焦 晶, 楊 雪, 金蘭娜, 高 鍵, 周 洋, 肖亞中, 張應(yīng)玖,2

(1.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點實驗室, 2. 生命科學(xué)學(xué)院, 長春 130012;3. 安徽大學(xué)現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心, 合肥 230601)

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枯草桿菌漆酶重要功能位點的保守性與可變性分析

焦 晶1, 楊 雪1, 金蘭娜1, 高 鍵1, 周 洋1, 肖亞中3, 張應(yīng)玖1,2

(1.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點實驗室, 2. 生命科學(xué)學(xué)院, 長春 130012;3. 安徽大學(xué)現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心, 合肥 230601)

在對比分析天然枯草桿菌漆酶(CAR)的一級結(jié)構(gòu)與三維空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上, 鎖定了CAR的底物結(jié)合通道和銅離子結(jié)合位點, 設(shè)計并構(gòu)建了CAR的4種突變體. 對比分析了野生型酶與4種突變體酶的性質(zhì)及催化功能, 結(jié)果表明, 該漆酶分子中位于第二保守區(qū)的H155位點是漆酶催化所必需的, H155即使被其同義氨基酸(如Arg)替換, 也會因氧化還原電勢的降低而降低漆酶的催化活力, 同時還會導(dǎo)致漆酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性降低, 以及最適pH值酸移; 位于非保守區(qū)的A158位點與I224位點的保守性對漆酶的催化是有利的, 而S210G突變增強了漆酶的穩(wěn)定性與催化功能, 這可能與S210G突變增強了漆酶的底物通道上一段富含Pro片段的柔性有關(guān). 此外, A158/R155H突變(CAHE)可能導(dǎo)致漆酶不耐冷, 在低溫(<50 ℃)時引起酶活明顯降低. 所研究的漆酶在2,2′-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)介體存在下, 對靛藍類染料(如靛藍胭脂紅)和三苯甲烷類染料(如結(jié)晶紫)的脫色率均高于對偶氮類染料(如甲基紅和剛果紅)和蒽醌類染料(如活性亮藍), 說明該漆酶對染料有一定的選擇性.

漆酶; 結(jié)構(gòu); 催化; 枯草芽孢桿菌

漆酶(Laccase, EC 1.10.3.2) 是一類含銅的多酚氧化酶, 屬于藍色多銅氧化酶家族, 能以分子氧為電子受體, 催化酚類和芳胺類化合物徹底氧化, 副產(chǎn)物只有水, 因此漆酶是一種環(huán)境友好的酶[1,2]. 漆酶在生物檢測[3,4]、 環(huán)境保護與治理[5,6]、 造紙與紡織工業(yè)[7]、 食品工業(yè)[8]、 木質(zhì)纖維素加工處理[9,10]及生物能源[11,12]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用. 天然漆酶來源廣泛, 包括細菌、 真菌、 昆蟲和植物等, 其中細菌漆酶因分子組成簡單, 工程化容易, 發(fā)酵周期短及酶分子穩(wěn)定性高等特點, 而顯示出更強的應(yīng)用性[13～15]. 目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)漆酶的細菌主要集中在芽孢桿菌屬, 應(yīng)用基因工程技術(shù)可以實現(xiàn)細菌漆酶在大腸桿菌中的高效表達. 近年來, 漆酶作為一種高效、 綠色的催化劑, 其結(jié)構(gòu)與功能的研究日益受到重視[16], 以期獲得應(yīng)用價值較高的漆酶種[17,18]. 通過分子改造獲得優(yōu)良的漆酶種是一條有效的途徑, 也必將帶來巨大的經(jīng)濟效益和深遠的科學(xué)意義[19].

