李 敏, 孔慧芳, 郭志慧

(陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 陜西省生命分析化學(xué)重點實驗室, 西安710119)

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基于銅離子與DNA相互作用的銅離子檢測

李 敏, 孔慧芳, 郭志慧

(陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 陜西省生命分析化學(xué)重點實驗室, 西安710119)

利用銅離子(Cu2+)可與DNA分子中的堿基相互作用形成絡(luò)合物的性質(zhì), 將Cu2+富集在DNA修飾電極表面, 進(jìn)而采用微分脈沖伏安法(DPV)實現(xiàn)了銅離子的檢測. 此外, 由于乙二胺四乙酸(EDTA)對Cu2+具有更強(qiáng)的絡(luò)合能力, 富集于DNA修飾電極表面的Cu2+很容易被洗脫液中的EDTA絡(luò)合, 從而實現(xiàn)修飾電極的再生和重復(fù)利用. 實驗結(jié)果表明, 在最佳實驗條件下, Cu2+濃度在2.0×10-6～1.0×10-5mol/L和2.0×10-5～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)與其相對還原峰電流強(qiáng)度(I-I0)呈良好的線性關(guān)系, 且該傳感器簡單、 穩(wěn)定, 可循環(huán)使用.

DNA修飾電極; 電化學(xué)傳感器; 差分脈沖伏安法; 銅離子

銅離子是生命體中一種必需的微量元素, 廣泛分布于生物組織中, 生物體內(nèi)的銅離子大部分以有機(jī)復(fù)合物形式存在, 其在生命活動中扮演著重要角色. 銅離子可以作為酶輔助因子參與生命活動, 也可以參與紅細(xì)胞的形成[1]. 生物系統(tǒng)中許多涉及氧的電子傳遞和氧化還原反應(yīng)過程都是由含銅酶催化的, 這些酶對生命過程至關(guān)重要. 此外, 銅離子對大腦、 心臟、 造血以及抗癌等有重要作用. 然而, 過量的銅離子會導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題, 如會引起缺血性心臟病、 腎病、 貧血和骨骼疾病等[2], 也會給人體內(nèi)的臟器造成負(fù)擔(dān), 從而影響人體健康. 美國環(huán)境保護(hù)署發(fā)布, 飲用水中的銅離子含量最大值為1.30 mg/L[3], 歐洲食品安全局規(guī)定食品中銅離子的濃度范圍為1.2～4.2 mg/L[4]. 我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定, 飲用水中銅離子含量不得高于1.0 mg/L. 因此, 準(zhǔn)確檢測水、 食品和環(huán)境中的銅離子污染物含量十分必要.

檢測銅離子的傳統(tǒng)方法包括原子吸收光譜法[5]、 電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[6]、 伏安法[7～9]和熒光光譜法[10～12]等. 這些方法雖然有較高的靈敏度和較好的選擇性, 但所用儀器比較昂貴、 實驗成本也高, 所以, 在檢測某些領(lǐng)域中的銅離子時, 這些方法有一定的局限性. 因此, 設(shè)計一種簡單、 低成本、 靈敏度高且能在線實時檢測銅離子的傳感器具有重要意義.

