雷光濤 何力鵬 黃鐵球 吳延慶 吳清華 程曉曙 姜 宇

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西 南昌 330006)

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阿托伐他汀對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心房肌細(xì)胞結(jié)締組織生長因子及縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響

雷光濤 何力鵬1黃鐵球 吳延慶 吳清華 程曉曙 姜 宇

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西 南昌 330006)

目的 探討阿托伐他汀對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的心房肌細(xì)胞結(jié)締組織生長因子(CTGF)和縫隙連接蛋白(Cx43)表達(dá)的影響。方法 將雄性Wistar大鼠40只隨機(jī)分為A組(15只，給予0.9%氯化鈉溶液)、B組(12只，給予鹽酸異丙腎上腺素)和C組(13只，給予鹽酸異丙基腎上腺素+阿托伐他汀鈣片)。分別用放射免疫法測定AngⅡ濃度，凝膠成像系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β mRNA、CTGF和Cx43 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 三組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，B組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。三組大鼠TGF-β1 mRNA、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，B組大鼠TGF-β1 mRNA、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 阿托伐他汀能夠降低AngⅡ誘導(dǎo)的心房肌細(xì)胞CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)，減輕與CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)相關(guān)的心肌纖維化和心臟重構(gòu)進(jìn)展，在房顫的預(yù)防和治療中具有一定的臨床意義。

血管緊張素Ⅱ；結(jié)締組織生長因子；縫隙連接蛋白43；阿托伐他汀

阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化、降脂、抑制細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)聚集等作用，已在心血管病的治療中廣泛應(yīng)用〔1〕。結(jié)締組織生長因子(CTGF)能夠加快多種活細(xì)胞的分裂增殖、上調(diào)ECM含量、促進(jìn)組織纖維化，參與皮膚再生、腫瘤細(xì)胞分化、瘢痕形成、器官纖維化、肌肉代謝等多個病理生理和代謝過程〔2〕。心房肌細(xì)胞縫隙連接蛋白(Cx)43能夠影響細(xì)胞沖動傳導(dǎo)，進(jìn)而影響心臟電生理，促進(jìn)心房重構(gòu)〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素(Ang)Ⅱ能夠通過Rao蛋白系統(tǒng)上調(diào)CTGF和Cx43的表達(dá)，而阿托伐他汀能夠通過抑制AngⅡ表達(dá)影響CTGF和Cx43的表達(dá)〔4〕。本實驗擬探討阿托伐他汀對CTGF和Cx43表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性Wistar大鼠40只，體重40～45 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。多克隆抗體、單克隆抗體β-actin均購自美國Santa Cruz生物科技公司；DMEM干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶、牛血清、Ⅱ型膠原酶均購自美國Gibco公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司；總RNA提取試劑盒和PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 誘導(dǎo)分組 使用計算機(jī)隨機(jī)數(shù)生成器將40只大鼠分為三組。A組(15只)：給予0.9%氯化鈉溶液；B組(12只)：給予鹽酸異丙腎上腺素(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H11021929)；C組(13只)：給予鹽酸異丙腎上腺素+阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司；批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20093819)。

1.3 心房肌細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠仰臥位固定，打開胸腔，取胸壁組織去血、冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，將心房肌剪成肌粒。加入胰酶(濃度為0.08%)、常溫水浴10 min。加入混合酶水浴消化，收集上清液，添加DMEM/F12終止消化、洗細(xì)胞、制作單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)。

1.4 免疫組織染色 培養(yǎng)細(xì)胞1 d后，使用多聚甲醛(4%)固定30 min，在H2O2(30%)1份+純甲醇50份混合液浸泡、滅活，蒸餾水洗滌。牛血清白蛋白(BSA)封閉液，去除多余液體。滴加兔抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白一抗工作液，PBS液清洗。添加羊抗兔二抗，20 min，PBS液清洗。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)常溫顯色，脫水、透明后封片。

1.5 AngⅡ測定 在液氮中研磨心房肌組織，加入PBS液(0.05 mol/L，pH7.4)5 ml、二巰基丙醇(0.32 mol/L)10 μl、8-羥基喹啉硫酸鹽(0.34 mol/L)20 μl，離心(2 000 r/min)10 min取上清液。采用放射免疫法測定血漿和心肌AngⅡ水平。

1.6 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、CTGF和Cx43測定 采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以各自引物擴(kuò)增TGF-β1、CTGF和Cx43，引物見表1。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃45 s，55℃1 min，72℃1 min，循環(huán)40次，72℃8 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)分析mRNA表達(dá)水平。

表1 各基因引物序列及擴(kuò)增片段長度

基因引物序列片段長度TGF-β1正義鏈:5'-AGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTA-3'反義鏈:5'-TGCGCCTGCAGAGATTCAAG-3'79bpCTGF正義鏈:5'-CCTGACCCAACTATGATGC-3'反義鏈:5'-CCCTTACTCCCTGGCTTT-3'200bpCx43正義鏈:5'-AGAATCATAGCGTCGGTGTCAGG-3'反義鏈:5'-GCTGGTATTTGGATGGCTGAAGA-3'82bp

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，定量資料多組間差異性分析采用方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠AngⅡ水平比較 三組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。B組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

