陳兆桂 于成功

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院消化科2

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·論 著·

Faecalibacteriumprausnitzii對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響*

陳兆桂1#于成功1,2&

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院消化科2

背景：Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)是一種腸道共生菌，其數(shù)量減少是炎癥性腸病(IBD)患者腸道菌群紊亂的重要特征之一。既往研究顯示Fp上清液在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中具有明顯的抗炎效應(yīng)。目的：探討Fp上清液在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的抗炎效應(yīng)是否與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。方法：24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組和Fp上清治療組。通過(guò)予小鼠連續(xù)5 d飲用3.5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立急性結(jié)腸炎模型，觀察小鼠體質(zhì)量和結(jié)腸組織病理學(xué)變化，分別以real-time PCR和免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織TLR4 mRNA和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，結(jié)腸炎模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降，結(jié)腸縮短，結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分、TLR4 mRNA和p-NF-κB p65表達(dá)以及血清TNF-α、IL-6、COX-2水平均顯著升高(P<0.05)。Fp上清治療組上述指標(biāo)均較結(jié)腸炎模型組顯著改善(P<0.05)，其中血清炎癥因子水平與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：Fp上清液通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活及其下游炎癥因子表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

Faecalibacteriumprausnitzii； 結(jié)腸炎； Toll樣受體4； NF-κB； 腫瘤壞死因子α； 白細(xì)胞介素6； 環(huán)氧合酶2

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種在全球范圍內(nèi)廣為流行的慢性腸道炎癥性疾病，其發(fā)病與免疫、環(huán)境、遺傳等多種因素有關(guān)，近年來(lái)腸道菌群紊亂在IBD發(fā)病中的作用受到廣泛關(guān)注。Faecalibacteriumprausnitzii(F.prausnitzii, Fp)是一種腸道共生菌，主要定植于末端回腸和回盲部，參與維持腸道健康并為腸道細(xì)胞提供能量，F(xiàn)p數(shù)量異常是IBD患者腸道菌群紊亂的重要特征之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者腸道內(nèi)Fp數(shù)量的恢復(fù)有利于維持臨床緩解，而復(fù)發(fā)者Fp數(shù)量相對(duì)較低[2]；CD患者中，F(xiàn)p數(shù)量減少與高術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[3]。既往研究[3-4]顯示，F(xiàn)p上清液在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中具有明顯的抗炎效應(yīng)，其機(jī)制可能與上調(diào)外周血和脾臟中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)以及阻斷NF-κB炎癥信號(hào)通路激活、抑制促炎細(xì)胞因子分泌有關(guān)。腸道炎癥信號(hào)通路復(fù)雜多樣，NF-κB是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)則是NF-κB信號(hào)的上游分子之一[5]。為此，本實(shí)驗(yàn)從TLR4/NF-κB信號(hào)通路角度入手，探討Fp上清液在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的抗炎機(jī)制，以期為IBD的治療提供新策略。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株和主要試劑

雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量18～22 g，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；Fp(ATCC 27766，美國(guó)模式菌種保藏中心)。高 純度葡聚糖硫酸鈉(DSS)(MP Biomedicals, LLC)；RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；兔抗小鼠磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)ELISA試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

二、方法

1.Fp上清液制備：Fp活菌凍干粉解凍，接種至改良培養(yǎng)基，37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期細(xì)菌培養(yǎng)液，離心，收集上清液凍干，100 mL上清液約可得到3.5 g 凍干粉，分裝后-80 ℃保存。使用前每3.5 g凍干粉溶解于20 mL蒸餾水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.結(jié)腸炎模型建立和動(dòng)物分組干預(yù)：24只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組和Fp上清治療組，每組8只，稱重并編號(hào)。實(shí)驗(yàn)第1～5 d，結(jié)腸炎模型組和Fp上清治療組小鼠自由飲用含 3.5% DSS的蒸餾水以建立急性結(jié)腸炎模型，正常對(duì)照組小鼠自由飲用蒸餾水；Fp上清治療組小鼠實(shí)驗(yàn)第1～8 d每天予0.1 mL/mg Fp上清液灌胃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食、飲水、排便情況和體質(zhì)量變化。實(shí)驗(yàn)第8 d，各組小鼠摘眼球取血，離心取上清液，-80 ℃保存，用于ELISA檢測(cè)；斷頸處死小鼠，剖腹取全結(jié)腸，測(cè)量并記錄結(jié)腸長(zhǎng)度，留取結(jié)腸組織(去除回盲部后的前半段結(jié)腸)，用于HE染色、免疫組化染色和real-time PCR。