DNA分子本身具有高度有序的自組裝特性, 多形態(tài)的手性納米結(jié)構(gòu)、 獨特的堿基配對方式、 穩(wěn)定的理化性質(zhì)以及基于結(jié)構(gòu)的分子識別特性使其成為目前構(gòu)建納米自組裝材料的理想元件之一[13], 這對功能化納米材料的合成及其在手性催化劑[14]、 電化學(xué)傳感[15]和金屬納米晶體[16]的應(yīng)用具有重要意義. 在生物無機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中, Cu2+, Zn2+, Ni2+, Co2+和Mn2+等過渡金屬離子與DNA分子中的核酸堿基和序列的特殊作用已被廣泛研究[17～21]. 文獻(xiàn)[22]報道表明, 各種金屬離子與 DNA 分子之間的結(jié)合方式主要有2種類型: 一種是金屬離子(包括堿金屬和堿土金屬離子)與 DNA 分子中磷酸基團(tuán)通過簡單的靜電作用相結(jié)合; 另一種是金屬離子(包括一些過渡金屬如 Ag+, Hg2+和Pt2+等)與 DNA 分子中的堿基相互作用而結(jié)合. 大部分過渡態(tài)金屬離子既能與 DNA 磷酸骨架靜電結(jié)合又能與DNA分子上的堿基相互作用, 而金屬離子與DNA的具體結(jié)合方式和結(jié)合力大小不僅與 DNA 序列的組成、 結(jié)構(gòu)相關(guān), 還與金屬離子濃度以及環(huán)境因素如離子強(qiáng)度、 溫度、 pH值及作用時間等密切相關(guān)[22].

由于銅離子在生命體中獨特的生理作用, 科研工作者對其與DNA之間作用的研究更為深入和廣泛. 其中, 將銅離子對DNA序列的高識別能力用于構(gòu)建DNA納米材料受到廣泛關(guān)注. 通常認(rèn)為銅離子與 DNA 分子之間存在以下幾種結(jié)合方式: (1) 在銅離子濃度或銅離子/堿基比例很低的情況下, 銅離子與DNA 分子磷酸基團(tuán)通過靜電作用非特異性結(jié)合; (2) 在銅離子濃度或銅離子/堿基比例逐漸增加的情況下, 銅離子對DNA分子上堿基的親和力將會逐漸增大, 此時銅離子主要與鳥嘌呤(G)中的 N7 和 O6 原子以及胞嘧啶(C)中的N3和O2原子結(jié)合; (3) 當(dāng)DNA鏈中含有連續(xù)鳥嘌呤時, 銅離子會與同一條鏈上2個相鄰鳥嘌呤的N7和O6原子結(jié)合, 形成“G-Cu(Ⅱ)-G 的三明治結(jié)構(gòu)”, 這種結(jié)合方式能夠增強(qiáng)相鄰鳥嘌呤間的堿基堆積作用以及鳥嘌呤-胞嘧啶堿基對中的氫鍵作用; (4) 當(dāng)DNA鏈中富含腺嘌呤(A)或者胸腺嘧啶(T)時, 銅離子與DNA序列的作用力較弱[21,23].

本文基于銅離子與DNA之間的相互作用, 建立了一種簡單、 快速測定銅離子的電化學(xué)方法. 首先將探針DNA自組裝在Au電極表面, 然后通過銅離子與DNA分子中堿基的相互作用將銅離子富集到DNA修飾的Au電極上, 采用微分脈沖伏安(DPV)法實現(xiàn)銅離子的檢測. 此外, 由于乙二胺四乙酸對銅離子具有更強(qiáng)的絡(luò)合能力, 測試后的電極可通過在乙二胺四乙酸溶液中浸泡的方法除去表面富集的銅離子, 從而實現(xiàn)電極的再生和重復(fù)利用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

六巰基己醇(MCH)購自Sigma公司; 乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)、 氯化鉀(KCl)、 氯化鈉(NaCl)、 鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]、 亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6]、 濃鹽酸、 氯化銅(CuCl2)、 氯化鎘(CdCl2)、 硝酸鉛[Pb(NO3)2]、 硝酸汞[Hg(NO3)2]、 硫酸鎳(NiSO4·5H2O)、 磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)和磷酸氫二鈉(NaH2PO4·12H2O)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 所用試劑均為分析純, 使用前未經(jīng)過處理; 三羥甲基氨基甲烷和DNA[序列: 5′-SH-(CH2)6-GTAAAACGACGGCCAG-3′]購自生工生物工程有限公司; Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L, pH=9.0); Na2HPO4-NaH2PO4系列緩沖液. 實驗用水均為超純水. TG16-W型微量高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司); KH-250 DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司); CHI 620C型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司); 三電極體系: 飽和Ag/AgCl為參比電極, 金盤電極(直徑2 mm)為工作電極, 鉑絲(Pt)為對電極, 參比電極和工作電極購自高仕睿聯(lián)科技有限公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 DNA溶液的配制 將DNA序列在11000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后, 加入適量的PBS 緩沖溶液充分振蕩溶解, 得到濃度為100 μmol/L的DNA溶液. 對DNA溶液進(jìn)行退火處理, 然后快速冷卻到室溫, 于4 ℃存儲備用. 準(zhǔn)確移取10 μL 100 μmol/L DNA 溶液置于0.5 mL離心管中, 用10 mmol/L 的PBS緩沖液(pH=7.4)稀釋得到10 μmol/L DNA溶液.

