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(1.南華大學(xué)外科學(xué)總論教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.南華大學(xué)診斷學(xué)教研室；4.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；5.南華大學(xué)解剖學(xué)教研室；6.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體中心)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

神經(jīng)干細胞移植對頸上交感神經(jīng)節(jié)損毀兔MAP-2、GFAP表達的影響

王芳1，湯永紅2*，楊科3，王燦4，朱夢霞1，李彩5，郭東銘6

(1.南華大學(xué)外科學(xué)總論教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.南華大學(xué)診斷學(xué)教研室；4.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；5.南華大學(xué)解剖學(xué)教研室；6.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體中心)

目的研究神經(jīng)干細胞(NSCs)移植對頸上交感神經(jīng)節(jié)(SCSG)損毀兔膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)以及微管相關(guān)蛋白2(MAP2)表達的影響。方法32只新西蘭兔中8只為正常組不予處理，24只通過持針鉗持續(xù)壓榨兔SCSG 10 s的方法構(gòu)建SCSG損毀模型，均分成模型組、培養(yǎng)液組和干細胞組，造模后第7天分別給予等量的生理鹽水、培養(yǎng)液及2×106個神經(jīng)干細胞，移植后第1、7、10、14、21天分別記錄各組兔損傷側(cè)瞳孔直徑變化，第21天取損傷側(cè)SCSG進行HE染色，并進行免疫組化檢測MAP-2和GFAP的表達。結(jié)果瞳孔直徑變化情況，第10天、14天、21天干細胞組瞳孔直徑均大于模型組和培養(yǎng)液組，差異有顯著性(P<0.05)；HE染色，干細胞組較模型組和培養(yǎng)液組細胞排列整齊，大小形態(tài)較一致，細胞間質(zhì)增生少；免疫組化結(jié)果顯示，干細胞可增加MAP-2的表達，降低GFAP的表達。結(jié)論神經(jīng)干細胞通過促進兔損毀側(cè)SCSG內(nèi)MAP-2的表達，同時抑制GFAP的表達來發(fā)揮神經(jīng)功能的修復(fù)作用。

骨髓間充質(zhì)干細胞； 膠質(zhì)纖維酸性蛋白； 微管相關(guān)蛋白2； 頸上交感神經(jīng)節(jié)

神經(jīng)損傷分為中樞性和周圍性損傷，疾病預(yù)后較差，常留下程度不等的后遺癥，不僅對個人和家庭，甚至對社會都造成了巨大的壓力，嚴重的危害著人類健康。眾所周知，傳統(tǒng)觀念認為神經(jīng)損傷后不可再生，這就導(dǎo)致治療相當(dāng)困難，而近年來提出神經(jīng)干細胞的概念后，對傳統(tǒng)觀念造成了巨大的沖擊，也為神經(jīng)損傷的治療帶來了新的曙光。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其易獲取，免疫原性低等多項優(yōu)點被廣泛應(yīng)用[1]，但目前的研究報道多涉及干細胞移植干預(yù)相關(guān)模型，再采用形態(tài)學(xué)或者行為學(xué)評分來評估療效[2-5]，并未探討干細胞是否成功遷移至損傷部位，隨后能否存活并進行分化。因此本研究旨在神經(jīng)細胞標志物微管相關(guān)蛋白(MAP-2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)方面著手，通過骨髓源神經(jīng)干細胞移植治療SCSG損毀兔，不同時間點觀察兔瞳孔直徑恢復(fù)情況，觀察受損部位MAP-2和GFAP含量的變化，來探討NSCs修復(fù)神經(jīng)功能的可能作用及機制。

