喻 斌 張臻年 黃仕文 楊 麗 鄒 杰 程海波 沈祥春

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

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化瘀開竅解郁顆粒對腦卒中后抑郁大鼠的保護(hù)作用

喻 斌 張臻年1黃仕文 楊 麗 鄒 杰 程海波 沈祥春2

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

目的 探討化瘀開竅解郁顆粒(HY顆粒)對腦卒中后抑郁(PSD)大鼠的改善作用及機(jī)制。方法 首先對大鼠MCAO處理，再進(jìn)行慢性應(yīng)激刺激兩步完成PSD模型的復(fù)制，給藥后觀察HY顆粒對大鼠糖水消耗、開場活動情況的影響，以及對水迷宮實(shí)驗(yàn)中游泳時間、游泳距離、游泳速度、近站臺區(qū)游泳距離、遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離、近/遠(yuǎn)站臺區(qū)距離比、近站臺區(qū)時間、遠(yuǎn)站臺區(qū)時間、近/遠(yuǎn)站臺區(qū)時間比的影響。通過免疫組織化學(xué)法觀察HY顆粒對海馬和皮層(額葉)中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)表達(dá)的影響。結(jié)果 HY顆粒治療后可顯著增加PSD大鼠體重、糖水消耗體積、水平活動次數(shù)、垂直活動次數(shù)，縮短總游泳距離、近站臺區(qū)的游泳距離、遠(yuǎn)站臺區(qū)的游泳距離、游泳時間、近站臺區(qū)游泳時間、遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳時間，增加近/遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離比和時間比。HY顆粒還可劑量依賴性增加海馬和皮層腦區(qū)中BDNF和NGF蛋白的表達(dá)。結(jié)論 HY顆粒能促進(jìn)PSD大鼠行為學(xué)改善，其機(jī)制涉及BDNF和NGF表達(dá)量的增加。

化瘀開竅解郁顆粒；腦卒中后抑郁

腦卒中后抑郁(PSD)患者除了表現(xiàn)情緒低落、興趣減少外，還往往出現(xiàn)嚴(yán)重負(fù)罪感、睡眠障礙、思維能力減弱、自殺傾向〔1〕。PSD不僅對神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)不利，甚至還可能促使腦損傷惡化，加重影響患者的生活質(zhì)量?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于PSD的治療主要采用抗抑郁藥物，如舍曲林等，但效果并不理想，并且還可帶來如消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的副作用〔2〕。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為PSD的病機(jī)在于氣滯血瘀，情志不舒，肝氣郁結(jié)，氣機(jī)失調(diào)，心失所養(yǎng)，故其治療應(yīng)采用活血化瘀、開竅理氣、疏肝解郁法為主?；谠摾碚撔纬傻幕鲩_竅解郁治法臨床療效較好，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)該方已制備化瘀開竅解郁顆粒(HY顆粒)。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步闡明HY顆粒對PSD的藥理作用及初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠(體重180～220 g)，雄性，購于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。HY顆粒，本實(shí)驗(yàn)室制備，該方含丹參、石菖蒲、川芎、柴胡、廣郁金、茯神、香附、枳殼、青皮、紅花、桃仁、當(dāng)歸、竹茹、冰片和甘草。帕羅西汀購于葛蘭素史克公司，批號14110503。Morris水迷宮行為學(xué)系統(tǒng)(淮北正華有限公司)，配合Any-maze行為學(xué)分析軟件(美國Stoeling公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 60只大鼠，隨機(jī)分為正常組、PSD組、陽性藥組(帕羅西汀1.65 mg/kg)、HY顆粒-Ⅰ組(13.35 g/kg)、HY顆粒-Ⅱ組(26.7 g/kg)和HY顆粒-Ⅲ組(53.4 g/kg)，每組10只。

1.2.2 PSD造模和給藥方法 按照Kim等〔3〕方法進(jìn)行PSD造模。大鼠用水合氯醛麻醉(350 mg/kg，ip)，仰臥于鼠板上。頸正中切口，依次分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端并烙斷。結(jié)扎CCA近心端以及ECA和翼腭動脈。距CCA分叉處近心端 0.5 cm處插入備好的尼龍線，去除動脈夾，沿著ICA輕輕向前推至指定長度〔(18±0.5)cm〕后，將ICA和魚線一起固定后縫合皮膚。正常組大鼠手術(shù)過程相同，但不插入尼龍線。每日給予青霉素(ip，10萬U/只)，連續(xù)3 d。以大鼠出現(xiàn)Horner癥狀作為PSD模型成功的標(biāo)志。按文獻(xiàn)方法進(jìn)行抑郁模型的復(fù)制〔4〕。每只用小鼠籠單獨(dú)飼養(yǎng)并接受21 d的慢性應(yīng)激刺激，具體包括1 d的晝夜顛倒、3 min的夾尾、5 min的4℃水游泳、5 min的160 Hz水平振蕩、24 h的禁食、24 h的禁水、2 min的電擊(30 V，電擊5 s，間隔5 s)。將上述每種刺激重復(fù)3次，形成隨機(jī)的21次刺激，1次/d，共21 d。正常組大鼠正常飼養(yǎng)。動物在接受刺激的同時灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥21 d。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 體重和糖水消耗 禁水24 h后稱重。大鼠單籠飼養(yǎng)1 h，同時每只大鼠供應(yīng)20 ml 1%蔗糖水，大鼠自由飲水。計算1 h大鼠糖水飲用量(ml)。