3.組織病理學(xué)檢查：結(jié)腸組織4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法行組織病理學(xué)評(píng)分[6]。0分：無(wú)炎癥證據(jù)；1分：低度炎癥，伴散在的單核細(xì)胞浸潤(rùn)(1～2個(gè)浸潤(rùn)灶)；2分：中等程度炎癥，伴多個(gè)浸潤(rùn)灶；3分：高度炎癥，血管密度增高，結(jié)腸壁增厚；4分：最高度炎癥，透壁性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞減少。

4. Real-time PCR：取結(jié)腸組織，以RNAiso Plus試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行real-time PCR擴(kuò)增，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR引物序列：TLR4 F 5’-CAA GAA CAT AGA TCT GAG CTT CAA CCC-3’, R 5’-GCT GTC CAA TAG GGA AGC TTT CTA GAG-3’; β-actin F 5’-TGG TAC CAC CAT GTA CCC AG-3’, R 5’-AAG GGT GTA AAA CGC AGC TC-3’。2-△△Ct法計(jì)算TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

5. 免疫組化染色：采用Elivison二步法。結(jié)腸組織切片常規(guī)脫蠟至水, 3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原熱修復(fù)，山羊血清封閉20 min，依次加入兔抗小鼠 p-NF-κB p65抗體(1∶400)和二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下雙盲法閱片。

免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。于高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算一個(gè)高倍視野下不同著色強(qiáng)度評(píng)分(無(wú)，0分；弱，1分；中，2分；強(qiáng)，3分)與該著色強(qiáng)度下陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分(<5%，0分；5%～9%，1分；10%～19%，2分；20%～50%，3分；≥50%，4分)的乘積，得到的4個(gè)乘積相加，即為該高倍視野下的免疫組化評(píng)分。同樣方法計(jì)算另4個(gè)高倍視野下的免疫組化評(píng)分，總分為5個(gè)視野評(píng)分之和。

6.ELISA：取大鼠血清，參照 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-6、COX-2水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

正常對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精神狀態(tài)良好，飲食、飲水正常，糞便成形，體質(zhì)量未見(jiàn)下降。實(shí)驗(yàn)第4d，結(jié)腸炎模型組和Fp上清治療組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、飲食、飲水減少、稀便和體質(zhì)量下降，F(xiàn)p上清治療組癥狀稍輕；第5d，兩組均可見(jiàn)肉眼血便，體質(zhì)量繼續(xù)下降；第6d，結(jié)腸炎模型組2只大鼠死亡，死因?yàn)橹卸拘跃藿Y(jié)腸和腸梗阻。死亡大鼠不納入后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

比較實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組小鼠體質(zhì)量占原始體質(zhì)量的百分率，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，結(jié)腸炎模型組和Fp上清治療組小鼠體質(zhì)量下降明顯，F(xiàn)p上清治療組降幅低于結(jié)腸炎模型組(圖1A)。與正常對(duì)照組相比，結(jié)腸炎模型組和Fp上清治療組小鼠結(jié)腸顯著縮短(P<0.01)，其中結(jié)腸炎模型組又短于Fp上清治療組(P<0.05)(圖1B)。

二、結(jié)腸組織病理學(xué)變化

正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，無(wú)充血水腫，腺體排列整齊；結(jié)腸炎模型組小鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)不同程度的充血水腫，黏膜上皮破壞，有典型潰瘍形成，鏡下見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜和黏膜下層血管密度增高，腺體結(jié)構(gòu)紊亂；Fp上清治療組小鼠結(jié)腸黏膜稍有充血水腫，鏡下見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管增生不明顯，腺體結(jié)構(gòu)較結(jié)腸炎模型組完整清晰(圖2A-C)。結(jié)腸炎模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001)，F(xiàn)p上清治療組評(píng)分較結(jié)腸炎模型組降低(P<0.05)，但仍顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001)(圖2D)。