1.2.2 Au電極表面的預(yù)處理 分別用0.3和0.05 μm的Al2O3粉末打磨Au電極, 置于無水乙醇和超純水中依次超聲5 min, 然后將電極浸在濃度為0.1 mol/L的H2SO4溶液中進(jìn)行電化學(xué)掃描清洗, 電位窗口為0～1.5 V, 掃描至所得CV曲線穩(wěn)定即可. 用超純水沖洗電化學(xué)清洗過的Au電極, 室溫下晾干備用.

1.2.3 Au電極表面的修飾 將經(jīng)預(yù)處理的Au電極插入10 μmol/L 的探針DNA溶液中, 探針DNA分子通過Au—S共價鍵作用自組裝到Au電極表面, 然后分別用10 mmol/L 的PBS緩沖液(pH=7.4)和超純水沖洗Au電極表面, 制得Au-ssDNA 電極. 為了除去電極表面非特異性吸附的DNA并使探針DNA能有序地排列在Au電極表面, 將Au-ssDNA 電極浸在1 mmol/L的MCH溶液中保持40 min, 即得到Au-ssDNA-MCH 電極.

1.2.4 電化學(xué)檢測銅離子 將Au-ssDNA-MCH 電極浸入含有銅離子的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中, 吸附一定時間后, 用超純水清洗電極表面. 將三電極體系插入5 mL含有10 mmol/L PBS(pH=7.0)和0.1 mol/L NaCl 的電解液中, 采用DPV法進(jìn)行檢測, 參數(shù)設(shè)置[24]如下: 初始電位為0.6 V; 高電位為0.6 V; 低電位為-0.1 V; 脈沖時間為0.2 s; 脈沖幅度為0.05 V; 靜止時間為2 s; 脈沖寬度為0.05 V; 采樣間隔為0.0167 s. 每次測定后, 將電極浸泡在含過量EDTA的Tris-HCl緩沖溶液(10 mmol/L, pH=9.0)中40 min以除去銅離子, 得到的電極可以重復(fù)使用[25].

2 結(jié)果與討論

2.1 探針DNA修飾Au電極的表征

采用循環(huán)伏安法(CV)對Au電極表面的組裝過程進(jìn)行了表征. 圖1示出了裸Au電極、 Au-ssDNA電極和Au-ssDNA-MCH電極在含有1 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl的溶液中測得的CV曲線. 曲線a為裸Au電極的CV曲線, 存在明顯的氧化還原峰, 表明[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面進(jìn)行了電子傳遞. 當(dāng)探針DNA組裝到Au電極表面時, [Fe(CN)6]3-/4-在電極表面上的氧化還原峰電流降低且峰形也變得不可逆(曲線b), 這是由于探針DNA分子中的磷酸骨架帶負(fù)電荷, 排斥同樣帶負(fù)電荷的[Fe(CN)6]3-/4-, 導(dǎo)致[Fe(CN)6]3-/4-遠(yuǎn)離電極表面, [Fe(CN)6]3-/4-的電子傳遞受到阻礙, [Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原峰電流降低. 當(dāng)在電極上修飾MCH后(曲線c), 峰電流進(jìn)一步降低, 這是由于MCH在電極表面形成的單分子層影響了[Fe(CN)6]3-/4-向電極表面的擴(kuò)散, 導(dǎo)致峰電流再次降低.