1.3.2 開場水平和垂直活動 制備無蓋鐵皮箱，箱底劃有10 cm×10 cm的格子64個。在安靜暗室，將大鼠放入箱底中心格子。以大鼠爬行路過的格子數(shù)作為水平運(yùn)動次數(shù)，以大鼠后肢直立、前肢懸空或攀爬的次數(shù)為垂直運(yùn)動次數(shù)，觀察3 min內(nèi)動物活動情況。

1.3.3 Morris水迷宮 實(shí)驗(yàn)開始前先訓(xùn)練大鼠，將其引導(dǎo)至站臺。實(shí)驗(yàn)時將大鼠放入水池的任一位置，利用Any-maze行為分析軟件獲取游泳時間、游泳距離、游泳速度、近站臺區(qū)游泳距離、遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離、近/遠(yuǎn)站臺區(qū)距離比、近站臺區(qū)時間、遠(yuǎn)站臺區(qū)時間、近/遠(yuǎn)站臺區(qū)時間比等參數(shù)。

1.3.4 神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)的檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠脫頸椎處死，分離海馬和額部皮層，甲醛固定，通過免疫組化法檢測BDNF和NGF的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 HY顆粒對PSD大鼠體質(zhì)量、糖水飲用量、開場水平和垂直活動的影響 PSD組與正常組比較顯著減輕大鼠體質(zhì)量，減少大鼠糖水飲用量；此外，水平活動和垂直運(yùn)動次數(shù)也明顯減少(P<0.05)。HY顆粒三個劑量組大鼠體質(zhì)量、糖水用量、大鼠水平和垂直運(yùn)動次數(shù)與PSD組比較顯著增加(P<0.05)。見表1。

組別體質(zhì)量(g)糖水飲用(ml)水平運(yùn)動(次)垂直運(yùn)動(次)正常組212.10±13.0517.00±4.7164.20±30.6913.30±3.65PSD組155.00±12.521)9.00±1.411)14.90±4.201)3.89±1.621)陽性藥組187.00±13.622)13.20±4.492)21.50±7.692)8.90±2.332)HY顆粒-Ⅰ組 178.20±19.672)11.60±2.952)25.80±10.272)6.00±2.492)HY顆粒-Ⅱ組 197.50±12.472)13.50±3.242)32.40±11.642)8.30±3.062)HY顆粒-Ⅲ組 204.40±11.352)15.20±5.902)45.00±18.802)10.20±3.162)

與正常組比較：1)P<0.05；與PSD組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 HY顆粒對PSD大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響 PSD組大鼠游泳距離、近站臺區(qū)游泳距離、遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離、游泳時間、近站臺區(qū)時間、遠(yuǎn)站臺區(qū)時間與正常組比較顯著增加，近/遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離比、近/遠(yuǎn)站臺區(qū)時間比顯著減少(P<0.05)。HY顆粒三個劑量組近站臺區(qū)游泳距離、遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離、游泳時間、近站臺區(qū)時間、遠(yuǎn)站臺區(qū)時間與PSD組比較顯著縮短，同時近/遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離比、近/遠(yuǎn)站臺區(qū)時間比明顯增加(P<0.05，0.01)。見表2。

組別游泳距離(m)游泳速度(m/s)近站臺區(qū)游泳距離(m)遠(yuǎn)站臺區(qū)游泳距離(m)近/遠(yuǎn)站臺區(qū)距離比游泳時間(s)近站臺區(qū)時間(s)遠(yuǎn)站臺區(qū)時間(s)近/遠(yuǎn)站臺區(qū)時間比正常組3.16±2.360.24±0.091.75±1.411.41±0.991.44±0.9113.99±11.986.95±5.967.04±6.321.22±0.70PSD組22.88±5.541)0.25±0.068.72±2.741)14.17±3.331)0.62±0.171)100.64±46.291)37.62±23.001)63.02±26.071)0.61±0.241)陽性藥組10.04±10.312)0.25±0.084.88±5.382)5.16±4.972)1.09±0.672)45.73±48.132)21.57±24.3924.16±24.542)0.99±0.512)HY顆粒-Ⅰ組11.26±4.032)0.25±0.105.26±2.222)6.01±1.912)0.86±0.172)50.36±23.512)23.03±11.3227.33±14.542)0.92±0.362)HY顆粒-Ⅱ組9.81±3.742)0.23±0.034.52±2.122)5.29±2.012)0.89±0.292)43.73±18.312)19.77±7.842)23.96±12.762)0.99±0.442)HY顆粒-Ⅲ組8.31±4.702)0.27±0.084.10±2.872)4.22±2.102)0.95±0.322)30.10±17.512)14.67±8.802)15.43±9.112)0.95±0.202)

