蘇 文 李虹偉 陳 暉劉慧榮 黃海霞 李衛(wèi)萍*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心血管中心，北京 100050；2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

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· 心血管疾病的病理生理機(jī)制 ·

糖基化終末產(chǎn)物損傷冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道

蘇 文1李虹偉1陳 暉1劉慧榮2黃海霞2李衛(wèi)萍1*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心血管中心，北京 100050；2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

目的 研究糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)對大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞電壓門控性鉀離子(voltage-gated K+, Kv)通道電流的影響。方法 分離大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞，分為空白對照組、糖基化牛血清白蛋白(AGE-bull serum albumin，AGE-BSA)組、AGE-BSA+抗AGE受體抗體(anti-receptor of AGEs immunoglobulin G，anti-RAGE IgG)組進(jìn)行干預(yù)。采用膜片鉗技術(shù)檢測各組細(xì)胞Kv通道電流，采用Western blotting、實(shí)時熒光定量PCR方法檢測各組細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果 AGE-BSA直接干預(yù)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞明顯抑制了平滑肌細(xì)胞的Kv電流達(dá)32.7%，并使Kv1.2和Kv1.5通道蛋白及mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。而給予anti-RAGE IgG預(yù)處理30 min后再加入AGE-BSA刺激，平滑肌細(xì)胞的Kv電流密度及Kv1.2和Kv1.5通道蛋白及mRNA的表達(dá)與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 AGEs通過結(jié)合RAGE損傷冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道。

糖基化終末產(chǎn)物；電壓門控性鉀離子通道；冠狀動脈平滑肌細(xì)胞；糖基化終末產(chǎn)物受體

血管平滑肌細(xì)胞電壓門控性鉀離子(voltage-gated K+, Kv)通道，特別是Kv1.2和Kv1.5通道在冠狀動脈微循環(huán)及冠狀動脈舒張中起著關(guān)鍵作用[1-2]。本課題組的前期研究[3]表明高糖刺激可抑制大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的Kv電流，從而減弱Kv通道介導(dǎo)的冠狀動脈舒張功能。而高糖引起的冠狀動脈舒張功能減退，是糖尿病繼發(fā)冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)，探討其機(jī)制可能為臨床上防治糖尿病心血管合并癥提供新的治療靶點(diǎn)。

糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycations end products，AGEs)由還原糖如葡萄糖等的羰基(醛基或酮基)與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的游離氨基端，通過非酶糖基化作用形成。正常情況下，人體內(nèi)AGEs量很低，但當(dāng)機(jī)體處于高血糖狀態(tài)會促使糖化進(jìn)程加快，導(dǎo)致AGEs生成明顯增加。AGEs與其受體(receptor of AGEs，RAGE)結(jié)合后可以激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路[4-6]，繼而損傷細(xì)胞、組織的功能。目前，有研究[7-8]認(rèn)為糖尿病心血管合并癥最重要的影響因素是AGEs，本研究旨在探討AGEs對大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠18只(6～8周齡)，體質(zhì)量(200±20) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK(京)2012-0024。

1.2 主要試劑

木瓜蛋白酶及牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA;美國Genview公司)，二硫赤蘚糖醇及Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)，大豆胰酶抑制劑(美國Amresco公司)，糖基化牛血清白蛋白(AGE-bull serum albumin，AGE-BSA，德國Merck公司)，Anti-RAGE IgG(美國R&D公司)，DMEM(美國Hyclone公司)，胎牛血清及0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶(美國Gibco公司)，4-氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP;美國Sigma公司)，Kv1.2抗體、Kv1.5抗體及β-actin抗體(美國Abcam公司)。

電極內(nèi)液成分：KCl 140.0 mmol/L、MgCl21.0 mmol/L、Na2ATP 1.0 mmol/L、EGTA 0.1 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L(用KOH調(diào)pH值為7.2)。電極外液成分：NaCl 135.0 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgCl21.0 mmol/L、CaCl22.0 mmol/L、HEPES 5.0 mmol/L、D-Glucose 5.5 mmol/L(用NaOH調(diào)pH值為7.4)。