Fig.1 CV curves of 1 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4 [Fe(CN)6] at bare Au(a), Au-ssDNA(b) and Au-ssDNA-MCH(c) electrodes

Fig.2 Differential pulse voltammograms of DNA modified electrodes without Cu2+(a) and with Cu2+(b) in 10 mmol/L PBS containing 0.1 mol/L NaCl(pH=7.0)

2.2 探針DNA修飾Au電極對銅離子的響應(yīng)

將探針DNA修飾Au電極浸在含有銅離子的溶液中吸附一段時間后, 采用DPV法進(jìn)行檢測. 圖2示出了探針DNA修飾電極在吸附銅離子前后的DPV響應(yīng)曲線. 可見, 吸附銅離子之前的修飾電極未檢測到電活性物質(zhì)(曲線a); 而吸附銅離子之后的修飾電極在約0.15 V處出現(xiàn)了明顯的電化學(xué)還原峰(曲線b), 這是由于銅離子與DNA分子中的堿基相互作用形成了絡(luò)合物, 絡(luò)合物吸附在修飾電極表面, 掃描時Cu2+得電子被還原為Cu+所致. 根據(jù)文獻(xiàn)[25]報道可知銅離子對DNA序列的識別能力較強(qiáng), 這是因為銅離子與DNA分子中的堿基G, C, T和A有鍵合親和性, 故銅離子能與DNA相互作用, 形成相應(yīng)的絡(luò)合物. 其中銅離子與堿基G和C的鍵合親和性強(qiáng)于堿基T和A, 其原因是銅離子主要與G中的N7 和 O6原子以及C中的O2原子相互作用. 在中性條件下, 過渡金屬離子與DNA堿基作用的穩(wěn)定性順序為N7/O6(G)>N3(C)>N7(A)>N1(A)>N3(A,G), 而且過渡金屬離子與鳥嘌呤(G)中的N7相互作用的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于其與O6或其它堿基作用的穩(wěn)定性, 因此本文主要考慮Cu2+與N7(G)作用的穩(wěn)定性[26～30]. 其作用原理如圖3所示.

Fig.3 Schematic representation of detecting Cu2+

2.3 實驗條件的優(yōu)化

實驗考察了銅離子吸附時間、 pH值和DNA自組裝時間對響應(yīng)信號的影響. 以探針DNA修飾電極有無吸附銅離子所產(chǎn)生的信號比值作為響應(yīng)信號(I/I0,I為修飾電極吸附銅離子后產(chǎn)生的信號,I0為背景信號).

2.3.1 銅離子吸附時間的選擇 電極表面上銅離子的吸附量會對響應(yīng)信號產(chǎn)生影響, 因此考察了修飾電極與銅離子的作用時間. 將Au-ssDNA-MCH電極浸在含有5 μmol/L銅離子的PBS緩沖液中, 通過控制吸附時間來控制銅離子的吸附量. 當(dāng)吸附時間由30 min 增至60 min時, 響應(yīng)信號也隨之逐漸增大; 而當(dāng)吸附時間超過60 min后, 響應(yīng)信號趨于穩(wěn)定(見圖4). 這是因為DNA中的堿基與銅離子配位是一個動力學(xué)過程, 隨著作用時間增長, 修飾電極吸附的銅離子量增大, 從而電化學(xué)信號增強(qiáng); 而當(dāng)吸附時間大于60 min時, 由于銅離子在DNA修飾電極上已經(jīng)達(dá)到吸附飽和, 所以電化學(xué)信號不再隨著時間增長而增強(qiáng). 因此, 實驗選擇銅離子的最佳吸附時間為60 min.