基因庫(GeneBank)中信息顯示, 來自芽孢桿菌屬的絕大部分漆酶均由約510個氨基酸構(gòu)成, 并具有較高(>93%)的序列同源性, 因此具有相似的構(gòu)象. 漆酶分子中通常含有4個銅離子, 分屬于2個相對獨立的含銅中心, 即單核中心及三核中心, 共同構(gòu)成了漆酶的活性部位, 負責(zé)結(jié)合底物和催化底物[1,20]. 由此推測, 漆酶的含銅中心以及鄰近殘基的空間位阻和電荷效應(yīng)會通過影響銅離子的鍵合狀態(tài)和微環(huán)境而直接或間接地影響漆酶的催化活性.

來自枯草芽孢桿菌的漆酶CAR由513個氨基酸構(gòu)成, 并與大多數(shù)細菌漆酶有96%以上的氨基酸序列同源性, 但其催化活性很低, 因此CAR可作為研究細菌漆酶結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)性的良好模型. BLAST氨基酸序列分析結(jié)果表明, 位于多數(shù)細菌漆酶第二個保守區(qū)的第155位點為His, 而在CAR中卻為Arg. 進一步依據(jù)枯草芽孢桿菌漆酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息, 通過同源建模獲得漆酶CAR的構(gòu)象(見圖1). 由圖1可見, A158與R155位點位于漆酶三核中心的催化區(qū)域, 2個位點相鄰近, 且其側(cè)鏈基團在肽鏈主鏈的同側(cè), 并朝向催化氧化的電子通道一側(cè), 其電荷效應(yīng)很可能會影響漆酶的催化效率; S210與I224位點分別位于一段富含Pro片段的兩端[圖1(B)], 可能會影響這一肽段的柔性和空間排布, 而這一肽段以及I224位點靠近單核中心的底物通道. 針對漆酶的上述區(qū)域及位點的功能調(diào)節(jié)作用目前尚未見報道[21～23].

Fig.1 3D structure of laccase CAR

為了確定這些區(qū)域及位點對CAR催化效率的影響, 本文依據(jù)CAR的構(gòu)象, 針對位點R155, A158, S210和I224, 設(shè)計了4種代表性突變體酶CAH(R155H), CAHE(R155H和A158E), CAHEG(R155H, A158E和S210G)和CAHEGF(R155H, A158E, S210G和I224F), 通過對比分析其性質(zhì)及功能, 闡明這些區(qū)域及位點與漆酶功能的相關(guān)性, 為揭示枯草芽孢桿菌漆酶功能調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提供一定的實驗與理論依據(jù). 本文研究結(jié)果為促進細菌漆酶更好地應(yīng)用于工業(yè)環(huán)境提供了一定的信息與實驗依據(jù). 在此基礎(chǔ)上, 再利用酶的固定化載體如殼聚糖等[24]進行優(yōu)良突變體酶的固定化, 便可實現(xiàn)漆酶的工業(yè)化應(yīng)用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2,2′-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、 靛藍胭脂紅(Indigo carmine)、 結(jié)晶紫(Crystal violet)、 剛果紅(Gongo red)、 甲基紅(Methyl red)、 活性亮藍(Remazol brilliant blue R, RBBR)均購自Sigma公司; 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物、 質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程公司; 限制性內(nèi)切酶、 DNA連接酶、 Taq酶、 pfu保真酶、 蛋白酶以及DNA、 蛋白質(zhì)Marker均購自日本TaKaRa公司; RNA酶(RNase)購自天根生化科技有限公司; 漆酶CAR、 重組載體pET28a-CAR、 枯草芽孢桿菌BS-CAR和大腸桿菌BL21(DE3)均為本課題組保存.

TC-25/H型PCR儀(杭州博日科技有限公司); WD-9403D型紫外分析儀(北京市六一儀器廠); DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司); Parstat 2273 電化學(xué)工作站(美國Princeton Applied Research公司).

1.2 引物設(shè)計

針對漆酶點突變R155H, A158E, S210G和I224F, 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物, 并應(yīng)用Oligo 6.0軟件分析引物合理性, 最終確定的4對引物序列如表1所示.

