霍震　沈進(jìn)　許禮發(fā)

摘要： 運(yùn)用pADxsi系統(tǒng)制備可表達(dá)人PDX1與PAX4雙基因的重組5型腺病毒。從pEGFP-N1-PDX1質(zhì)粒上酶切下目的基因PDX1并酶連到腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-EGFP-CMV上，替換EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1；再將PAX4從pEGFP-N1-PAX4質(zhì)粒上酶切下連到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位點(diǎn)而得到穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4；雙酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4將CMV-PDX1/CMV-PAX4轉(zhuǎn)移到ADxsi骨架質(zhì)粒上，得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒質(zhì)粒，然后在293細(xì)胞中進(jìn)行包裝并擴(kuò)增重組腺病毒，并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定；體外感染人間充質(zhì)干細(xì)胞。依據(jù)酶切、測(cè)序和PCR的結(jié)果均證明重組人PDX1與PAX4雙基因表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建正確；而RT-PCR與WB結(jié)果也顯示目的基因在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。應(yīng)用重組技術(shù)成功構(gòu)建人PDX1與PAX4雙基因表達(dá)5型腺病毒載體，轉(zhuǎn)錄因子PDX1與PAX4在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)且定位于細(xì)胞核內(nèi)。

關(guān)鍵詞： 5型腺病毒；間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）；胰腺十二指腸同源框蛋白1（PDX1）；成對(duì)盒基因4（PAX4）；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-1098（2016）02-0080-07

Abstract：With the use of pADxsi system， the recombinant adenovirus of expressing PDX1 and PAX4 is in place.GFP in the pShuttle-GFP-CMV vector is replaced with the target gene of PDX1 obtained from the pEGFP-N1-PDX1 plasmid， resulting in the pShuttleCMV-PDX1 plasmid. With the pEGFP-N1-PAX4 plasmid cut off， PAX4 is inserted into pShuttle-CMV-PDX1 to acquire the pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4 plasmid. Afterwards， the CMV-PDX1/CMV-PAX4 fragment is transferred to the ADxsi skeleton vector to get the pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 virus vector. Finally， the recombinant adenovirus is packaged， amplificated， and titrated in HEK293 cells for the infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The structure of pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 adenovirus expression vector is confirmed by means of a restriction analysis and PCR. RT-PCR and Western blot results have established that the target genes are persistently expressed in the infected cells.The recombinant human PDX1 and PAX4 expressing adenovirus is successfully constructed， packaged， and amplificated.The target genes can be continuously presented in mesenchymal stem cells.

Key words：adenovims vector；pancreatic and duodenal homeobox factor 1；paired box gene 4；mesenchymal stem cells

糖尿病是由于胰島β細(xì)胞功能絕對(duì)或相對(duì)缺陷，以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病[1-2]。長(zhǎng)期血糖增高，可導(dǎo)致大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經(jīng)、眼睛、足等，每年因糖尿病死亡者有一半以上是心腦血管所致，10%是腎病變所致；因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍[3-4]。因此，預(yù)防糖尿病的并發(fā)癥并最終控制血糖是重要的社會(huì)問(wèn)題。

至目前為止，控制患者血糖仍主要是依賴每天胰島素的補(bǔ)充，給患者生活帶來(lái)極大的不便與沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。尋找具有合成與分泌胰島素的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療一直是研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能且無(wú)免疫原性，是一類極具應(yīng)用潛能的干細(xì)胞[4-5]。胰十二指腸同源框基因1 （pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX 1）在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島素分泌細(xì)胞分化的功能[6]；此外，還具有維持胰島β細(xì)胞合成與分泌胰島素的功能[7-8]；然而，單獨(dú)的PDX1轉(zhuǎn)錄因子并不能有效誘導(dǎo)干細(xì)胞定向向胰島β細(xì)胞分化，在胰腺前體分化與發(fā)育過(guò)程中，成對(duì)盒基因4（paired box gene 4，PAX4）表達(dá)將有利于胰腺前體細(xì)胞定向向β細(xì)胞分化，并參與調(diào)控β細(xì)胞功能的成熟[8-10]。因此，PDX1與PAX4聯(lián)合作用對(duì)誘導(dǎo)MSCs定向向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細(xì)胞可能具有促進(jìn)作用，基于這一假設(shè)，在本研究中，選用對(duì)MSCs具有較高感染效率的Ⅴ型腺病毒載體，構(gòu)建攜帶目的基因PDX1與PAX4的重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4，感染MSCs細(xì)胞，以觀測(cè)所攜帶的目的基因表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究PDX1與PAX4在誘導(dǎo)MSCs向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細(xì)胞分化的可能及其分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料與試劑