1.3 主要儀器

膜片鉗放大器(EPC-10,德國HEKA公司)，三維操縱儀(MP-285,美國 Sutter 公司)，電極拉制儀(PB-7,日本Narishige公司)，數(shù)據(jù)采集軟件(Pulse8. 8,德國HEKA公司)，Western blotting電泳儀及附件(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀(中國杭州博日科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1)分離大鼠直徑150～200 μm的冠狀動脈： 采用酶消化法分離冠狀動脈平滑肌細(xì)胞，置于5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及干預(yù)，膜片鉗實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為原代細(xì)胞，Western blotting及實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為2代細(xì)胞，冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法同既往參考文獻(xiàn)[9]。

2)實(shí)驗(yàn)分組：①空白對照組：培養(yǎng)液中含100 μg/mL BSA；②AGEs組：培養(yǎng)液中含100 μg/mL AGE-BSA；③AGEs+anti-RAGE組：培養(yǎng)液中含100 μg/mL AGE-BSA、100 μg/mL anti-RAGE IgG。各組冠狀動脈平滑肌細(xì)胞用相應(yīng)培養(yǎng)液孵育48 h。AGEs+anti-RAGE組在加入AGE-BSA前用anti-RAGE IgG預(yù)孵育30 min。藥物濃度參考既往文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道。

3)膜片鉗技術(shù)測定全細(xì)胞Kv電流密度：選用胞膜完整、有立體感，折光性好，胞體呈梭形的細(xì)胞進(jìn)行記錄。實(shí)驗(yàn)在22 ℃～24 ℃下進(jìn)行。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄模式，高阻封接成功后封接電阻為1 GΩ以上，采用負(fù)壓吸引方式破膜，破膜后電阻500～600 MΩ，穩(wěn)定5 min，記錄電流，為了排除BKCa和KATP電流的影響，電極外液中加入100 nmol/L的iberiotoxin和1 μmol/L的glibenclamide。

4)Kv1.2、Kv1.5通道蛋白和mRNA的檢測：采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞Kv1.2、Kv1.5通道蛋白的表達(dá)，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞Kv1.2、Kv1.5通道m(xù)RNA的表達(dá)，引物序列如下：Kv1.2 F：5′-CATTTTGTACTACTACCAGTC-3′，Kv1.2 R：5′-GGAGTGTCTGGACAACTTGA-3′， Kv1.5 F：5′-TGAGCAGGAGGGGAATCAGA-3′，Kv1.5 R：5′-ACACCCTTACCAAGCGG ATG-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AGEs引起冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道電流受損

AGE-BSA干預(yù)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞48 h后，采用膜片鉗技術(shù)檢測全細(xì)胞鉀電流，圖1A所示為各組細(xì)胞在加入4-AP干預(yù)前及干預(yù)后，將細(xì)胞膜電位鉗制在-60 mV，之后給予-60～+60 mV、時長400 ms 的系列去極化刺激，階躍為10 mV，所激發(fā)的鉀電流，而4-AP敏感的鉀電流部分為Kv電流，比例尺縱軸代表電流幅度200 pA，橫軸代表時長100 ms。為排除細(xì)胞大小對實(shí)驗(yàn)的影響，對6個細(xì)胞的Kv電流統(tǒng)計(jì)后做電壓-電流曲線，發(fā)現(xiàn)當(dāng)測試電壓高于10 mV后，AGE-BSA使單位面積上電流幅度下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1B所示，AGEs組最大Kv電流密度為(13.5 ± 0.4)pA/pF，較空白對照組(20.0 ± 0.5)pA/pF降低32.7%。

Fig.1 Effect of advanced glycation products (AGEs) and anti-receptor of advanced glycation products (anti-RAGE) on Kvcurrents in coronary vascular smooth muscle cells(VSMCs)

A： sample traces of whole cell K+currents recorded before and after incubation with 4-AP；B： I-V relationships of Kv current density in VSMCs； 4-AP:4-aminopyridine; Kv: voltage-gated K+;n=6；*P<0.05vscontrol.

2.2 AGEs下調(diào)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道的表達(dá)

3組細(xì)胞間比較，Kv1.2和Kv1.5通道蛋白及mRNA的表達(dá)總體上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行兩兩比較，如圖2所示，在蛋白水平上，AGE-BSA顯著下調(diào)了平滑肌細(xì)胞上Kv1.2和Kv1.5通道的表達(dá)，以Kv1.5的變化更為明顯。Kv1.2通道蛋白相對吸光度值為(0.22±0.01)vs(0.27 ± 0.01)(AGEs組vs對照組，P<0.05)，Kv1.5通道蛋白相對吸光度值為(0.22 ± 0.01)vs(0.33 ± 0.01)(AGEs組vs對照組，P<0.05)。在mRNA水平上，AGE-BSA干預(yù)影響Kv1.2和Kv1.5通道表達(dá)的變化趨勢與蛋白水平一致，Kv1.2通道m(xù)RNA相對吸光度值為(0.75 ± 0.04)vs(1.00 ± 0.05)(AGEs組vs對照組，P<0.05)，Kv1.5通道m(xù)RNA相對吸光度值為(0.52 ± 0.03)vs(1.00 ± 0.05)(AGEs組vs對照組，P<0.05)，如圖3。