三、結(jié)腸組織TLR4mRNA表達(dá)

Real-timePCR檢測(cè)顯示，結(jié)腸炎模型組結(jié)腸組織TLR4mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001)，F(xiàn)p上清治療組較結(jié)腸炎模型組降低(P<0.01)，但仍顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

四、結(jié)腸組織p-NF-κBp65表達(dá)

免疫組化染色顯示，p-NF-κBp65主要表達(dá)于細(xì)胞核(圖4A-C)。結(jié)腸炎模型組結(jié)腸組織p-NF-κBp65 免疫組化評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001)，F(xiàn)p上清治療組評(píng)分較結(jié)腸炎模型組降低(P<0.001)，但仍顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)(圖4D)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化和結(jié)腸長(zhǎng)度比較

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

五、外周血TNF-α、IL-6、COX-2水平

ELISA檢測(cè)顯示，結(jié)腸炎模型組血清TNF-α、IL-6、COX-2水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，F(xiàn)p上清治療組3種炎癥因子的血清水平均較結(jié)腸炎模型組顯著降低 (P<0.05)， 與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

討 論

IBD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但以有益菌減少為特征的腸道微生態(tài)失調(diào)被認(rèn)為是IBD的免疫病理學(xué)基礎(chǔ)[7]，益生菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌常被用于IBD的輔助治療。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腸道共生菌Fp的上清液能顯著減輕小鼠結(jié)腸炎模型的結(jié)腸炎癥，改善結(jié)腸縮短、體質(zhì)量下降等表現(xiàn)，提示其可能成為IBD輔助治療的又一益生菌類型。

A：正常對(duì)照組；B：結(jié)腸炎模型組；C：Fp上清治療組；D：各組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

A：正常對(duì)照組；B：結(jié)腸炎模型組；C：Fp上清治療組；D：各組p-NF-κB p65免疫組化評(píng)分

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

既往研究[3]發(fā)現(xiàn)Fp上清液可阻斷NF-κB炎癥信號(hào)通路激活，進(jìn)而發(fā)揮抗結(jié)腸炎作用。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄參與免疫、炎癥以及細(xì)胞存活、凋亡等重要病理生理過(guò)程[8]。人類IBD[9]和小鼠結(jié)腸炎模型[10]結(jié)腸黏膜中均存在NF-κB過(guò)度或不適當(dāng)?shù)丶せ?，提示其活化可能是IBD發(fā)病中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。靜息狀態(tài)下的NF-κB與其抑制蛋白(IκB)結(jié)合形成復(fù)合物，因其核定位區(qū)被覆蓋而滯留于胞質(zhì)內(nèi)。細(xì)胞受脂多糖、細(xì)胞因子、免疫刺激劑等外界因素刺激后，IκB被降解，NF-κB發(fā)生磷酸化并暴露出核定位區(qū)，隨即轉(zhuǎn)位至胞核[11]，與下游基因的κB位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)p-NF-κBp65表達(dá)強(qiáng)度評(píng)估NF-κB的激活程度(p65為NF-κB中具有轉(zhuǎn)錄激活功能的亞單位)，結(jié)果顯示予Fp上清液治療的結(jié)腸炎模型小鼠，結(jié)腸組織p-NF-κBp65表達(dá)強(qiáng)度較未予治療的模型小鼠顯著降低，提示NF-κB活化受抑，同時(shí)小鼠臨床癥狀和結(jié)腸組織病理學(xué)改變明顯好轉(zhuǎn)，表明阻斷NF-κB激活可有效治療小鼠結(jié)腸炎癥。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)，以NF-κBp65反義寡核苷酸阻斷NF-κB激活可預(yù)防和治療小鼠慢性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化。結(jié)合本研究結(jié)果，證實(shí)NF-κB可作為IBD治療的特異性靶點(diǎn)。