Fig.4 Effect of adsorption time of Cu2+ on DPV response signal(cCu2+= 5×10-6 mol/L)

Fig.5 Effect of pH value on the DPV response signal in 10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 solution

Fig.6 Influence of the self-assembly time of DNA on the DPV response signal(cDNA=5.0×10-5 mol/L)

2.3.2 磷酸緩沖液pH的選擇 將Au-ssDNA-MCH電極浸在含有銅離子的不同pH值的磷酸緩沖液中, 作用一定時間后進(jìn)行測定, 結(jié)果如圖5所示, 隨著pH值的增大, 響應(yīng)信號值先增大后減小, 當(dāng)磷酸緩沖液的pH值為7.4時, 響應(yīng)信號值最大. 這可能是由于在酸性介質(zhì)中, 銅離子與DNA中堿基的配位能力較差, 在堿性介質(zhì)中銅離子容易發(fā)生水解. 因此, 選擇合適的pH值為7.4.

2.3.3 DNA自組裝時間的選擇 固定在電極表面上的DNA數(shù)目對銅離子的吸附量具有直接影響, 故實驗考察了DNA的自組裝時間. 如圖6所示, 修飾電極在10 μmol/L DNA溶液中自組裝120 min后, 響應(yīng)信號值趨于穩(wěn)定, 因此選擇自組裝時間為120 min.

2.4 分析特性

在最佳實驗條件下, 探針DNA 修飾電極與不同濃度的銅離子作用60 min后測得的DPV曲線如圖7所示. 可見, 隨著銅離子濃度的增大, 銅離子的還原峰電流依次增大. 在2.0×10-6～1.0×10-5mol/L和2.0×10-5～1.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi), 銅離子的濃度與其相對峰電流強(qiáng)度I-I0呈良好的線性關(guān)系, 線性回歸方程分別為I-I0=-0.056+0.091cCu2+(相關(guān)系數(shù)為0.9846);I-I0=0.67+0.038cCu2+(相關(guān)系數(shù)為0.9872), 檢出限為6.4×10-7mol/L(S/N=3). 表1示出了該修飾電極與其它已報道的檢測銅離子的電化學(xué)方法的對比結(jié)果, 可見該修飾電極的線性范圍較寬. 此外, 該修飾電極的靈敏度也滿足實際水樣的檢測, 有望應(yīng)用于實地檢測.

Fig.7 DPV response of the DNA modified electrode at different concentration of Cu2+ in 10 mmol/L PBS(pH=7.0) and 0.1 mol/L NaCl

Table 1 Comparison of the electrochemical sensor in this work and other sensors

對所構(gòu)建的銅離子電化學(xué)傳感器的再生性和選擇性進(jìn)行了考察. 將吸附銅離子后的電極浸在含過量EDTA的Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L, pH=9.0)中40 min后, 檢測電極的DPV行為, 結(jié)果示于圖8和圖9. 由圖8可見, DPV曲線上銅離子的還原峰消失, 說明銅離子已經(jīng)從電極上去除. 這是由于EDTA與銅離子的絡(luò)合作用強(qiáng)于DNA, 所以將富集有銅離子的電極在含有過量EDTA的溶液中浸泡一段時間后, EDTA可與銅離子形成更穩(wěn)定的絡(luò)合物(本實驗條件下EDTA與Cu2+的絡(luò)合常數(shù)約為1018.7, N7(G)與Cu2+的絡(luò)合常數(shù)約為106.2), 使銅離子由電極表面轉(zhuǎn)移到溶液中, 從而實現(xiàn)傳感器的再生. 再生性考察結(jié)果如圖9所示, RSD為1.05%.