2.3 AGEs通過結(jié)合RAGE損傷冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道

在加入AGE-BSA干預(yù)前，先給予細(xì)胞anti-RAGE IgG預(yù)處理30 min以阻斷AGEs/RAGE途徑，發(fā)現(xiàn)anti-RAGE IgG預(yù)處理使AGE-BSA對Kv通道功能及結(jié)構(gòu)的損傷作用均被抑制，AGEs+anti-RAGE組細(xì)胞的最大Kv電流密度、Kv1.2和Kv1.5通道蛋白及mRNA表達(dá)與空白對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、2、3)。

圖2 糖基化終末產(chǎn)物及抗糖基化終末產(chǎn)物受體抗體對冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達(dá)的影響

Fig.2 Effect of advanced glycation products (AGEs) and anti-receptor of advanced glycation products (anti-RAGE) on protein expression of Kv1.2 and Kv1.5 in coronary vascular smooth muscle cells

A：immubobands of Kv1.2 and Kv1.5 channels； B： protein expression of Kv1.2 and Kv1.5 was evaluated by Western blotting analysis; Kv: voltage-gated K+; *P<0.05vscontrol.

圖3 糖基化終末產(chǎn)物及抗糖基化終末產(chǎn)物受體抗體對冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5通道m(xù)RNA表達(dá)的影響

Fig.3 Effect of advanced glycation products (AGEs) and anti-receptor of advanced glycation products (anti-RAGE)on mRNA expression of Kv1.2 and Kv1.5 in coronary vascular smooth muscle cells Kv: voltage-gated K+;*P<0.05vscontrol.

3 討論

近年來研究[1-2, 12]顯示，Kv通道對于維持血管平滑肌細(xì)胞靜息電位、調(diào)節(jié)血管張力具有重要作用，而在糖尿病等病理狀態(tài)下，Kv通道將受到損傷[1, 13]，進(jìn)而損傷血管張力，影響到血管舒張功能。糖尿病患者體內(nèi)增加的AGEs是冠狀動脈病變的重要危險(xiǎn)因素，AGEs對血管舒張功能的損傷作用既往多有報(bào)道[14-15]，本研究顯示AGEs損傷血管平滑肌細(xì)胞Kv通道，可以從一定程度上解釋AGEs對血管舒張功能的損傷作用，同時亦可解釋高糖抑制冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv電流進(jìn)而減弱冠狀動脈舒張功能的機(jī)制[3]。

在本研究中，AGEs下調(diào)了冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白及mRNA的表達(dá)，而前期研究[3]結(jié)果顯示高糖增加Kv1.2通道的硝基化，但未減少Kv1.2和Kv1.5的蛋白表達(dá)，兩者有一定差別，原因可能在于研究方法的不同，本研究將分離出的冠狀動脈平滑肌細(xì)胞在AGEs中孵育48 h，前期研究是將分離出的小冠狀動脈在高糖中孵育24 h再分離出冠狀動脈平滑肌細(xì)胞觀察高糖對Kv通道的影響，不同培養(yǎng)條件下高糖及其產(chǎn)物對平滑肌細(xì)胞的作用強(qiáng)度和時間有一定差別，因此可能產(chǎn)生不同結(jié)果。但是高糖對冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道的損傷作用是確定的，AGEs在其中起到了重要的媒介作用。

本研究中，AGEs干預(yù)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞48 h，觀察到Kv通道電流以及通道蛋白表達(dá)的變化，但并不意味著AGEs的增加在短期內(nèi)可使糖尿病患者冠狀動脈功能明顯受損或冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成。Kv通道的損傷主要影響冠狀動脈的舒張功能[1]，而冠狀動脈舒張功能受損僅是糖尿病繼發(fā)冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的一個環(huán)節(jié)。而且，體外研究無法將機(jī)體本身復(fù)雜的病理生理機(jī)制和代償功能完全體現(xiàn)。因此，從AGEs引起Kv通道損傷到臨床上2型糖尿病患者發(fā)生心血管事件仍需要數(shù)年的時間，這段時間的長短亦將受到患者的個體差異及血壓、血脂等很多因素的影響。