TLR4是TLRs家族的重要成員，其可識(shí)別腸道微生物產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)和內(nèi)毒素[13]，然后通過(guò)招募MyD88和TRIF激活NF-κB[5]，進(jìn)而誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞分泌免疫炎癥因子[13]。TLR4在正常結(jié)腸黏膜腸上皮細(xì)胞中表達(dá)水平極低，在活動(dòng)期IBD患者腸上皮細(xì)胞中則呈強(qiáng)表達(dá)[14]，伴NF-κB異常激活[9]，在本實(shí)驗(yàn)和其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[15-17]中亦觀察到類似現(xiàn)象，因此可認(rèn)為TLR4/NF-κB信號(hào)通路與IBD密切相關(guān)。乳桿菌L.suntoryeus[16]、柚皮素[17]、黃芩苷[15]在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的抗炎效應(yīng)亦與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)，與本研究結(jié)果相符。

TNF-α、IL-6、COX-2基因增強(qiáng)子或啟動(dòng)子區(qū)均含有κB結(jié)合位點(diǎn)，其轉(zhuǎn)錄受NF-κB調(diào)控[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，NF-κB激活后，這些炎癥因子的血清水平均顯著升高。TNF-α、IL-6是IBD中重要的促炎細(xì)胞因子，在活動(dòng)期IBD[19]和結(jié)腸炎動(dòng)物模型中[15-17]均明顯升高，可誘導(dǎo)急性期蛋白產(chǎn)生[20]，在黏膜炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[21]?？筎NF-α單抗英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗臨床上用于CD的誘導(dǎo)和維持緩解取得良好療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸炎模型小鼠的血清TNF-α、IL-6水平升高可為Fp上清液治療所抑制。

COX-2在正常結(jié)腸組織中未見(jiàn)表達(dá)，在IBD炎癥部位的腸上皮細(xì)胞和固有層單核細(xì)胞[22]以及結(jié)腸炎模型動(dòng)物的腸黏膜和血清中[15，17]則呈高水平表達(dá)，提示COX-2參與了結(jié)腸炎癥的發(fā)生、發(fā)展。COX-2能催化花生四烯酸生成前列腺素E2(PGE2)，而高水平的PGE2可通過(guò)調(diào)控IL-23/IL-17軸加劇實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)過(guò)程[23]。盡管多數(shù)學(xué)者認(rèn)為COX-2具有促炎作用，但亦存在相悖觀點(diǎn)，如有研究發(fā)現(xiàn)COX-2基因缺失小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎敏感性增高[24]，而在另一些研究中，抑制COX-2對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用[25]。故有學(xué)者提出COX-2在IBD中主要發(fā)揮抗炎作用，但此作用主要發(fā)生于急性炎癥消退期，在此階段，COX-2可誘導(dǎo)生成具有抗炎作用的PGD2[26-27]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fp上清液治療可下調(diào)結(jié)腸炎模型小鼠升高的血清COX-2水平。鑒于COX-2在IBD中作用的復(fù)雜性，對(duì)涉及COX-2抑制的IBD臨床治療藥物，使用前應(yīng)全面權(quán)衡利弊。

既往研究[3-4]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象，即Fp上清液表現(xiàn)出較Fp活菌更明顯的抗炎效應(yīng)，推測(cè)發(fā)揮抗炎作用的直接效應(yīng)成分是Fp的某些代謝產(chǎn)物而非活菌本身。本研究直接使用Fp上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中表現(xiàn)出明顯的抗炎效應(yīng)，此效應(yīng)與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活及其下游炎癥因子表達(dá)有關(guān)。分離并鑒定Fp上清液中發(fā)揮抗炎作用的有效成分并將其應(yīng)用于臨床，將是后續(xù)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

1HansenR,RussellRK,ReiffC,etal.MicrobiotaofDe-NovoPediatricIBD:IncreasedFaecalibacterium PrausnitziiandReducedBacterialDiversityinCrohn’sButNotinUlcerativeColitis[J].AmJGastroenterol, 2012, 107 (12): 1913-1922.