1.3 突變體漆酶基因的克隆

以重組載體pET28a-CAR為模板, 使用表1所示的引物, 分別采用全質(zhì)粒PCR擴增方法獲得突變體漆酶基因的重組載體pET28a-CAH, pET28a-CAHE, pET28a-CAHEG和pET28a-CAHEGF, 后者分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3), 經(jīng)篩選獲得陽性克隆. 所獲得的突變體漆酶基因由北京華大基因(BGI)科技有限公司分析確定.

Table 1 Designed primers

1.4 漆酶的誘導(dǎo)表達與純化

將各種酶的工程菌于37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6后, 加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG, 終濃度0.02～0.2 mmol/L)和CuSO4·5H2O(終濃度0.25 mol/L), 于16 ℃誘導(dǎo)目的基因表達12 h. 超聲破碎收集的菌體, 收集上層清液. 對表達的目的蛋白進行親和層析純化, 最終獲得純度達96%以上的各種漆酶制劑.

1.5 漆酶活力的測定

以ABTS(ε420 nm=36000 L·mol-1·cm-1)為底物, 在60 ℃, pH=4.6反應(yīng)體系中反應(yīng)5 min后, 使用分光光度計測定反應(yīng)體系的OD420 nm值, 計算漆酶的活力[25]. 反應(yīng)體系: 50 μL酶液+10 μL ABTS(100 mmol/L)+50 μL CuSO4·5H2O(100 mmol/L)+100 μL 醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L, pH=4.6). 漆酶活力單位定義: 每分鐘催化1.0 μmol底物氧化所需的酶量為一個酶活力單位(U). 所有測定均重復(fù)3次, 取平均值.

1.6 漆酶動力學(xué)參數(shù)的測定

分別以0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.5和1.0 mmol/L的ABTS為底物, 在60 ℃, pH=4.6條件下分別測定各種漆酶的反應(yīng)初速度, 以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算相應(yīng)的Km和kcat值.

1.7 漆酶氧化還原電勢的測定

采用循環(huán)伏安法(CV)測定各種漆酶的氧化還原電勢. 使用飽和甘汞電極(25 ℃, 0.245 V)為參比電極, Pt電極為對電極, 玻碳電極為工作電極; 所有電動勢均相對標準氫電極而計; 掃描速率為120 mV/s.

1.8 漆酶最適溫度、 最適pH值及穩(wěn)定性測定

1.8.1 最適溫度測定 以ABTS為底物, 分別在pH=4.6和不同溫度(20～90 ℃)下測定各種漆酶的催化活性. 所有測定均重復(fù)3次, 取平均值.

1.8.2 溫度穩(wěn)定性測定 分別將漆酶CAR, CAH, CAHEG和CAHEGF置于30～90 ℃的反應(yīng)體系(pH=4.6)中孵育1 h, 再加入ABTS, 測定相應(yīng)漆酶的催化活性. 所有測定均重復(fù)3次, 取平均值. 各種漆酶以其活力最高者計為100%.

1.8.3 最適pH值測定 以ABTS為底物, 在60 ℃條件下, 分別在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH=2.0～8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH=9.0)中測定漆酶CAR, CAH, CAHEG和CAHEGF的催化活性. 所有測定均重復(fù)3次, 取平均值.

1.8.4 酸堿穩(wěn)定性測定 分別將漆酶CAR, CAH, CAHEG和CAHEGF置于不同pH值的反應(yīng)體系中孵育1 h, 再加入ABTS, 測定相應(yīng)漆酶的催化活性. 所有測定均重復(fù)3次, 取平均值. 各種漆酶以其活力最高者計為100%.

1.9 染料脫色率的測定

以ABTS為介體, 測定了各種漆酶對表2所示5種染料的脫色率. 在60 ℃, pH=4.6的反應(yīng)體系中加入染料, 分別在30, 60, 90, 120, 150和180 min 時測定最大光吸收值(A1); 同樣測定相應(yīng)的對照組(A0), 根據(jù)公式: Decolorization(%)=[(A0-A1)/A0]×100%計算脫色率. 所有測定均重復(fù)3次, 取平均值.