1 材料與方法

1.1動物與試劑健康成年的新西蘭雄性白兔32只，2 000～2 500 g，由南華大學(xué)實驗動物部提供；bFGF 、CNTF 購自美國Peprotech公司； CD34、CD44和CD54單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；MAP-2、GFAP抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動物模型制備暴露頸部皮膚后逐層分離出頸上交感神經(jīng)節(jié)，用直持針鉗壓榨交感神經(jīng)節(jié)約10 s，壓下一個齒，并且保持持針鉗長軸方向與交感神經(jīng)節(jié)長軸方向一致，神經(jīng)節(jié)與鉗頭完全咬合，從而保證頸上交感神經(jīng)節(jié)變形超過50%。

1.3模型成功標準模型兔出現(xiàn)Horner三聯(lián)征，瞳孔縮小、眼球凹陷、瞼裂變小。瞳孔直徑：可通過數(shù)碼相機拍攝，然后Image J軟件處理測得瞳孔直徑數(shù)據(jù)，隨后進行統(tǒng)計分析。對于模型判定瞼裂及眼球凹陷則采用直接圖片比較分析。

1.4動物分組將32只實驗兔均分為4組，每組8只。正常組：不予任何處理。模型組：造模成功后第7天注射1 mL生理鹽水；培養(yǎng)液組：造模成功后第7天注射1 mL培養(yǎng)液；干細胞組：造模成功后第7天注射1 mL含2×106個神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)液。

1.5細胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定提取的兔骨髓細胞，經(jīng)全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法培養(yǎng)3～5代后，進行細胞表型鑒定，CD34陰性，CD44及CD54陽性提示細胞為BMSCs。采用Nestin單克隆抗體鑒定，經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)，CNTF誘導(dǎo)后BMSCs分化為神經(jīng)干細胞。

1.6 HE染色移植后第21天處死兔，取頸上交感神經(jīng)節(jié)置入甲醛中固定24 h后石蠟包埋，4 μm切片，切片常規(guī)用二甲苯脫蠟；經(jīng)各級乙醇脫水；蒸餾水水洗2 min；蘇木素染色5 min；自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s；自來水浸泡15 min；置伊紅液2 min；常規(guī)脫水，透明，樹膠封片，鏡檢。

1.7 MAP-2及GFAP免疫組化染色具體操作按照免疫組化試劑盒說明書進行，石蠟切片70 ℃烤片10 min；二甲苯ⅠⅡ各30 min；再按無水乙醇到75%乙醇中逐級脫水；去離子水5 min；檸檬酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)15 min；PBS每次5 min，洗3次；過氧化氫15 min；再次PBS洗3次；血清封閉1 h；去除血清，加一抗4 ℃孵育過夜；PBS洗3次每次5 min； 二抗37 ℃孵育30 min；PBS洗3次每次5 min；DAB顯色,蘇木素復(fù)染，樹膠封片，鏡檢。

1.8圖像分析和統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計分析和繪制采用Graphpad Prism軟件，運用單因素方差分析以及LSD組間比較法，數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差表示，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1兔瞳孔測量結(jié)果模型組與培養(yǎng)液組比較，各個時間點瞳孔直徑差異均無顯著性(P>0.05)；干細胞組分別與模型組和培養(yǎng)液組對比，移植后第1天、7天差異不明顯(P>0.05)，第10天、14天、21天干細胞組瞳孔直徑均大于模型組和培養(yǎng)液組(P<0.05)；干細胞組與正常組比較，細胞移植后第1天、7天、10天干細胞組瞳孔直徑均小于正常組(P<0.05)，第14天、21天差異不明顯(P>0.05)(表1)。

2.2 HE染色結(jié)果切片制成后，進行HE染色，觀察神經(jīng)節(jié)內(nèi)病理組織學(xué)改變，正常組與干細胞組可見細胞大小形態(tài)基本一致，分布均勻，排列整齊、緊密，少量間質(zhì)增生，新生血管豐富，未見明顯核固縮。模型組與培養(yǎng)液組可見細胞大小各異，分布不均，排列紊亂，可見炎性細胞浸潤，細胞間質(zhì)增生明顯，可見核固縮(圖1)。