2VarelaE,ManichanhC,GallartM,etal.ColonisationbyFaecalibacterium prausnitziiandmaintenanceofclinicalremissioninpatientswithulcerativecolitis[J].AlimentPharmacolTher, 2013, 38 (2): 151-161.

3SokolH,PigneurB,WatterlotL,etal. Faecalibacterium prausnitziiisananti-inflammatorycommensalbacteriumidentifiedbygutmicrobiotaanalysisofCrohndiseasepatients[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2008, 105 (43): 16731-16736.

4 洪娜，邱新運(yùn)，張明明，等. 普拉梭菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠結(jié)腸炎防治的初步研究[J]. 中華消化雜志, 2012, 32 (7):459-465.

5SiddiqueI,KhanI.MechanismofregulationofNa-Hexchangerininflammatoryboweldisease:roleofTLR-4signalingmechanism[J].DigDisSci, 2011, 56 (6): 1656-1662.

6WirtzS,NeufertC,WeigmannB,etal.Chemicallyinducedmousemodelsofintestinalinflammation[J].NatProtoc, 2007, 2 (3): 541-546.

7ComitoD,RomanoC.Dysbiosisinthepathogenesisofpediatricinflammatoryboweldiseases[J].IntJInflam, 2012, 2012: 687143.

8ChakrabortyJB,MannDA.NF-kappaBsignalling:embracingcomplexitytoachievetranslation[J].JHepatol, 2010, 52 (2): 285-291.

9AndresenL,J?rgensenVL,PernerA,etal.ActivationofnuclearfactorkappaBincolonicmucosafrompatientswithcollagenousandulcerativecolitis[J].Gut, 2005, 54 (4): 503-509.

10SinghK,ChaturvediR,BarryDP,etal.Theapolipo-proteinE-mimeticpeptideCOG112inhibitsNF-kappaBsignaling,proinflammatorycytokineexpression,anddiseaseactivityinmurinemodelsofcolitis[J].JBiolChem, 2011, 286 (5): 3839-3850.

11DiamantG,DiksteinR.TranscriptionalControlbyNF-κB:ElongationinFocus[J].BiochimBiophysActa, 2013: 937-945.

12LawranceIC,WuF,LeiteAZ,etal.Amurinemodelofchronicinflammation-inducedintestinalfibrosisdown-regulatedbyantisenseNF-kappaB[J].Gastroenterology, 2003, 125 (6): 1750-1761.

13JungHC,EckmannL,YangSK,etal.Adistinctarrayofproinflammatorycytokinesisexpressedinhumancolonepithelialcellsinresponsetobacterialinvasion[J].JClinInvest, 1995, 95 (1): 55-65.

14CarioE,PodolskyDK.Differentialalterationinintestinalepithelialcellexpressionoftoll-likereceptor3 (TLR3)andTLR4ininflammatoryboweldisease[J].InfectImmun, 2000, 68 (12): 7010-7017.

15CuiL,FengL,ZhangZH,etal.Theanti-inflammationeffectofbaicalinonexperimentalcolitisthroughinhibitingTLR4/NF-κBpathwayactivation[J].IntImmuno-pharmacol, 2014, 23 (1): 294-303.

16LeeJH,LeeB,LeeHS,etal. Lactobacillus suntoryeusinhibitspro-inflammatorycytokineexpressionandTLR-4-linkedNF-κBactivationinexperimentalcolitis[J].InternJColorectDis, 2009, 24 (2): 231-237.

17DouW,ZhangJ,SunA,etal.ProtectiveeffectofnaringeninagainstexperimentalcolitisviasuppressionofToll-likereceptor4/NF-κBsignaling[J].BritJNutr, 2013, 110 (4): 599-608.

18HaydenMS,GhoshS.NF-κBinimmunobiology[J].CellRes, 2011, 21 (2): 223-244.

19IshiguroY.Mucosalproinflammatorycytokineproductioncorrelateswithendoscopicactivityofulcerativecolitis[J].JGastroenterol, 1999, 34 (1): 66-74.

20SartorRB.Cytokinesinintestinalinflammation:pathophysiologicalandclinicalconsiderations[J].Gastroenterology, 1994, 106 (2): 533-539.

