和6H型[2-7]。

核磁共振波譜（Nuclear magnetic resonance，NMR）能夠直接分析肺炎球菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、取代基類型及其位置和數(shù)目，分析不同多糖結(jié)構(gòu)之間的細(xì)微差異，鑒定不同血清型的莢膜多糖。目前NMR 波譜已經(jīng)是《歐洲藥典》推薦草案和WHO 推薦的多糖質(zhì)量控制方法[8-12]。1979年采用NMR技術(shù)對(duì)6A型和6B型肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析[13]，2012年確定了新發(fā)現(xiàn)的6C型莢膜多糖結(jié)構(gòu)[14]。

本研究根據(jù)6群莢膜多糖合成相關(guān)基因序列和文獻(xiàn)報(bào)道[15]，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在分子水平上鑒定6群肺炎鏈球菌的血清型，并且根據(jù)NMR可通過對(duì)多糖分子特異基團(tuán)上特征質(zhì)子的檢測(cè)，獲得6A、6B、6C和6D型肺炎鏈球菌莢膜多糖1H NMR圖譜，為肺炎鏈球菌莢膜多糖的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6群肺炎鏈球菌由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心保藏提供。

1.2 試劑與儀器

Varian Unity Inova 600 型超導(dǎo)脈沖傅里葉變換NMR 譜儀購(gòu)自美國(guó)Varian公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重水、3-（三甲基硅）丙酸-D4鈉鹽、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀購(gòu)自Fluka公司；氘代試劑：以100 mmol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解3-（三甲基硅）丙酸-D4鈉鹽至1 mmol/L，4℃保存?zhèn)溆?。重水（D2O，99.8%氘代）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，內(nèi)標(biāo)物2，2，3，3-氘代三甲基甲硅烷基丙酸鈉（TSP）購(gòu)自加拿大Merck 公司。配制內(nèi)標(biāo)物TSP濃度為1 mmol/L的重水溶液待用。

1.3 6群肺炎鏈球菌的血清型鑒定

對(duì)6群肺炎鏈球菌的cpsD、wciN和wciP基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，以及對(duì)其序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，將6群肺炎鏈球菌鑒定為6A、6B、6C和6D型[16]。

1.4 莢膜多糖的提純

6A、6B、6C和6D型肺炎鏈球菌三級(jí)發(fā)酵后，脫氧膽酸鈉殺菌后離心收集上清，經(jīng)100 kD膜包超濾濃縮1/10～1/8，加入預(yù)冷95%乙醇至終濃度20%～30%，離心收集上清，加入預(yù)冷95%乙醇至終濃度為50%～80%，離心收集沉淀，經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后，抽干即為粗糖。將粗糖溶解于中性醋酸鈉溶液中進(jìn)行冷酚萃取，離心收集上清，經(jīng)100 kD膜包超濾去除苯酚，加入預(yù)冷95%乙醇至終濃度20%～30%，離心收集上清，經(jīng)50 kD膜包超濾去除核酸，加入預(yù)冷95%乙醇至終濃度為50%～80%，離心收集沉淀，經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌抽干后分別獲得6A、6B、6C和6D型莢膜多糖。

1.5 NMR樣品的制備

分別稱取4種血清型凍干莢膜多糖約3 mg，以0.6 mL含1 mmol/L TSP的重水溶液溶解，放置4℃冰箱中過夜使多糖完全溶解，渦旋混勻，以7200 r/min離心10 min，最后將樣品轉(zhuǎn)移到5 mm核磁管中待測(cè)。

1.6 NMR數(shù)據(jù)采集與處理樣品

1H NMR譜圖由Varian Unity Inova 600型NMR譜儀在40℃下采集得到，實(shí)驗(yàn)采用PRESAT單脈沖序列，主要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為譜寬7200 Hz，弛豫延遲時(shí)間2 s，采樣點(diǎn)數(shù)64 k，累加次數(shù)64次。所有采集得到的自由感應(yīng)衰減（FID）信號(hào)經(jīng)過傅里葉變換轉(zhuǎn)換為NMR圖譜，線寬因子為0.1 Hz，經(jīng)相位調(diào)整、基線校正，并以TSP的譜峰為化學(xué)位移參考峰，設(shè)為？啄0。

2 結(jié)果

6A、6B、6C和6D型莢膜多糖的1H NMR譜圖見圖1。從圖1可見，6群肺炎鏈球菌莢膜多糖的端基質(zhì)子區(qū)（？啄5.41～5.00）比較接近。6A型譜圖中，？啄5.62為半乳糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.13為葡萄糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.05為鼠李糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移；6C型譜圖中，？啄5.59為葡萄糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.13為葡萄糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.05為鼠李糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移；6B型譜圖中，？啄5.62為半乳糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.17為鼠李糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.15為葡萄糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移；6D型譜圖中，？啄5.59為葡萄糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.17為鼠李糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移，？啄5.15為葡萄糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移。6A、6B、6C和6D型的環(huán)質(zhì)子區(qū)（？啄4.40～3.30）化學(xué)位移表現(xiàn)出不同的位移特性。

3 討論

肺炎鏈球菌是具有莢膜結(jié)構(gòu)的革蘭陽(yáng)性菌，根據(jù)莢膜多糖結(jié)構(gòu)不同，至少可以分為93個(gè)血清型[4]。特異性的莢膜多糖既是肺炎鏈球菌的毒力因子也是保護(hù)性抗原。隨著分子生物學(xué)手段在醫(yī)學(xué)細(xì)菌研究中的深入應(yīng)用，2007年和2009年分別從原6A和6B型中發(fā)現(xiàn)了6C型和6D型。2013年又分別發(fā)現(xiàn)了6E、6F、6G型，2015年發(fā)現(xiàn)了6H型。