組別n血漿心肌A組15503.65±9.5760.41±1.37B組12517.73±8.571)61.6±1.051)C組13506.77±14.8960.9±0.06F/P值-5.860/0.0064.566/0.017

與A組比較:1)P<0.05；下表同

2.2 三組大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)水平比較 三組大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。B組大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別nTGF-β1CTGFCx43A組150.28±0.060.42±0.030.95±0.05B組120.38±0.071)0.47±0.041)1.01±0.061)C組130.31±0.080.44±0.050.95±0.03F/P值-6.920/0.0034.697/0.0154.870/0.013

3 討 論

CTGF基因位于6q23.1，在人體眾多組織器官中廣泛表達(dá)。CTGF的表達(dá)受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，如AngⅡ、血管內(nèi)皮生長因子、TGF-β、胰島素樣生長因子-1、糖基化終產(chǎn)物等，以及機(jī)械應(yīng)力、靜水壓和氧化應(yīng)激等均能刺激CTGF〔5〕。作為GTGF的上游因子，二聚多肽類生長因子TGF-β1具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在組織纖維化過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1是CTGF調(diào)控最重要的通路，通過Smad信號通路、Ras/MEK/ERK1/2通路誘導(dǎo)CTGF的表達(dá)〔6〕。CTGF通過和多種生長因子結(jié)合發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)〔7〕：(1)生長與分化：CTGF能夠上調(diào)cAMP水平，加速細(xì)胞分裂和增殖；(2)細(xì)胞黏附與趨化：CTGF通過結(jié)合ECM促進(jìn)細(xì)胞黏附，具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞向纖連蛋白黏附的作用；(3)細(xì)胞凋亡：CTGF能夠增強(qiáng)caspase23活性，降低平滑肌細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；(4)平衡ECM穩(wěn)態(tài)：CTGF能夠促進(jìn)層黏蛋白、糖蛋白膠原的生成，誘導(dǎo)膠原表達(dá)，抑制ECM降解酶的活性，促進(jìn)纖維化；(5)促血管生成。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，敲除CTGF基因的小鼠表現(xiàn)出血管缺陷，表明CTGF是促血管形成因子。Cx蛋白以端端連接的方式分布在心房肌細(xì)胞中，與心臟電激動傳導(dǎo)各向異性和方向密切相關(guān)。心肌間質(zhì)纖維化會影響縫隙連接的大小、數(shù)量和分布，進(jìn)而影響細(xì)胞間的傳導(dǎo)作用。細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、鈣網(wǎng)蛋白、AngⅡ、TGF-β1等信號傳導(dǎo)因子構(gòu)成的信號網(wǎng)絡(luò)均能夠調(diào)節(jié)Cx43的磷酸化，影響Cx43裝配、含量、分布與傳導(dǎo)，影響縫隙連接重構(gòu)。

研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了具有調(diào)脂功效外，還能抑制氧化反應(yīng)、抑制炎癥反應(yīng)、減少組織膠原含量、提高內(nèi)皮細(xì)胞功能、促進(jìn)斑塊穩(wěn)定等〔9〕。臨床研究和動物實驗均表明〔10〕，他汀類藥物能夠改善心肌的纖維化和心室重構(gòu)。Riser等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能夠降低CTGF表達(dá)，減輕腎間質(zhì)的纖維病變。Abraham等〔12〕在對肥厚性心肌病白兔研究中發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能夠減輕心肌肥厚和心肌纖維化。Rakotoniaina等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能夠改善心臟供血、減緩心室重構(gòu)。他汀類能夠抑制AngⅡ的表達(dá)、降低ACE活性，減少NO生成，保護(hù)心房肌細(xì)胞，改變縫隙連接重構(gòu)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠血漿和心肌AngⅡ水平先增高，使用阿托伐他汀后下降，基本恢復(fù)到對照組水平，說明阿托伐他汀能夠降低血漿和心肌AngⅡ水平。其可能機(jī)制是：阿托伐他汀通過抑制異戊烯化進(jìn)程，阻止小分子單體G蛋白激活，進(jìn)而降低AngⅡ受體表達(dá)〔14〕。TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)水平改變與AngⅡ受體表達(dá)水平趨勢一致，AngⅡ受體表達(dá)較高者TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)也相對較高。其可能機(jī)制如下：AngⅡ通過激活TGF-β1生物活性途徑或Rao蛋白系統(tǒng)途徑增加CTGF表達(dá)，介導(dǎo)心肌纖維化。 隨著AngⅡ水平升高，有絲分裂原活化蛋白激酶信號分子(如JNK、P38、ERK等)使得Cx43肽鏈發(fā)生多位點磷酸化，Cx43合成增加；AngⅡ增加促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，激活蛋白酶Calpains和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、釋放溶酶體、破壞細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，增加Cx43的降解，最終使得Cx43合成減少〔15〕。阿托伐他汀能夠降低AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達(dá)。

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〔2015-12-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

2014年省級第二批科技專項項目(No.20142BAB205042)

1 江西省武警總隊醫(yī)院心內(nèi)科

姜 宇(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事動脈粥樣硬化病變、冠心病介入治療方面的研究。

雷光濤(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事動脈粥樣硬化病變方面的研究。

R54

A

1005-9202(2016)23-5822-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.021