2.3 HY顆粒對PSD大鼠BDNF和NGF在額葉皮層和海馬表達(dá)的影響 PSD組大鼠可見海馬和額葉皮層BDNF和NGF的表達(dá)與正常組比較顯著減少(P<0.05)。HY顆粒三個劑量組這兩個腦區(qū)NGF的表達(dá)與PSD組比較均顯著增加(P<0.05，0.01)；HY顆粒Ⅱ組和Ⅲ組與PSD組比較還可增加這兩個腦區(qū)BDNF的表達(dá)(P<0.05)。見表3。

組別BDNF皮層(額葉)海馬NGF皮層(額葉)海馬正常組3.22±0.812.57±0.783.36±1.253.48±0.43PSD組1.86±0.581)1.56±0.431)1.25±0.461)1.41±0.561)陽性藥組2.65±0.772)2.18±0.352)2.26±0.812)2.39±0.762)HY顆粒-Ⅰ組2.27±0.521.83±0.512.08±0.652)2.26±0.882)HY顆粒-Ⅱ組2.63±0.582)2.12±0.602)2.28±0.712)2.37±0.542)HY顆粒-Ⅲ組2.90±0.762)2.41±0.632)2.36±0.392)2.54±0.492)

3 討 論

額葉區(qū)域的皮層腦組織約占整個大腦皮質(zhì)的40%，占有較大的面積，其功能主要是對外界環(huán)境來源的各種刺激信號進(jìn)行整合，并引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的情緒反應(yīng)。顯然，額葉皮層的病理改變，往往除了導(dǎo)致患者認(rèn)知能力和判斷水平，還可能發(fā)生行為、情緒和情感障礙。Parikh等〔5〕對103例PSD患者進(jìn)行1～2年的隨訪，發(fā)現(xiàn)PSD的病情發(fā)展和預(yù)后與額葉皮層區(qū)域的病變程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了額葉區(qū)皮層組織與PSD的密切聯(lián)系。顳葉內(nèi)側(cè)的海馬與學(xué)習(xí)、記憶和情感的聯(lián)系也已被廣泛認(rèn)可，亦被認(rèn)為是引起認(rèn)知障礙的主要區(qū)域。陳宇等〔6〕對PSD患者的海馬體積進(jìn)行MRI檢測，結(jié)果顯示梗死后海馬組織可見體積的顯著萎縮。另外，Huang等〔7〕利用影像學(xué)技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)PSD患者的海馬組織還存在代謝障礙。以上資料顯然，海馬和額葉皮層區(qū)域神經(jīng)元病變的發(fā)生及嚴(yán)重程度與PSD的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸均有著密切聯(lián)系。BDNF和NGF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)多肽，在神經(jīng)元發(fā)育、成熟和分化中均有重要作用，也是評價神經(jīng)元功能的重要指標(biāo)〔8〕。神經(jīng)元損傷往往引發(fā)這兩種多肽的表達(dá)降低，而這種降低又反過來進(jìn)一步加重神經(jīng)元損傷。但通過有效治療后，伴隨著癥狀的改善，BDNF和NGF含量也可顯著升高，接近正常水平〔9〕。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PSD屬“中風(fēng)”和“郁證”的合病。《臨證指南醫(yī)案》提出郁證的病因病機(jī)為“因郁則氣滯，氣滯久則必化火熱。熱則津液耗而不流，升降之機(jī)失度，初傷氣分，久必血分，延及郁勞沉疴”。此外，《醫(yī)學(xué)論·越鞠丸》記載：“凡郁病必先氣病，氣得疏通，則何郁之有?”，顯然，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為PSD的病因是氣血逆亂于腦所致。而對其病機(jī)的理解則是情志不舒，氣機(jī)失調(diào)，肝氣郁結(jié)，氣滯血瘀，心失所養(yǎng)。針對這一病機(jī)研制的HY顆粒具有活血化瘀、開竅理氣、疏肝解郁之效。方中丹參活血養(yǎng)血，石菖蒲醒腦開竅為君?！把袣馑帯贝ㄜ夯钛袣猓徊窈鷹l達(dá)肝氣，疏解肝郁；廣郁金活血止痛，行氣解郁，清心涼血；伏神寧心安神，共為臣藥。佐以香附、枳殼、青皮行氣開郁，紅花、桃仁活血化瘀，當(dāng)歸活血、養(yǎng)肝、生血，竹茹寧心除煩，以達(dá)活血養(yǎng)血、疏肝解郁除煩之功。冰片性善走竄開竅，無往不達(dá)，芳香之氣，能辟一切邪惡，辛熱之性，能散一切風(fēng)濕。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，冰片具有促進(jìn)藥物腦內(nèi)分布的作用，尤其對海馬區(qū)較為明顯，這可能也是該復(fù)方能顯著改善PSD患者認(rèn)知能力低下的機(jī)制之一〔10〕。甘草則疏理肝氣，調(diào)和諸藥，共為佐使。諸藥合用，共起活血化瘀、開竅理氣、疏肝解郁之效。