21BlamME,SteinRB,LichtensteinGR.Integratinganti-tumornecrosisfactortherapyininflammatoryboweldisease:currentandfutureperspectives[J].AmJGastroenterol, 2001, 96 (7): 1977-1997.

22SingerII,KawkaDW,SchloemannS,etal.Cyclooxygenase2isinducedincolonicepithelialcellsininflammatoryboweldisease[J].Gastroenterology, 1998, 115 (2): 297-306.

23SheibanieAF,YenJH,KhayrullinaT,etal.TheproinflammatoryeffectofprostaglandinE2inexperimentalinflammatoryboweldiseaseismediatedthroughtheIL-23 -->IL-17axis[J].JImmunol, 2007, 178 (12): 8138-8147.

24MorteauO,MorhamSG,SellonR,etal.Impairedmucosaldefensetoacutecolonicinjuryinmicelackingcyclooxygenase-1orcyclooxygenase-2[J].JClinInvest, 2000, 105 (4): 469-478.

25DudhgaonkarSP,TandanSK,KumarD,etal.Influenceofsimultaneousinhibitionofcyclooxygenase-2andinduciblenitricoxidesynthaseinexperimentalcolitisinrats[J].Inflammopharmacology, 2007, 15 (5): 188-195.

26ZamunerSR,WarrierN,BuretAG,etal.Cyclooxygenase2mediatespost-inflammatorycolonicsecretoryandbarrierdysfunction[J].Gut, 2003, 52 (12): 1714-1720.

27GilroyDW,Colville-NashPR,WillisD,etal.Induciblecyclooxygenasemayhaveanti-inflammatoryproperties[J].NatMed, 1999, 5 (6): 698-701.

(2016-03-21收稿；2016-04-11修回)

Effect ofFaecalibacteriumprausnitziion TLR4/NF-κB Signaling Pathway in Experimental Colitis

CHENZhaogui1,YUChenggong1,2.

1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing(210008);2DepartmentofGastroenterology,YizhengHospital,DrumTowerHospitalGroupofNanjing,Nanjing

Correspondence to: YU Chenggong, Email: chenggong_yu@nju.edu.cn

Background:Faecalibacteriumprausnitzii(Fp) is one of the commensal bacteria colonized in intestine, lowering of Fp is the key character of intestinal microbial dysbiosis in patients with inflammatory bowel disease (IBD). It has been demonstrated that the supernatant of Fp exerts an obvious anti-inflammatory effect in experimental colitis. Aims: To investigate whether the anti-inflammatory effect of Fp supernatant in experimental colitis is related to inhibition of TLR4/NF-κB pathway activation. Methods: Twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into the normal control group, colitis group and Fp supernatant-treated group. Acute colitis was induced by drinking 3.5% dextran sulfate sodium (DSS) in tap water for five days. Weight loss and histopathological damage of colon tissue were observed; real-time PCR and immunohistochemistry were applied to determine the TLR4 mRNA and phosphorylated NF-κB p65 (p-NF-κB p65) expression in colon tissue. Serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and cyclooxygenase-2 (COX-2) were detected by ELISA method. Results: Compared with normal control group, mice in colitis group showed a heavier weight loss and shortened colon length; the colonic histopathological score, TLR4 mRNA and p-NF-κB p65 expressions, together with the serum levels of TNF-α, IL-6 and COX-2 were significantly increased (P<0.05). When treated with Fp supernatant, all the above-mentioned indicators were reversed with statistical significance (P<0.05). No significant differences were found in serum inflammatory cytokines between Fp supernatant-treated group and normal control group (P>0.05). Conclusions: The mechanism for Fp supernatant against experimental colitis is related to the inhibition of TLR4/NF-κB pathway activation and suppression of downstream inflammatory cytokines.

Faecalibacteriumprausnitzii; Colitis; Toll-Like Receptor 4; NF-kappa B; Tumor Necrosis Factor-alpha; Interleukin-6; Cyclooxygenase 2

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.11.002

國(guó)家自然科學(xué)基金(81470819)

#Email: a743381985@126.com

&本文通信作者，Email: chenggong_yu@nju.edu.cn