Table 2 Final concentration and maximum absorbance wavelengths of the tested dyes

1.10 漆酶三維結(jié)構(gòu)同源建模

利用Discovery StudioTM分子模擬軟件同源建模分析漆酶的三維結(jié)構(gòu)[26]. 利用InsightⅡ軟件包中的Modeler程序進行同源建模構(gòu)建出漆酶的初始結(jié)構(gòu)模型, 再利用NAMD軟件包對漆酶的初始模型進行優(yōu)化, 最后獲得漆酶的三維結(jié)構(gòu)模型.

2 結(jié)果與討論

2.1 突變體酶基因克隆的表達載體構(gòu)建

分別從pET28a-CotA-CAR, pET28a-CotA-CAH, pET28a-CotA-CAHE, pET28a-CotA-CAHEG和pET28a-CotA-CAHEGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)的平板上挑取單克隆, 提取質(zhì)粒, 經(jīng)限制酶鑒定正確后再進行DNA序列分析. 結(jié)果表明, 所獲得的單克隆分別為pET28a-CAR, pET28a-CAH, pET28a-CAHE, pET28a-CAHEG和pET28a-CAHEGF陽性克隆, 所有突變體基因序列正確.

2.2 漆酶的誘導(dǎo)表達與純化

Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified laccases

分別將漆酶CAH, CAHEG, CAHEG和CAHEGF工程菌擴大培養(yǎng)后, 用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達. 通過SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物分子量均約為66000, 與理論值相符, 說明CAH, CHAE, CAHEG和CAHEGF均實現(xiàn)了正確表達. 表達宿主經(jīng)超聲破碎后離心, 收集上層清液, 再經(jīng)過Ni柱親和層析純化, 獲得純化的突變體漆酶CAH, CAHE, CAHEG和CAHEGF, 經(jīng)SDS-PAGE分析其純度均在96%以上, 結(jié)果如圖2所示.

以ABTS為底物, 測得的所有突變體酶的催化活力結(jié)果如表3所示. 可知, 與野生型漆酶CAR相比, 所有突變體酶的催化活力均有不同程度的提高, 其中突變體酶CAH的活力提高得最顯著, 約提高了13倍. 這說明H155位點對漆酶的催化是必需的, 同時其它位點(A158, S210和I224)對漆酶的催化作用也有不同的影響. R155H和S210G突變可提高漆酶的催化活力, 而A158E和I224F突變有相反影響, 說明A158和I224的保守性對漆酶的催化是有利的.

Table 3 Specific activities and oxidation-reduction potentials of the wild type and mutant laccases

通過漆酶氨基酸序列對比分析發(fā)現(xiàn), 所研究的漆酶CAR中的R155位點通常是漆酶中與銅離子形成配位鍵的位點之一[26]. 雖然Arg與His是同義氨基酸, 但表3數(shù)據(jù)顯示, CAH(R155H)的催化活力明顯高于CAR, 說明該位點為His是此類漆酶功能所必需的.

2.3 漆酶氧化還原電勢的分析與比較

采用循環(huán)伏安法測定了野生型酶CAR及4種突變體酶的氧化還原電勢, 結(jié)果如表3所示. 可知, 4種突變體酶的氧化還原電勢均高于野生型漆酶, 而且相應(yīng)的變化與其活力水平呈正相關(guān), 說明4個位點(R155, A158, S210和I224)的突變均直接影響漆酶的氧化還原電勢, 且這種影響直接體現(xiàn)在催化功能上, 氧化還原電勢的改變與其相應(yīng)的催化活力的改變是統(tǒng)一的, 其中R155H和S210G為有益突變, 而A158E和I224F為有害突變.