綜上所述，HY顆粒能明顯改善PSD大鼠行為學(xué)異常以及糖水?dāng)z入水平，增強(qiáng)大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力以及對未知空間的探究興趣。此外，增加海馬和額葉皮層區(qū)域內(nèi)BDNF和NGF的表達(dá)可能是該顆?？筆SD的機(jī)制之一。

1 de Man-vanGinkel JM，Hafsteinsdottir TB，Lindeman E，etal.In-hospital risk prediction for post-stroke depression development and validation of the Post-stroke Depression Prediction Scale〔J〕.Stroke，2013；44(9)：2441-5.

2 丁建紅，李 璐，程 妍.個性化心理干預(yù)護(hù)理對腦卒中后抑郁患者生存質(zhì)量的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(12)：3436-7.

3 Kim YR，Kim HN，Pak ME，etal.Studies on the animal model of post-stroke depression and application of antipsychotic aripiprazole〔J〕.Behav Brain Res，2015；287(3)：294-303.

4 喻 斌，阮 鳴，孫 永，等.電針對抑郁大鼠大腦皮層ATP結(jié)合盒式蛋白表達(dá)的影響〔J〕.針刺研究，2013；38(4)：286-90.

5 Parikh M，Lipsey J，Robinson R.Two-year longitudinal study of post-stroke mood disorders：Dynamic changes in correlates of depression at one and two years〔J〕.Stroke，1987；18(3)：579-84.

6 陳 宇，徐堅民，馮敢生，等.腦梗死后抑郁癥患者海馬及杏仁核體積的MRI 研究〔J〕.放射學(xué)實(shí)踐，2009；24(6)：603-6.

7 Huang Y，Chen W，Li Y，etal.Effects of antidepressant treatment on N-acetyl aspartate and choline levels in the hippocampus and thalami of post-stroke depression patients：a study using (1)H magnetic resonance spectroscopy〔J〕.Psychiatry Res，2010；182(1)：48-52.

8 喻 斌，張臻年，楊 麗，等.消郁顆粒對抑郁大鼠的改善作用及機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(1)：10-2.

9 Pang C，Cao L，Wu F，etal.The effect of trans-resveratrol on post-stroke depression via regulation of hypothalamus-pituitary-adrenal axis〔J〕.Neuropharmacology,2015;97(5):447-56.

10 喻 斌，阮 鳴，董小平，等.不同間隔時間冰片處理對大鼠梔子苷腦靶效應(yīng)的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2012；28(6)：862-6.

〔2016-01-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

The effect and mechanism of Huayu Kaiqiao Jieyu therapy on post-stroke depression

YU Bin, ZHANG Zhen-Nian, HUANG Shi-Wen,et al.

Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

Objective To research the improvement and mechanism of Huayu Kaiqiao Jieyu granules on post-stroke depression (PSD)rats.Methods The behavior of depressive rats, which were formed by MCAO combining with chronic stress, were detected by Morris water maze, syrup consuming and Open-field experiments. Moreover, the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus were measured to explore its mechanism.Results Comparing with those of model group, Huayu Kaiqiao Jieyu granules increased the body weight and syrup consuming obviously, improved open-field behaviors, shortened the total swim route, latency, time consuming and route of swimming in distant and nearby area, enhanced time consuming ratio and route ratio of swimming in nearby and distant area(P<0.05, 0.01). Moreover, this granules increased the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus markedly (P<0.05, 0.01).Conclusions The granules improves PSD disorder and the mechanisms is involved with increasing the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus.

Huayu Kaiqiao Jieyu granules; Post-stroke depression

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573713，81001651);江蘇省基礎(chǔ)研究計劃(BK20151564);江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)踐訓(xùn)練計劃

1 南京市中醫(yī)院腦病科 2 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

程海波(1975-)，男，副教授，博士，主要從事中醫(yī)藥方劑研究。 沈祥春(1973-)，男，教授，博士，主要從事民族藥物研究。

喻 斌(1978-)，男，副教授，博士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

R749

A

1005-9202(2016)23-5771-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.002