Bgl II等多種限制性內(nèi)切酶、Klenow及T4 DNAligase均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；CIP（Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal）酶、質(zhì)粒提取純化試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司；腺病毒pADxsi載體系統(tǒng)由上海漢恒生物有限公司提供；293細(xì)胞及DH5a菌株由深圳清華研究院鄭義博士惠贈(zèng)，pEGFP-N1-PAX4與pEGFP-N1-PDX1質(zhì)粒為前期本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建。Anti-PAX4 antibody （ab42450）/IgG、Anti-PDX1 antibody （ab47383）/IgG購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)羊抗兔IgG、FITC標(biāo)羊抗兔IgG、CY5標(biāo)羊抗鼠IgG購(gòu)自eBioscience公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；RT-PCR試劑盒為北京天恩澤公司； DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Hyclone公司。原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司。

1.2方法

1） pADxsi-CMV- PDX1/CMV- PAX4腺病毒載體的構(gòu)建。 首先構(gòu)建pShuttle-GFP-CMV- PDX1穿梭質(zhì)粒：已知PDX1序列上游有Nhe I和Bgl II酶切位點(diǎn)，下游有Sal I和EcoR I酶切位點(diǎn)，首先用Sal I酶切pEGFP-N1- PDX1，再用Klenow平端處理，最后用Nhe I酶切，回收0.66 kb片段；其次用Nhe I和Pme I雙酶切pShuttle-GFP-CMV載體，替換GFP， CIP去磷酸化處理，回收載體片段5.2 kb；最后，酶連切好的載體片段和插入片段，獲得pShuttle-CMV-PDX1。再構(gòu)建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質(zhì)粒載體：從pEGFP-N1-PAX4上用BamH I和Sal I雙酶切切下PAX4（PAX4序列上游存在BamH I和Bgl II酶切位點(diǎn)，下游存在Xba I和Sal I酶切位點(diǎn)）；同時(shí)對(duì)pShuttle-CMV- PDX1載體用BamH I和 Sal I雙酶切，CIP去磷酸化處理，膠分別回收與純化載體與酶切PAX4目的基因片段并用T4 DNA 連接酶酶連得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質(zhì)粒。最后用T4 DNA 連接酶酶連目的片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4和pADxsi骨架質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并轉(zhuǎn)染DHSa，擴(kuò)增pADxsi -CMV-PDX1/CMV- PAX4質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)物進(jìn)行提取并進(jìn)行電泳簽定，產(chǎn)物由上海豐恒生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2） 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增和滴度測(cè)定。 Pac I酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度約80%的293細(xì)胞。3～5 d后，開(kāi)始出現(xiàn)明顯噬斑，待大部分細(xì)胞病變（cyto-pathic effect，CPE）時(shí)，收集細(xì)胞混懸液，于-80℃/25℃反復(fù)凍融3次，再離心收集上清，繼續(xù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒以提高腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4）滴度，TCID 50法測(cè)定病毒滴度。

3） ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs與目的基因表達(dá)。 于六孔板接種MSCs細(xì)胞5.0×105/孔，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，按感染指數(shù)為10PFU/細(xì)胞、50PFU/細(xì)胞、100PFU/細(xì)胞加入相應(yīng)量的腺病毒液；同時(shí)設(shè)ADxsi-CMV-GFP感染的空病毒對(duì)照組。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到相應(yīng)階段時(shí)，即培養(yǎng)到24h、48h和72h等階段分別收集細(xì)胞行WB、免疫細(xì)胞化學(xué)與間接熒光檢測(cè)；同時(shí)RT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)，引物分別如下PDX1 的F：5′-AAGCTAGCCCGCAGCCATGA-3′、R：5′-TCCTCGAGTCATCGTGGTTCCTG-3′，Tm為61.5℃，擴(kuò)增目的片段為882bp；PAX4：F：5′-TCCCAGTGTCTCCTCCATC-3′、R：5′-ACCTTTCCGGTGCTGTTGC-3′，Tm為60 ℃，擴(kuò)增目的片段為515 bp；內(nèi)參照分子GAPDH：F：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′、R： 5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′。

（4）Western blotting檢測(cè)

胰酶消化，收集目的細(xì)胞，裂解細(xì)胞并離心取上清液，應(yīng)用15%的SDS-PAGE膠電泳2h后，濕轉(zhuǎn)移法至PVDF膜，脫脂牛奶TBST液封閉1h，再分別加抗人PAX4、PDX1抗體IgG液振蕩過(guò)夜，HRP標(biāo)記相應(yīng)二抗親合反應(yīng)后ECL顯色。

2結(jié)果

2.1鑒定重組腺病毒質(zhì)粒

Xho I酶切pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4病毒質(zhì)粒，陽(yáng)性克隆pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4由以下6條帶組成即：14 kb、11.8 kb、5.9 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；而陰性克?。╬ADxsi骨架質(zhì)粒）只有以下6條帶組成：14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；酶切結(jié)果陽(yáng)性質(zhì)粒均與理論預(yù)期一致，具體酶切結(jié)果（見(jiàn)圖1）。