2.4 漆酶動力學(xué)分析

由野生型漆酶CAR及突變體酶CAH, CAHE, CAHEG和CAHEGF的L-B雙倒數(shù)曲線得出其動力學(xué)參數(shù)如表4所示. 由表4可知, 與野生型漆酶CAR相比, 4種突變體酶的動力學(xué)參數(shù)均有不同程度的改變,Km值均降低而kcat值均增高, 其中CAH的參數(shù)變化幅度最顯著. 由于Km值與kcat值分別與酶的底物親和性和催化活力呈負相關(guān)與正相關(guān), 而比值kcat/Km代表酶的催化效率, 因此4種突變體酶的催化效率均有不同程度的提高, 其中仍以CAH提高最為明顯. 顯然, 這些酶的活力水平(表3)與其催化動力學(xué)參數(shù)(表4)數(shù)值變化是一致的, 其中突變體酶CAH的kcat值最大(85 s-1),Km值最小(0.10 mmol/L), 因此其效率也最高(850.0 L·s-1·mmol-1).

Table 4 Kinetic parameters of the wild type and mutant laccases

2.5 漆酶的最適溫度、 最適pH值及穩(wěn)定性

以ABTS為底物, 測定了野生型漆酶及突變體酶的最適溫度與最適pH值, 結(jié)果顯示, 野生型酶CAR以及突變體酶CAHE, CAHEG和CAHEGF的最適溫度均為80 ℃, 突變體酶CAH的最適溫度為70 ℃, 均屬于耐熱酶. 野生型酶CAR的最適pH=4.0, 說明其較適宜在弱酸性條件下應(yīng)用, 而所有突變體酶的最適pH值發(fā)生了堿移, CAH, CAHEG和CAHEGF的最適pH=5.0, 而CAHE的最適pH=6.0, 說明突變體酶更適宜在近中性條件下應(yīng)用. 因為在實際應(yīng)用中, 用到漆酶的環(huán)境較少呈弱酸性, 因此, 與野生型酶CAR相比, 突變體酶的應(yīng)用性拓寬了, 更有實用價值.

Fig.3 Thermostabilities(A) and acid-base stabilities(B) of the wild type and mutant laccases

野生型酶CAR及突變體酶的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性分析結(jié)果如圖3所示. 圖3(A)結(jié)果顯示, 突變體酶CAH的熱穩(wěn)定性最高, 其它突變體酶次之, 而野生型酶CAR的熱穩(wěn)定性最低; 但是CAHE在50 ℃以下時熱穩(wěn)定性要低于CAR, 表明CAHE是一種不耐冷的突變體酶. 雖然CAH的最適溫度(70 ℃)較其它酶的(80 ℃)低, 但其更耐熱. 進一步分析發(fā)現(xiàn), 這些漆酶在70 ℃以下時, 其活力隨著孵育溫度的升高(如1 h)而升高, 推測有可能在孵育過程中, 漆酶分子及其中的銅離子得到了進一步的活化. 本文的漆酶特有的催化性質(zhì)與大多數(shù)酶不同, 說明該漆酶有其獨特的功能調(diào)節(jié)機制. 圖3(B)結(jié)果表明, 雖然所有漆酶均在pH=6.0時穩(wěn)定性最好, 但突變體酶的酸堿穩(wěn)定性均較野生型酶CAR高, 結(jié)合上述不同酶的最適pH值可見, 突變體酶對酸堿的耐受性拓寬了, 其中CAH的耐受性最強, 在pH=4.5～8.0范圍內(nèi), 其酶活力仍保持在80%以上.

2.6 漆酶對不同染料的脫色作用

實驗選取的5種染料靛藍胭脂紅(靛藍類)、 結(jié)晶紫(三苯甲烷類)、 剛果紅(偶氮類)、 甲基紅(偶氮類)和活性亮藍(蒽醌類)分屬于4類染料, 在分子量、 分子形狀和性質(zhì)等方面略有不同. 以ABTS為介體, 測定野生型酶CAR及突體酶對這5種染料的脫色效率, 結(jié)果見圖4.