Fig.8 Differential pulse voltammograms of the DNA modified electrodes without Cu2 +(a)and with Cu2 +(b) and after being immersed into 10 mmol/L Tris-HCl(pH=9.0) buffer solution containing excessive EDTA for 40 min(c)

Fig.9 Relative reduction current(I-I0) of Cu2+ for 4 times repetitive detections of DNA modified electrode

Fig.10 Reduction current of the DNA modified electrode after adding different metal ions orderly

向5 mL含有5 μmol/L Cu2+的電解液中依次加入常見的重金屬離子Ni2+, Cd2+, Hg2+和Pb2+溶液, 使各金屬離子的濃度分別為5 μmol/L. 在相同的實驗條件下檢測DPV響應(yīng)信號, 考察該電化學(xué)傳感器對銅離子檢測的選擇性, 結(jié)果如圖10所示. 每次檢測完后將修飾電極浸在含過量EDTA的Tris-HCl緩沖溶液(10 mmol/L, pH=9.0)中40 min以恢復(fù)電極活性. 在選定的電位窗口內(nèi), 依次加入干擾離子前后該電化學(xué)傳感器對銅離子的響應(yīng)信號變化很小, 而對加入的其它重金屬離子幾乎無響應(yīng), 表明該傳感器在選定的電位窗口內(nèi)對銅離子有良好的選擇性.

采用該電化學(xué)傳感器對模擬水樣進(jìn)行了檢測. 水樣采自陜西師范大學(xué)校內(nèi)人工湖, 經(jīng)預(yù)處理后檢測. 由于人工湖水中銅離子含量很低, 未能檢測到DPV響應(yīng)信號, 因此向處理過的水樣中加入含有銅離子的溶液, 使銅離子濃度達(dá)到5 μmol/L, 進(jìn)行回收率實驗, 結(jié)果如表2所示. 可見, 回收率處于合理范圍(70%～120%), 說明該傳感器對銅離子檢測的準(zhǔn)確性. 同時也說明采用該傳感器結(jié)合DPV電化學(xué)方法檢測實際樣品中的銅離子是可行的.

Table 2 Recovery analysis of Cu2+ in lake water samples

3 結(jié) 論

基于DNA分子中的堿基與銅離子的配位作用, 構(gòu)建了一種簡單、 快速測銅離子的電化學(xué)傳感器. 實驗結(jié)果表明, 該傳感器的檢測線性范圍較寬, 峰電流與銅離子的濃度在2.0×10-6～1.0×10-5mol/L和2.0×10-5～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系. 同時, 該傳感器對銅離子檢測的選擇性較好, 且電極經(jīng)處理后可循環(huán)使用, 這也為其它金屬離子的檢測提供了新的思路.

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(Ed.: N, K)

Detection of Copper Ion Based on the Interaction Between DNA Molecules and Copper Ions?

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21575085).

LI Min, KONG Huifang, GUO Zhihui*

(KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLifeScienceofShaanxiProvince,SchoolofChemistry&ChemicalEngineering,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710119,China)

Copper ion(Cu2+) is one of the essential trace elements of human, which plays an important role in life. However, excessive amounts of copper ions may cause serious damage to health. In this work, Cu2+ions were determined by differential pulse voltammetry(DPV) based on its concentration on DNA modified electrode due to the complexation of Cu2+ions with the base of DNA. Furthermore, because ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) shows stronger complexing ability to Cu2+ions than DNA, Cu2+concentrated on DNA modified electrode can be eluted with EDTA. Thus, the modified electrode was reusable. The results showed that under optimum conditions, the relative reduction current(I-I0) was linear with the concentration of copper ions in the range of 2.0×10-6—1.0×10-5mol/L and 2.0×10-5—1.0×10-4mol/L. The proposed electrochemical sensor for Cu2+ions was simple, stable and reusable.

DNA modified electrode; Electrochemical sensor; Differential pulse voltammetry; Copper ion

2016-02-28.

日期: 2016-06-15.

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 21575085)資助.

10.7503/cjcu20160116

O657.1

A

聯(lián)系人簡介: 郭志慧, 女, 博士, 副教授, 主要從事電化學(xué)研究. E-mail: zhguo@snnu.edu.cn