張正斌，蘇 潔，徐寶玲，于立明，邱光昊，董 苗，熊紅燕，梁宏亮，段維勛，辛渭川，金振曉

·基礎(chǔ)研究·

SIRT1介導(dǎo)VCP28抗1型糖尿病心肌缺血／再灌注損傷的研究

張正斌，蘇 潔，徐寶玲，于立明，邱光昊，董 苗，熊紅燕，梁宏亮，段維勛，辛渭川，金振曉

目的 研究腺苷A1受體部分型激動(dòng)劑VCP28對(duì)1型糖尿病大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法 建立1型糖尿病SD大鼠離體心臟缺血／再灌注模型，按照假手術(shù)組（Sham組）、單純?nèi)毖俟嘧⒔M（I／R組）和I／R＋VCP28（腺苷A1受體部分型激動(dòng)劑）組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（n＝8）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)描記采集左室壓（LVP），根據(jù)壓力波形分析左室發(fā)展壓（LVDP）和最大收縮／舒張速率（±dp／dtmax）；TTC染色法測(cè)定心肌梗死面積；Western Blot法檢測(cè)各組心肌SIRT1，Acfoxo1，Ac－p53及凋亡通路蛋白表達(dá)。結(jié)果 VCP28預(yù)處理可明顯改善糖尿病大鼠離體灌流心臟缺血／再灌注后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，降低心肌梗死面積，抑制凋亡信號(hào)通路，顯著提高SIRT1表達(dá)并下調(diào)Ac－foxo1及Ac－p53的水平（P＜0．01）。結(jié)論VCP28可明顯改善糖尿病大鼠離體灌注心臟缺血／再灌注后心功能指標(biāo)和心肌梗死面積，對(duì)糖尿病心肌損傷有明顯的保護(hù)作用；且SIRT1通路激活可能是VCP28抗糖尿病心肌缺血／再灌注損傷的重要機(jī)制。

糖尿??；VCP28；心肌缺血／再灌注；SIRT1；凋亡

并發(fā)癥發(fā)生與預(yù)后不良的主要原因［1］。腺苷是一種嘌呤類核苷，廣泛存在于機(jī)體組織細(xì)胞中，在多種生理和病理生理?xiàng)l件下釋放到細(xì)胞外，對(duì)損傷組織發(fā)揮保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)作用。腺苷已被證實(shí)具有心肌保護(hù)作用［2－3］和抗糖尿病作用［4］，但其在糖尿病心肌缺血／再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮的作用及機(jī)制尚不明確。為此，本研究采用大鼠離體心臟缺血／再灌注模型，觀察VCP28（腺苷A1受體部分型激動(dòng)劑）對(duì)糖尿病心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)，并初步探討其機(jī)制，為臨床糖尿病患者圍術(shù)期心肌保護(hù)提供新思路。

1 材料與方法

1．1 材料 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，質(zhì)量約180～220 g，普食喂養(yǎng)，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司），VCP28（美國(guó)

Sigma公司），氯化三苯氮四唑（TTC）檢測(cè)試劑（美國(guó)Sigma公司），SIRT1、Ac－foxo1、Ac－p53、Caspase－3、Bcl－2、Bax、β－actin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。

1．2 實(shí)驗(yàn)分組 雄性糖尿病SD大鼠組按照以下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)每組8例。假手術(shù)組（Sham組）：離體心臟不進(jìn)行缺血／再灌注操作；單純?nèi)毖俟嘧⒔M

（I／R組）：離體心臟停止灌注45 min，恢復(fù)Krebs－Henseleit緩沖液（KH液）灌注1 h，模擬缺血／再灌注過(guò)程。I／R＋VCP28組：缺血前10 min給予含有

VCP28（0．1 nmol／L）的KH液灌注（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

1．3 大鼠1型糖尿病模型的建立 大鼠禁食不禁

水12 h后，給予鏈脲估菌素（streptozocin，STZ）55 mg／kg單次腹腔注射，1周后及3個(gè)月后測(cè)定空腹血糖濃度均超過(guò)16．7 mmol／L，即可視為慢性1型糖尿病大鼠。