2.3 MAP-2、GFAP免疫組化結(jié)果MAP-2和GFAP主要存在于胞漿中，若陽性表達則胞漿著棕黃色，著藍紫色表示陰性表達。MAP-2、GFAP免疫組化結(jié)果表明(見圖2、圖3)，干細胞組和正常組MAP-2呈陽性表達，GFAP呈陰性表達；模型組和培養(yǎng)液組MAP-2呈陰性表達，GFAP呈陽性表達，差異有顯著性(P<0.05)。

表1不同時間點各組瞳孔測量數(shù)據(jù)(mm)

組別n第1天第7天第10天第14天第21天正常組87．92+0．388．02+0．308．13+0．377．96+0．368．12+0．25模型組85．82+0．42a5．84+0．34a5．68+0．29a5．91+0．31a5．80+0．36a培養(yǎng)液組85．85+0．32a5．75+0．32a5．64+0．37a5．84+0．27a5．59+0．23a干細胞組85．64+0．33a5．72+0．35a6．79+0．33abc7．98+0．28bc8．06+0．21bc

與正常組比較，a:P<0.05；與模型組比較，b:P<0.05；與培養(yǎng)液組比較，c:P<0.05

圖1 HE染色觀察各組神經(jīng)節(jié)內(nèi)病理學(xué)變化(400×) A:正常組；B:模型組；C:培養(yǎng)液組；D:干細胞組

圖3 GFAP免疫組化結(jié)果(400×) A:正常組；B:模型組；C:培養(yǎng)液組；D:干細胞

3 討 論

MAP-2作為神經(jīng)元細胞骨架的重要組成部分，在神經(jīng)系統(tǒng)形成、發(fā)育以及再生過程中扮演著重要角色，參與神經(jīng)纖維的信號傳導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運等過程，所以MAP-2既是一種結(jié)構(gòu)蛋白又是一種功能蛋白，可以作為神經(jīng)元特有標志物來反應(yīng)神經(jīng)細胞的損害程度，MAP-2含量的多少可以作為一個判定標準判斷神經(jīng)細胞是否死亡。相關(guān)神經(jīng)生物學(xué)研究證實病人脊髓發(fā)生損傷后其損傷區(qū)MAP-2含量是顯著下降的[6]。MAP-2作為一種功能蛋白有助于神經(jīng)細胞缺血急性期耐受缺氧環(huán)境，但隨著時間推移，缺血缺氧的持續(xù)導(dǎo)致神經(jīng)元大量死亡，MAP-2的含量也隨之下降[7-8]，并且從缺血中心區(qū)逐漸向缺血半暗帶延續(xù)[9]，所以MAP-2被認定是神經(jīng)元缺血的敏感指標。同樣GFAP參與膠質(zhì)細胞的骨架構(gòu)成并維持其張力強度[10]，為星型膠質(zhì)細胞的標志性蛋白，僅在成熟的膠質(zhì)細胞表達。GFAP可以調(diào)節(jié)細胞的代謝，分泌相關(guān)營養(yǎng)因子參與信號傳導(dǎo)等[11-12]。在正常腦組織中，GFAP免疫組化檢測多為陰性，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細胞快速反應(yīng)，其標志之一就是GFAP的表達[13]，所以可將GFAP的表達作為星形膠質(zhì)細胞活動的標志之一，判斷急性期神經(jīng)的損傷。神經(jīng)損傷后，星型膠質(zhì)細胞最開始反應(yīng)性增生，早期的增生具有保護作用，但是膠質(zhì)細胞過度的增生則容易形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)元纖維活動聯(lián)結(jié)[14]。