2012年應(yīng)用核磁共振技術(shù)對(duì)6C型肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行解結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果與2007年發(fā)現(xiàn)6C型時(shí)所推測(cè)的結(jié)構(gòu)完全一致[14]。2013年在發(fā)現(xiàn)6F和6G型的文獻(xiàn)報(bào)道中，有6A、6B、6C、6D、6F和6G型莢膜多糖1H NMR端基質(zhì)子區(qū)，其化學(xué)位移與本研究中的數(shù)據(jù)稍有差異，如6A型譜圖中3個(gè)端基質(zhì)子峰分別為？啄5.60、？啄5.10和？啄5.02，6C型譜圖中3個(gè)端基質(zhì)子峰分別為？啄5.57、？啄5.10和？啄5.02，6B型譜圖中3個(gè)端基質(zhì)子峰分別為？啄5.56、？啄5.14和？啄5.10，6D型譜圖中3個(gè)端基質(zhì)子峰分別為？啄5.56、？啄5.14和？啄5.11[17]。目前無(wú)6D型莢膜多糖1H NMR譜發(fā)表。

1H NMR技術(shù)分析多糖結(jié)構(gòu)因其簡(jiǎn)捷、方便、重現(xiàn)性好、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越多的應(yīng)用于肺炎球菌多糖疫苗的質(zhì)量控制。目前普遍采用1H NMR端基質(zhì)子區(qū)作為肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型鑒定的“指紋”鑒定區(qū)。6A型和6C型、6B型和6D型，其端基質(zhì)子峰差異比較小，如果NMR數(shù)據(jù)采集條件不同，可能會(huì)導(dǎo)致無(wú)法正確鑒定其血清型。本研究比較此四種血清型的1H NMR譜圖，為正確鑒定莢膜多糖血清型提供基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] World Health Organization. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization- WHO position paper [S]. Wkly Epidemiol Rec，2007，82（12）：93-104.

[2] Park IH，Pritchard DG，Cartee R，et al. Discovery of a new capsular serotype （6C） within serogroup 6 of Streptococcus pneumonia [J]. J Clin Microbiol，2007，45（4）：1225-1233.

[3] Bratcher PE，Kim KH，Kang JH，et al. Identification of natural pneumococcal isolates expressing serotype 6D by genetic，biochemical and serological characterization [J]. Microbiology，2010，156（Pt 2）：555-560.

[4] Bratcher PE，Park IH，Oliver MB，et al. Evolution of the capsular gene locus of Streptococcus pneumoniae serogroup 6 [J]. Microbiology，2011，157（Pt 1）：189-198.

[5] Ko KS，Baek JY，Song JH. Capsular Gene Sequences and Genotypes of “Serotype 6E” Streptococcus pneumoniae Isolates [J]. J Clin Microbiol，2013，51（10）：3395-3399.

[6] Oliver MB，van der Linden MP，Küntzel SA，et al. Discovery of Streptococcus pneumoniae serotype 6 variants with glycosyltransferases synthesizing two differing repeating units [J]. J Biol Chem，2013，288（36）：25976-25985.

[7] Park IH，Geno KA，Yu J，et al. Genetic，biochemical，and serological characterization of a new pneumococcal serotype，6H，and generation of a pneumococcal strain producing three different capsular repeat units [J]. Clin Vaccine Immunol，2015，22（3）：313-318.

[8] Abeygunawardana C，Williams TC，Sumner JS，et al. Development and validation of an NMR-based identity assay for bacterial polysaccharides [J]. Anal Biochem，2000，279（2）：226-240.

[9] European Pharmacopoeia. Pneumococcal conjugate vaccine [S]. In 7.0th ed，812.

[10] World Health Organization. Recommendations to assure the quality，safety and efficacy of pneumococcal conjugate vaccines [R]. Replacement of：TRS 927，Annex 2. 2010.

[11] 王璽，任克明，陳曉航，等.核磁共振波譜法在肺炎球菌莢膜多糖檢定中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2013， 41（3 ）：18-23.

[12] 石繼春，羅樹全，李茂光，等.核磁共振氫譜和高壓液相分子排阻層析-十八角激光散射儀對(duì)肺炎鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)及分子質(zhì)量分析[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33（9）：700-705.

[13] Kenne L，Lindberg B，Madden JK. Structural studies of the capsular antigen from Streptococcus pneumoniae type 26 [J]. Carbohydr Res，1979，73（8）：175-182.

[14] Cai P，Moran J，Pavliak V，et al. NMR structural analysis of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae serotype 6C [J]. Carbohydrate Research，2012（351）：98-107.

[15] Park IH，Park S，Hollingshead SK，et al. Genetic basis for the new pneumococcal serotype，6C [J]. Infect Immun，2007， 75（9）：4482-4489.

[16] 陳瓊，李康，梁麗，等.應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定6群肺炎鏈球菌血清型[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2016，44（4）：12-16.

[17] Oliver MB，van der Linden MP，Küntzel SA，et al. Differing Repeating Units Glycosyltransferases Synthesizing Two Serotype 6 Variants with Discovery of Streptococcus pneumonia [J]. J Biol Chem，2013，288：25976-25985.

（收稿日期：2016-07-10 本文編輯：趙魯楓）