1．4 離體大鼠心臟灌流模型 大鼠在麻醉狀態(tài)下開(kāi)胸迅速取下心臟，經(jīng)主動(dòng)脈插管行Langendorff逆行灌流，灌流基礎(chǔ)液為KH液，灌注壓力為75 mm Hg。將帶有乳膠水囊的測(cè)壓管經(jīng)二尖瓣口插入左心室，連接壓力換能器，由MP100十六導(dǎo)生理記錄儀記錄和分析。調(diào)節(jié)水囊使左心室舒張末壓為5 mm Hg。據(jù)壓力波形可以分析左室發(fā)展壓（LVDP）、最大收縮／舒張速率（±dp／dtmax）等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。心臟跳動(dòng)穩(wěn)定后，停止灌注45min，模擬缺血過(guò)程，恢復(fù)KH液灌注1 h，模擬再灌注過(guò)程。

1．5 大鼠離體心臟灌流缺血／再灌注后心肌梗死面積測(cè)定 將整個(gè)心臟用磷酸緩沖液沖洗后置于－20℃冷卻10 min后，剪去心房，心室部分放入專門(mén)切片機(jī)，垂直于長(zhǎng)軸橫切成4～6塊1～2 mm厚的心肌片，自心底至心尖依次定為A片、B片、C片、D片、E片和F片，每片向心底的面定為a面，向心尖的面定為b面。將心肌片置于1%氯化三苯基四氮唑（2，3，5－Triphenyltetrazolium chloride，TTC）溶液中，37℃孵育15 min，有活性的心肌組織被染成磚紅色。非缺血區(qū)未被染色，缺血危險(xiǎn)區(qū)（area at risk，AAR）內(nèi)包括磚紅色的存活心肌及未被染色的灰白梗死組織。根據(jù)心肌厚片表面的二種顏色，用電腦圖像分析軟件（OPTIMAS 5．0）分別測(cè)定a、b兩面梗死區(qū)面積和缺血區(qū)面積占整片心肌切面的百分比。兩面的面積百分比平均后乘以該片心肌的重量得出該片心肌梗死區(qū)（infarct size，INF）重量和AAR重量。分別把各片INF重量和AAR重量總和后除以整個(gè)心臟重量，即得出整個(gè)心臟的INF、AAR以及INF與AAR之比（INF／AAR，%）。

1．6 Western Blot步驟 再灌注過(guò)程結(jié)束后，迅速取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后，剪取缺血區(qū)心肌標(biāo)本，液氮中速凍，置－80℃冰箱中保存待測(cè)。取缺血區(qū)心肌標(biāo)本，勻漿、離心后，取上清液分裝保存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，50 mol／L脫脂牛奶封閉，分別加SIRT1、Ac－foxo1、Ac－p53、Caspase－3、Bcl－2、Bax抗體，稀釋比均為1：500，4℃過(guò)夜，TBST洗脫3次，分別加1：5000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗脫3次，使用ECL－plus試劑盒發(fā)光，通過(guò)生化檢測(cè)系統(tǒng)成像并分析結(jié)果，以β－actin作為內(nèi)參照，檢測(cè)各蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2．1 雄性糖尿病SD大鼠離體心臟缺血／再灌注后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定 Sham組、I／R組和 I／R＋VCP28組在心臟再灌注結(jié)束后穩(wěn)定期數(shù)據(jù)顯示，I／R組心功能明顯下降，而與之相比，I／R＋VCP28組心功能明顯改善（圖2，P＜0．01）。

圖2 各組心功能比較

2．2 糖尿病大鼠離體灌流心臟缺血／再灌注后心肌梗死面積的測(cè)定 糖尿病大鼠離體灌流心臟全心缺血45 min后在再灌注1 h，與 I／R組相比，I／R＋VCP28組心肌梗死面積顯著下降（圖3，P＜0．01）。

圖3 各組心肌梗死面積比較

2．3 糖尿病大鼠離體灌流心臟缺血／再灌注后SIRT1等蛋白水平檢測(cè) 與假手術(shù)組相比，心肌缺血再灌注后SIRT1表達(dá)明顯下降，而Ac－foxo1及Ac－p53水平明顯上升，提示SIRT1脫乙?；饔妹黠@降低。同時(shí)，心肌凋亡通路被激活，導(dǎo)致心功能受損。而給予VCP28預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)上述作用，提示VCP28的心肌保護(hù)作用可能與激動(dòng)SIRT1信號(hào)，降低心肌凋亡水平有關(guān)（圖4）。