本實驗中模型組和培養(yǎng)液組兔SCSG在細胞移植后第21天MAP-2表達呈陰性，GFAP表達呈陽性，且兩組MAP-2表達明顯低于正常組，而GFAP表達高于正常組，由此可知兔頸上交感神經(jīng)節(jié)損毀后神經(jīng)元標志性蛋白MAP-2表達量是下調(diào)的，星型膠質(zhì)細胞的標志性蛋白GFAP表達是增加的。而干細胞組移植后第21天MAP-2表達呈陽性，與正常組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但明顯高于模型組與培養(yǎng)液組，由此可認為干細胞移植能促進神經(jīng)節(jié)內(nèi)MAP-2的分泌。而干細胞組GFAP表達呈陰性，明顯低于模型組與培養(yǎng)液組，可推測神經(jīng)干細胞抑制了膠原纖維的過度增生，下調(diào)了GFAP的表達。綜上所述，本研究認為兔SCSG損毀導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，神經(jīng)功能障礙，進而導(dǎo)致MAP-2下降，GFAP表達上調(diào)，從而引起神經(jīng)功能障礙，阻礙了神經(jīng)功能的恢復(fù)。而神經(jīng)干細胞移植后，MAP-2表達增加，GFAP表達下降，抑制了膠質(zhì)細胞的增生，促進了神經(jīng)功能的恢復(fù)，說明MAP-2在神經(jīng)功能修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，但在本實驗中，MAP-2作為神經(jīng)元的敏感指標，細胞干預(yù)組兔瞳孔直徑在細胞移植后10～14天即有明顯恢復(fù)，由于只研究了細胞移植后21天MAP-2的值，MAP-2的增高與神經(jīng)功能的恢復(fù)的先后順序未知，本課題組將繼續(xù)深入探討在這一修復(fù)過程中MAP-2的變化情況。另外神經(jīng)細胞損傷后伴隨著膠質(zhì)增生，且GFAP表達上調(diào)，早期適度增生是有利于神經(jīng)功能恢復(fù)的，但是后期過度增生導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)元的再生，由此可知需要評估最佳移植時間點以便達到最好的移植效果，這也將是本課題組以后研究的重點。

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TheEffectofNSCsTransplantationontheExpressionofMAP-2andGFAPinRabbitswithLesionofSuperiorCervicalSympatheticGanglion

WANG Fang,TANG Yonghong,YANG Ke,et al
(DepartmentofOperativeSurgery，UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001，China)

ObjectiveThis study was to investigate the effects of Neural stem cells transplantation on the expression of MAP2 and GFAP for treatment in superior cervical sympathetic ganglion injury in rabbits.Methods8 of the 32 New Zealand rabbits were recruited in normal group and no intervention was made,24 SCSG damage models were constructed by the method of continuous pressing of rabbit’s SCSG for 10 seconds,which were divided into model group,culture-medium group and stem cells group,the same amount of normal saline,culture media and 2*106neural stem cells were given seven days after modeling.The changes of pupil diameter in four groups were observed and recorded 1,7,10,14,21 days after transplantation.HE staining was performed and the expression of MAP-2 and GFAP were detected by immunohistochemistry on the twenty-first day.ResultsThe changes of pupil diameter in injured side of rabbits in stem cells group,compared with model group and culture-medium group,were statistically significant on days of 10,14,and 21 (P<0.05).Compared with model group and culture-medium group,cells in the stem cells group were arranged in order,size and shape were uniform,and have a small amount of interstitial cell hyperplasia.Immunohistochemistry results showed that stem cells could increase the expression of MAP-2 and decrease the expression of GFAP.ConclusionNeural stem cells transplantation is able to repair the nerve function of the damaged SCSG in rabbits,and its mechanism may be related to promoting the expression of MAP-2 and inhibiting the expression of GFAP.

bone marrow mesenchymal stem cells； GFAP ； MAP-2； SCSG

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.010

2016-03-03；

2016-06-28

湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(2013SCX17) 及衡陽市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃項目(2015KJ21).

*通訊作者，E-mail:tang6246@tom.com.

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蔣湘蓮)