2.2重組腺病毒的包裝和滴度測(cè)定

Pac I酶切線性化的pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后3 d，開(kāi)始出現(xiàn)病變效應(yīng)（見(jiàn)圖3）。120 h后，此時(shí)約70%細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞與上清液體，凍融后，再應(yīng)用293細(xì)胞重復(fù)擴(kuò)增、收集病毒液?？瞻哂?jì)數(shù)法（PFU）測(cè)定病毒滴度為1.0×108 PFU/mL；使用同樣方法測(cè)定對(duì)照組?？蛰d腺病毒ADxsi的滴度為2.0×108 PFU/mL。

2.3 目的基因表達(dá)

MSCs在光學(xué)顯微鏡下呈典型的長(zhǎng)梭形，呈漩渦狀或放射狀平行排列（見(jiàn)圖4）； ADxsi-CMV-GFP空病毒感染后24 h即可在熒光鏡下觀察到GFP表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色與間接熒光分別證實(shí)ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）=100感染目的細(xì)胞 （MSCs）24 h后，實(shí)驗(yàn)組MSCs的細(xì)胞核中即可檢測(cè)到PDX1與PAX4 mRNA；細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，PDX1與PAX4 主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性率高于75%。間接熒光同樣證實(shí)細(xì)胞核中PAX4（FITC）與PDX1 （CY5）均穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)圖4）。

轉(zhuǎn)染后光鏡下的細(xì)胞形態(tài)相同于正常的MSCs細(xì)胞形態(tài)，呈梭形排列，應(yīng)用ADxsi-CMV-EGFP空病毒感染細(xì)胞后，可見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)綠色熒光表達(dá)，分別應(yīng)用抗體檢測(cè)PDX1與PAX4表達(dá)與定位，熒光結(jié)果顯示PDX1與PAX4均定位于細(xì)胞核內(nèi)，且免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)也證實(shí)兩轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核內(nèi)，且穩(wěn)定表達(dá)。

2.4 目的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)

RT-PCR法與WB分別檢測(cè)重組腺病毒ADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4轉(zhuǎn)染后不同時(shí)段細(xì)胞內(nèi)目的基因mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：MSCs胞質(zhì)內(nèi)PDX1與PAX4 mRNA水平穩(wěn)定；進(jìn)一步Western blotting（WB）法檢測(cè)感染后12 d的細(xì)胞核內(nèi)PDX1與PAX4蛋白一直穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)圖5），提示重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4可以有效感染MSCs，且目的基因均能穩(wěn)定表達(dá)，這為后續(xù)研究目的基因在MSCs轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3討論

MSCs具有多向分化潛能，為探討MSCs分化為合成與分泌胰島素功能的胰腺β細(xì)胞，選用了在胰腺前體細(xì)胞向β細(xì)胞分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子PDX1與PAX4[8-11]，并構(gòu)建對(duì)MSCs具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能力的Ⅴ型腺病毒載體[12-13]，用PDX1換去示蹤基因EGFP，把PAX4基因插入到多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建并包裝成帶PDX1與PAX4雙目的基因的活性重組腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4），酶切結(jié)果與測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組腺病毒構(gòu)建成功，目的基因連接正確。

應(yīng)用ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs結(jié)果顯示，重組病毒可以穩(wěn)定高效感染MSCs，間接熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的MSCs在細(xì)胞核穩(wěn)定表達(dá)PDX1與PAX4分子，細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果同樣證實(shí)PDX1與PAX4分子定位于在MSCs細(xì)胞核內(nèi)，這提示帶PDX1與PAX4轉(zhuǎn)錄因子基因的重組腺病毒不僅可以高效感染目的細(xì)胞，并且穩(wěn)定表達(dá)目的轉(zhuǎn)錄因子，而且所帶的轉(zhuǎn)錄因子均具有核定位功能。

另一方面應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄重組腺病毒的MSCs細(xì)胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平表明目的基因在重組腺病毒感染細(xì)胞后仍可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA水平穩(wěn)定，提示在腺病毒的CMV啟動(dòng)子的作用下，目的基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步抽提感染腺病毒的MSCs的細(xì)胞核蛋白，并行WB檢測(cè)PDX1和PAX4轉(zhuǎn)錄因子蛋白水平，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核水平穩(wěn)定，這一方面提示腺病毒的CMV啟動(dòng)子具有強(qiáng)的啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄功能，另一方面，目的轉(zhuǎn)錄因子穩(wěn)定定位于細(xì)胞核，說(shuō)明表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子具有核定位能力。的并且能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄與表達(dá)PDX1與PAX4分子。

綜上檢測(cè)結(jié)果證實(shí)， PDX1與PAX4雙帶目的基因的Ⅴ型重組腺病毒被成功構(gòu)建，重組腺病毒所帶的目的基因均能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄與翻譯成功能轉(zhuǎn)錄因子PDX1與PAX4，且兩功能轉(zhuǎn)錄因子均具有核定位功能，這為下一步研究2功能轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)MSCs定向向胰腺β細(xì)胞分化過(guò)程中的功能與分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：何學(xué)華吳曉紅）