圖4 各組Notch1通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腺苷對(duì)心臟手術(shù)圍術(shù)期缺血／再灌注損傷具有明確的保護(hù)作用，Mahaffey等將腺苷用于急性心肌梗死患者救治過(guò)程，取得了良好的臨床效果［5］。筆者也首次證實(shí)腺苷預(yù)處理和腺苷后處理對(duì)心臟外科手術(shù)患者都具有心肌保護(hù)作用［6－7］，心肌保護(hù)液中外源性給予腺苷，可顯著改善心臟手術(shù)中心肌保護(hù)效果［8－10］。以往研究發(fā)現(xiàn)，腺苷通過(guò)激活A(yù)1和A2受體對(duì)心肌組織發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)［2］。腺苷A1受體激活，可以保護(hù)缺血心?。?1－12］，也可以抑制脂肪水解和降低血清游離脂肪酸含量，降低血糖水平［3－4］。但由于腺苷受體分布在所有組織的細(xì)胞膜上，生理效應(yīng)非常廣泛，不加限制的激活必然帶來(lái)很多副作用［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠使用非選擇性的腺苷受體激動(dòng)劑可激活A(yù)2b受體，加重糖代謝異常和胰島素抵抗［13］。另有研究證實(shí)，A1受體完全型激動(dòng)劑能激動(dòng)心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)細(xì)胞膜上A1受體，引起心動(dòng)過(guò)緩、房室傳導(dǎo)阻滯和負(fù)性傳導(dǎo)等心血管副作用［3］。因此，針對(duì)糖尿病患者心肌缺血／再灌注損傷，腺苷保護(hù)效果并不理想。腺苷A1受體部分型激動(dòng)劑在一定劑量范圍內(nèi)，對(duì)于不同組織具有特異性，副作用輕微，其中腺苷的化學(xué)衍生物VCP28，對(duì)腺苷A1受體具有高選擇性［14］，具有顯著的心肌保護(hù)效應(yīng)，而沒(méi)有明顯的心動(dòng)過(guò)緩和傳導(dǎo)阻滯等副作用［15］，因此，在心肌保護(hù)領(lǐng)域有良好的臨床應(yīng)用前景。但是腺苷A1受體部分型激動(dòng)劑對(duì)糖尿病患者心肌缺血／再灌注損傷是否有保護(hù)作用，尚未見(jiàn)研究報(bào)告。在本研究中，VCP28預(yù)處理不僅可以改善1型糖尿病大鼠缺血／再灌注后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，還可以降低糖尿病大鼠離體灌流心臟缺血／再灌注后心肌梗死面積，說(shuō)明VCP28對(duì)糖尿病心肌缺血／再灌注損傷有顯著的保護(hù)效果。

SIRT1廣泛存在于哺乳動(dòng)物各種組織細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，屬于Ⅲ型組蛋白脫乙酰酶。SIRT1通過(guò)對(duì)組蛋白和非組蛋白的去乙?；饔?，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡和代謝等多個(gè)過(guò)程［16］。在成年心肌細(xì)胞中，SIRT1主要分布在細(xì)胞漿中，被激活后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，使其底物蛋白脫乙?；?，進(jìn)而調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，降低細(xì)胞內(nèi)損傷性活性氧（reactive oxygen spices，ROS）的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)［17］。與腺苷A1受體一樣，SIRT1對(duì)于平衡糖尿病組織的代謝和心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)都具有重要的地位。SIRT1可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性［18］，顯著降低心臟缺血／再灌注后的心律失常發(fā)生率和心肌梗死面積［19］，SIRT1高表達(dá)小鼠心肌缺血／再灌注損傷顯著減輕，而且有研究表明缺血預(yù)處理心肌保護(hù)效應(yīng)的發(fā)揮也依賴于SIRT1活性的上調(diào)［20］。本實(shí)驗(yàn)中，VCP28預(yù)處理可明顯上調(diào)糖尿病大鼠心臟組織SIRT1表達(dá)，從而下調(diào)Ac－foxo1及Ac－p53水平，抑制凋亡信號(hào)通路，提示VCP28可能通過(guò)激動(dòng)腺苷A1受體，從而上調(diào)SIRT1發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上，腺苷A1受體部分型激動(dòng)劑VCP28可明顯改善糖尿病大鼠離體灌注心臟缺血／再灌注后心功能指標(biāo)和心肌梗死面積，對(duì)糖尿病心肌損傷有明顯的保護(hù)作用；且SIRT1通路激活可能是VCP28抗糖尿病心肌缺血／再灌注損傷的重要機(jī)制，VCP28作為新型心肌保護(hù)藥物，可能有廣泛地應(yīng)用前景。