AGEs對血管的作用機(jī)制包括直接作用和與受體RAGE結(jié)合產(chǎn)生的間接作用。AGEs可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，如細(xì)胞內(nèi)蛋白的修飾、細(xì)胞外基質(zhì)的交聯(lián)等。AGE的特異性受體包括RAGE、巨噬細(xì)胞表面清道夫Ⅰ型和Ⅱ型受體、半乳糖凝集素-3等，其中RAGE最重要。RAGE是一種屬于免疫球蛋白超家族的多配基受體，主要存在于平滑肌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面，其啟動子含兩個核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)功能位點(diǎn)。既往研究[14]結(jié)果表明糖尿病患者的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損與AGEs/RAGE增高相關(guān)。在本研究中，筆者用anti-RAGE IgG干預(yù)阻斷AGEs/RAGE途徑，結(jié)果顯示AGEs對冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道的損傷被很大程度地阻斷，因此可以推測AGEs損傷冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道的過程主要通過結(jié)合受體RAGE途徑來進(jìn)行。AGEs/RAGE途徑在糖尿病血管病變過程中扮演了重要角色[16-17]，眾多研究[4-6]顯示，AGEs與RAGE結(jié)合后，可以激活一系列的細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括p21ras、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及NF-κB等，進(jìn)而激活氧化應(yīng)激。而氧化應(yīng)激在多種組織中被證明能夠下調(diào)鉀通道的蛋白和mRNA表達(dá)[18-21]。在本課題組前期研究[3]中亦顯示，一氧化氮發(fā)生過氧化反應(yīng)所形成的過氧化亞硝酸陰離子能通過使Kv通道蛋白發(fā)生硝基化進(jìn)而引起Kv通道功能明顯受損。這些研究結(jié)果表明AGEs/RAGE通路誘導(dǎo)的氧化負(fù)荷增加可能是高糖損傷冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，AGEs通過結(jié)合RAGE導(dǎo)致冠狀動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道功能受損。由于Kv通道在冠狀動脈舒張功能的調(diào)節(jié)中至關(guān)重要，干預(yù)AGEs的生成或阻斷其作用途徑可能會成為保護(hù)糖尿病患者Kv通道介導(dǎo)的冠狀動脈舒張功能的新靶點(diǎn)。

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編輯 孫超淵

Advanced glycation end products impair voltage-gated K+channels in coronary vascular smooth muscle cells

Su Wen1，Li Hongwei1，Chen Hui1，Liu Huirong2，Huang Haixia2，Li Weiping1*

(1.DepartmentofCardiology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China; 2.DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective To investigate the role of advanced glycation end products (AGEs) in impairment of voltage-gated K+(Kv) channels in rat coronary vascular smooth muscle cells (VSMCs). Methods We isolated rat coronary VSMCs. The cells were incubated either in control medium, or medium with 100 μg/mL AGE-bovine serum albumin (AGE-BSA), or medium with 100 μg/mL AGE-BSA plus 100 μg/mL anti-receptor of AGEs immunoglobulin G (anti-RAGE IgG). Patch-clamp recording was used to assess the Kvcurrents. Western blotting and quantitative real-time PCR techniques were used to assess protein and mRNA expression of Kv1.2 and Kv1.5. Results Incubation of VSMCs with AGE-BSA reduced Kvcurrent density by 32.7% and decreased both protein and mRNA expression of Kv1.2 and Kv1.5 channels, whereas blocking AGE-BSA interacting with their receptors by preincubation with anti-RAGE IgG for 30 minutes prevented AGE-BSA-induced impairment of Kvchannels.Conclusion AGEs impair Kvchannels in coronary VSMCs by interacting with RAGE.

advanced glycation end products; voltage-gated K+channels; coronary vascular smooth muscle cells; receptor of advanced glycation end products

國家自然科學(xué)基金(30971240)，北京市自然科學(xué)基金(7122053)，北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才資助項(xiàng)目(2013-3-060)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(30971240)， Natural Science Foundation of Beijing (7122053)，High-level Technical Talents Foundation in Beijing Health System (2013-3-060).

時間：2016-12-14 20∶19

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2019.030.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.002]

R 36

2016-10-03)

*Corresponding author， E-mail：xueer09@163.com