Fig.4 Decolorization of several dyes by the wild type and mutant laccases

由圖4可知, 野生型酶CAR對5種染料的脫色效力均較低, 而突變體酶CAH, CAHEG和CAHEGF脫色效力均有不同程度的提高, 其中突變體酶CAH對5種染料的脫色率均最高. 顯然, 脫色率與漆酶的活力水平(表3)一致. 另外, 所有的漆酶對靛藍胭脂紅(靛藍類)和結(jié)晶紫(三苯甲烷類)的相對脫色率均較高, 而對活性亮藍(RBBR)的相對脫色率均較低, 但不同的漆酶對剛果紅和甲基紅(偶氮類)的相對脫色率卻有明顯差別. 這說明枯草芽孢桿菌漆酶對作用的染料有一定的選擇性, 其脫色效果既與染料本身有關(guān), 也與酶的分子結(jié)構(gòu)有關(guān).

進一步比較不同漆酶對染料脫色率(圖4)發(fā)現(xiàn), 雖然總體上枯草芽孢桿菌漆酶對染料的脫色率與酶的活力水平呈正相關(guān)性, 但是不同的染料分子與漆酶分子底物結(jié)合通道(單核中心)的構(gòu)象呈不同程度的相關(guān)性. 圖4結(jié)果表明, 漆酶催化染料物質(zhì)脫色的效率與染料物質(zhì)的分子量不相關(guān), 但與染料物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)(或結(jié)構(gòu)類別)似乎有一定的關(guān)聯(lián). 野生型和突變體漆酶對靛藍胭脂紅的相對脫色效果均較強, 而對活性亮藍(RBBR)的相對脫色效果均較弱. 這表明靛藍類物質(zhì)是此類漆酶較合適的底物, 而蒽醌類物質(zhì)并不合適, 其它的介于二者之間. 另一方面, 漆酶底物通道的構(gòu)象以及S210與I224之間肽段的柔性似乎對靛藍類(靛藍胭脂紅)、 三苯甲烷類(結(jié)晶紫)和蒽醌類(活性亮藍)染料的影響較小, 故相對脫色率較穩(wěn)定, 但對偶氮類染料(剛果紅、 甲基紅)的影響較顯著, CAHEG與CAHEGF催化偶氮類染料的相對脫色率明顯高于CAH與CAR, 這主要是由S210G突變引起的. 顯然, 枯草芽孢桿菌漆酶底物通道的構(gòu)象以及S210與I224之間肽段的柔性對不同染料的特異性有不同程度的影響.

綜合以上結(jié)果并結(jié)合野生型和突變體漆酶的三維空間結(jié)構(gòu)(圖5)發(fā)現(xiàn), 漆酶CAR中的R155位點通常是漆酶中與銅離子形成配位鍵的位點之一[26], 雖然Arg與His是同義氨基酸, 但該位點為His是此類漆酶功能所必需的; 同時, 雖然A158位點為非保守區(qū)位點, 但因與H155位點相靠近, 而且兩者的側(cè)鏈基團在肽鏈的同側(cè), 該位點為小分子非極性氨基酸殘基如Ala(CAH)對漆酶催化氧化的電子傳遞更有利, 而若突變?yōu)闃O性氨基酸如Glu(CAHE), 則可能因其電荷或極性嚴重干擾了電子傳遞而導(dǎo)致酶的活力下降(表3和圖5), 因此A158的保守性對漆酶的催化性能也是必要的.