［1］ Marx N．A commentary on Diabetic and non－diabetic patients with leftmain and／or three－vessel coronary artery disease：com?parison of outcomes with cardiac surgery and paclitaxel－eluting stents by Banning AP et al［J］．Diab Vasc Dis Res，2011，8（2）：173．

［2］ Mustafa SJ，Morrison RR，Teng B，et al．Adenosine receptors and the heart：role in regulation of coronary blood flow and cardi?ac electrophysiology［J］．Handb Exp Pharmacol，2009，（193）：161－188．

［3］ Albrecht－kupper BE，Leineweber K，Nell PG．Partial adenosine A1 receptor agonists for cardiovascular therapies［J］．Purinergic Signal，2012，8（Suppl 1）：91－9．

［4］ Dhalla AK，Shryock JC，Shreeniwas R，et al．Pharmacology and therapeutic applications of A1 adenosine receptor ligands［J］．Curr Top Med Chem，2003，3（4）：369－385．

［5］ Mahaffey KW，Puma JA，Barbagelata NA，et al．Adenosine as an adjunct to thrombolytic therapy for acutemyocardial infarction：results of a multicenter，randomized，placebo－controlled trial：the Acute Myocardial Infarction STudy of ADenosine（AMISTAD）trial［J］．JAm Coll Cardiol，1999，34（6）：1711－1720．

［6］ Jin Z，Duan W，Chen M，etal．Themyocardial protective effects of adenosine pretreatment in children undergoing cardiac surgery：a randomized controlled clinical trial［J］．Eur J Cardiothorac Surg，2011，39（5）：e90－96．

［7］ Jin ZX，Zhou JJ，Xin M，etal．Postconditioning the human heart with adenosine in heart valve replacement surgery［J］．Ann Tho?rac Surg，2007，83（6）：2066－2072．

［8］ Du L，Dian K，Chen HJ，et al．Synergistic myoprotection of L－arginine and adenosine in a caninemodel of globalmyocardial is?chaemic reperfusion injury［J］．Chin Med J（Engl），2007，120（22）：1975－1981．

［9］ Liu R，Xing J，Miao N，etal．Themyocardial protective effectof adenosine as an adjunct to intermittent blood cardioplegia during open heart surgery［J］．Eur JCardiothorac Surg，2009，36（6）：1018－1023．

［10］ 劉瑞芳，邢家林，龔慶成，等．腺苷在成人心臟外科手術(shù)中心肌保護(hù)作用的臨床觀察［J］．中國(guó)體外循環(huán)雜志，2007，03）：132－5．

［11］ Krieg T，Qin Q，Mcintosh EC，etal．ACh and adenosine activate PI3－kinase in rabbit hearts through transactivation of receptor tyrosine kinases［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283（6）：H2322－2330．

［12］ Germack R，Griffin M，Dickenson JM．Activation of protein ki?nase B by adenosine A1 and A3 receptors in newborn rat cardio?myocytes［J］．JMol Cell Cardiol，2004，37（5）：989－999．

［13］ Figler RA，Wang G，Srinivasan S，et al．Links between insulin resistance，adenosine A2B receptors，and inflammatory markers in mice and humans［J］．Diabetes，2011，60（2）：669－679．

［14］ Gregg A，Bottle SE，Devine SM，et al．Dual acting antioxidant A1 adenosine receptor agonists［J］．Bioorg Med Chem Lett，2007，17（19）：5437－5441．

［15］ Urmaliya VB，Pouton CW，Devine SM，etal．A novel highly se?lective adenosine A1 receptor agonist VCP28 reduces ischemia in?jury in a cardiac cell line and ischemia－reperfusion injury in iso?lated rat hearts at concentrations that do not affect heart rate［J］．JCardiovasc Pharmacol，2010，56（3）：282－292．

［16］ Maiese K，Chong ZZ，Shang YC，et al．Translating cell survival and cell longevity into treatmentstrategieswith SIRT1［J］．Rom J Morphol Embryol，2011，52（4）：1173－1185．

［17］ Sundaresan NR，Pillai VB，Gupta MP．Emerging roles of SIRT1 deacetylase in regulating cardiomyocyte survival and hypertrophy［J］．JMol Cell Cardiol，2011，51（4）：614－618．

［18］ Li Y，Xu S，Giles A，et al．Hepatic overexpression of SIRT1 in mice attenuates endoplasmic reticulum stress and insulin resist?ance in the liver［J］．FASEB J，2011，25（5）：1664－1679．

［19］ Huhn R，Heinen A，Weber NC，et al．Hyperglycaemia blocks sevoflurane－induced postconditioning in the ratheart in vivo：car?dioprotection can be restored by blocking the mitochondrial per?meability transition pore［J］．Br JAnaesth，2008，100（4）：465－471．

［20］ Nadtochiy SM，Yao H，Mcburney MW，et al．SIRT1－mediated acute cardioprotection［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，301（4）：H1506－1512．

VCP28 protects type 1 diabetic heart against m yocardial ischem ia／reperfusion injury：role of SIRT1

Zhang Zheng－bin，Su Jie，Xu Bao－ling，Yu Li－ming，Qiu Guang－h(huán)ao，Dong Miao，Xiong Hong－yan，Liang Hong－liang，Duan Wei－xun，Xin Wei－chuan，Jin Zhen－xiao
Fourth Military Medical University，Xi＇an，710032 Shanxi，China

Objective To investigate the protective effectof VCP28（adenosine A1 receptor partial agonist）onmyocardial is?chemia／reperfusion injury in diabetic rats and to explore its underlying mechanism．M ethods Langendorff perfusion of the isolated heartmodelwas established．Type 1 diabetic SD ratswere randomly assigned to the following groups（n＝8）：1）Sham group，2）I／R group and 3）I／R＋VCP28 group（VCP28，adenosine A1 receptor partial agonist；0．1 nmol／L，10min beforemyocardial ichemia）．Left ventricular pressure and left ventricular developed pressureweremeasured during thewhole period．After the reperfusion，themyo?cardial infarction was evaluated．Additionally，the expressions of SIRT1，Ac－foxo1，Ac－p53 and apoptotic related protein were also measured．Results VCP28 treatmentmarkedly improved the cardiac function and reduced myocardial infarction after the reperfusion period．In addition，VCP28 administration also up－regulated the expression of SIRT1 and down－regulated the expressions of Ac－foxo1 and Ac－p53，thus inhibiting the apoptotic signaling．Conclusion This study showed that VCP28 protected the heart againstMI／R in?jury by reducing apoptosis possibly through SIRT1 signaling pathway．

Diabetes，VCP28，Myocardial ischemia／reperfusion injury，SIRT1，apoptosis糖尿病是心血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因素和疾病預(yù)后不良的重要原因。心肌缺血／再灌注損傷導(dǎo)致的心臟功能不全是糖尿病患者心臟手術(shù)圍術(shù)期死亡、

2016?04?01）

2016?04?13）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．年．期．流水號(hào)

陜西省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（D65）；陜西省社會(huì)發(fā)展公關(guān)計(jì)劃（2015SF104）；陜西省國(guó)際科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目（2015KW－047）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81470415，81470411，81270170，81570330，81570231，81570230，81570232）；國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃課題（2011BAI11B20）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2013KTCL03－01）；陜西省自然科學(xué)基金（2014JM4106）；西京醫(yī)院學(xué)科助推計(jì)劃（XJZT14203）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅（張正斌、邱光昊、董 苗），第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科（蘇 潔、徐寶玲、于立明、梁宏亮、段維勛、金振曉）；710003西安，西安市中心醫(yī)院心胸外科（熊紅燕），心血管內(nèi)科（辛渭川）

金振曉，Email：13571921011＠163．com；辛渭川，Email：378611903＠qq．com