Fig.5 3D structures and the active sites of wild type and mutant laccases

S210和I224位點分別位于有機底物結(jié)合入口處的一段富Pro區(qū)的兩端, 而且I224還位于底物通道的側(cè)面, I224F突變導(dǎo)致Phe的側(cè)鏈苯環(huán)伸向該通道, 影響有機物底物的進入和產(chǎn)物的釋出(圖5中CAHEG和CAHEGF), 故酶表現(xiàn)出活力下降. S210位點位于富Pro區(qū)的另一端, 會影響富Pro區(qū)肽段的柔性和空間排布, 顯然S210G突變可增加富Pro區(qū)的柔性, 有利于某些底物的結(jié)合. 結(jié)果表明, S210G和I224F突變從底物親和性方面影響漆酶的功能, 兩者的效果相反, S210G突變與I224保守性對漆酶的催化是有利的. 此外, 漆酶的一個重要應(yīng)用是催化染料物質(zhì)氧化脫色, 其脫色率與染料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均有關(guān).

3 結(jié) 論

所研究的漆酶CAR中的R155H突變是此類漆酶功能所必需的, 而其鄰近的A158位點的保守性對漆酶的催化也是必要的, 兩者均為漆酶第二個保守區(qū)中的關(guān)鍵位點. 位于有機底物結(jié)合入口處的一段富Pro肽段的柔性增加有利于底物的結(jié)合, 而該肽段兩端的S210G突變與I224保守性對底物的結(jié)合和漆酶的催化是有利的.

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(Ed.: P, H, V, K)

Conservative and Variability of the Important Functional Sites in a Laccase from Bacillus Subtilis?

? Supported by the Jilin Provincial Science and Technology Department Program, China(No.20140101020JC) and the Project of Collaborative Innovation Center of Modern Bio-manufacture, Anhui University, China(No.BM2014001).

JIAO Jing1, YANG Xue1, JIN Lanna1, GAO Jian1, ZHOU Yang1,XIAO Yazhong3*, ZHANG Yingjiu1,2*

(1.KeyLaboratoryforMolecularEnzymologyandEngineeringoftheMinistryofEducation,2.SchoolofLifeSciences,JilinUniversity,Changchun130012,China;3.CollaborativeInnovationCenterofModernBio-manufacture,AnhuiUniversity,Hefei230601,China)

A laccase from Bacillus subtilis has more than 96% residue identity to most other bacterial laccases, but has lower catalytic activity. Four mutant laccases were designed and their catalytic properties and functions were investigated. The results demonstrated that residue H155 was particularly essential for the catalytic activity of this laccase, and was one of the key residues in the second conserved region of laccases. Replacement of this residue reduced the oxidation-reduction potential and the catalytic activity of the laccase, and also reduces its thermal or pH stability, and caused a shift of its optimum pH from 5.0 to 4.0. Conservation of residues A158 and I224 in non-conserved region of the laccase was also advantageous for the catalysis of the laccase. A158 was conducive to the electron transport in enzymatic oxidation process, while I224 was appropriate to make the substrate into the mononuclear center of the laccase. S210G mutation enhanced the catalytic efficiency of the laccase perhaps by increasing of the flexibility of the pro-rich loop adjacent to the entrance of the substrate channel of this laccase. The laccase in this study decolorized indigo dyes such as indigo carmine more effectively than triphenylmethane dyes such as crystal violet, azo dyes such as methyl red or Congo red, and anthraquinone dyes such as Remazol Brilliant Blue R(RBBR), indicated that the laccase in this study had certain substrate selectivity. These results would provide some insights into the relationship between the structure and function of bacterial laccases.

Laccase; Structure; Catalysis; Baculus subtilis

2016-02-06.

日期: 2016-06-17.

吉林省科技廳計劃項目(批準號: 20140101020JC)和安徽大學(xué)現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心開放課題(批準號: BM2014001)資助.

10.7503/cjcu20160092

O625.75; Q554

A

聯(lián)系人簡介: 張應(yīng)玖, 女, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事酶學(xué)方面的研究. E-mail: yingjiu@jlu.edu.cn

肖亞中, 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事生物催化方面的研究. E-mail: yazxiao@ahu.edu.cn