劉勝桃，秦思文，鮑曉鳳，關(guān)蘊(yùn)杰，高然，李艷玲，朱璐

（蒙牛乳業(yè)（沈陽）有限責(zé)任公司，遼寧沈陽110122）

TTC在乳及乳制品菌落總數(shù)檢測中的應(yīng)用

劉勝桃，秦思文，鮑曉鳳，關(guān)蘊(yùn)杰，高然，李艷玲，朱璐

（蒙牛乳業(yè)（沈陽）有限責(zé)任公司，遼寧沈陽110122）

檢測乳及乳制品菌落總數(shù)，為達(dá)到菌落在培養(yǎng)基中清晰可辨，在平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中添加2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）。以滅菌乳、發(fā)酵乳、冰淇淋為樣品基質(zhì)，分別加入適當(dāng)菌含量的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽胞桿菌工作菌懸液，制備適當(dāng)濃度的TTC平板計數(shù)瓊脂，同時以不添加TTC的平板計數(shù)瓊脂作為對照，對同一樣品進(jìn)行菌落計數(shù)并同國標(biāo)方法結(jié)果進(jìn)行對比。TTC平板計數(shù)瓊脂終濃度在0.001%～0.002%時能夠使菌落顯色，且與不添加TTC的對照組對比結(jié)果一致。在檢測成分復(fù)雜的乳及乳制品樣品時添加適宜濃度的TTC，有助于菌落的辨認(rèn)，能夠提高檢驗人員菌落計數(shù)的準(zhǔn)確性，可用于檢測乳及乳制品中菌落總數(shù)。

2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）；乳及乳制品；菌落總數(shù)；檢測；平板計數(shù)瓊脂

菌落總數(shù)是評價食品衛(wèi)生情況、新鮮程度及污染程度最常用的指標(biāo)之一[1]。作為一方實驗室，準(zhǔn)確的檢測結(jié)果是實驗室檢測水平的重要體現(xiàn)，提供的數(shù)據(jù)能為生產(chǎn)過程提供指導(dǎo)方向，提升實驗室在客戶中的信譽(yù)度和權(quán)威性。目前國內(nèi)采用的菌落計數(shù)方法有國標(biāo)平板計數(shù)法、紙片法[2-3]。隨著中國乳業(yè)的迅速發(fā)展，消費(fèi)觀念逐漸成熟以及強(qiáng)烈的市場需求，乳制品產(chǎn)品種類日益豐富，如酸牛乳、調(diào)制乳、乳粉、冰淇淋等，為了豐富口感有些產(chǎn)品中添加了果粒、果醬、谷物等成分，使得產(chǎn)品基質(zhì)變得復(fù)雜，檢測時由于樣品中部分成分不能溶解，計數(shù)時易與菌落發(fā)生混淆，為菌落總數(shù)檢測工作增加了難度。

2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）是四唑鹽，細(xì)菌能將含有偶氮基的四唑鹽還原成甲臜，即細(xì)菌能把TTC還原成紅色甲臜形成紅色菌落[4-6]，菌落與顆粒就能明顯被區(qū)分開。但TTC濃度過高會抑制細(xì)菌的生長，因此確定TTC的使用濃度是保證檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性的重要前提，《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007版）中明確注明為便于區(qū)分化妝品中顆粒與菌落，可在營養(yǎng)瓊脂中加入TTC溶液[7]。也有學(xué)者認(rèn)為TTC添加濃度0.2%為宜[8]。因TTC的添加濃度說法不一，影響因素較多，本試驗以滅菌乳、巴氏殺菌熱處理風(fēng)味酸牛奶、冰淇淋為試驗樣品，并添加大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽胞桿菌，在平板計數(shù)瓊脂中加入不同濃度的TTC溶液分別進(jìn)行試驗，同時與國標(biāo)法進(jìn)行對比，研究不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂對乳及乳制品菌落計數(shù)的影響，確定最適宜的TTC添加濃度，用于檢測乳及乳制品中菌落總數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與樣品來源

大腸埃希氏菌（Escherichia coli ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus ATCC 6538）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212）、枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis ATCC 6633），均來自于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心。

試驗樣品（滅菌乳、巴氏殺菌熱處理風(fēng)味酸牛奶、冰淇淋）均由蒙牛乳業(yè)提供。

1.1.2 主要儀器與試劑

生物安全柜HR40-ⅡA2：青島海爾特種電器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱SKP-02B：黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；漩渦混合器MS3 basic：上海精密儀器儀表有限公司。

平板計數(shù)瓊脂（CM101）、4%TTC溶液1mL/支（P-79A），以上培養(yǎng)基及試劑均來自于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工作菌株制備

將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)儲存菌株，分別加入10mL胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）中，于（36±1）℃培養(yǎng)18 h～24 h后劃線胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板，對菌種純度、形態(tài)特征及生化特征進(jìn)行確認(rèn)。將經(jīng)確認(rèn)的典型菌落作為工作菌株使用。

1.2.2 TTC平板計數(shù)瓊脂制備

使用商品化平板計數(shù)瓊脂（CM101），按培養(yǎng)基標(biāo)簽要求進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備。待培養(yǎng)基冷卻至47℃～50℃時，以無菌操作加入4%TTC溶液，使培養(yǎng)基終濃度分別為：0.000 2%、0.000 4%、0.000 6%、0.000 8%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%，混勻后置于（46±1）℃水浴鍋中備用。

1.2.3 含菌樣品的制備

人格的定義為個體思考、感知和行為的特有模式。心理學(xué)家通過查閱字典，將幾千個對人性格評價的詞匯歸納總結(jié)出五種主要的性格特質(zhì)。這五種特質(zhì)幾乎可以全面涵蓋人格的不同維度。通過多年的樣本實驗，大五人格已經(jīng)成為心理學(xué)公認(rèn)的理解人格最好的模型之一。該理論將所有的人格特質(zhì)分為主要的五個維度:盡責(zé)性、外向性、宜人性、情緒穩(wěn)定性以及外向性。

將4種工作菌液進(jìn)行系列稀釋，取10-4、10-5、10-6稀釋度菌液各1mL，分別加入試驗樣品中（滅菌乳、巴氏殺菌熱處理風(fēng)味酸牛奶、冰淇淋），使最終樣品菌含量在20CFU/mL～200CFU/mL之間。

1.2.4 操作步驟

取樣品25 g加入225mL生理鹽水中，可均質(zhì)處理，制成體積比為1∶10的樣品勻液。吸取體積比為1∶10稀釋樣品勻液1mL注入9mL稀釋液中，混合制體積比為1∶100稀釋的樣品勻液。依次制備10倍系列稀釋樣品勻液。選擇3個適宜稀釋度，各吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，做平行檢測，同時作空白對照。將15 mL～20mL冷卻至46℃的TTC平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基和不含TTC的平板計數(shù)瓊脂傾注平皿，混合均勻。待瓊脂凝固后，于（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長情況

大腸埃希氏菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長情況如表1所示。

表1 大腸埃希氏菌在不同TTC濃度平板計數(shù)瓊脂生長試驗結(jié)果Table1 Thegrow th of Escherichia coliin different concentration of TTC platecountagar

大腸埃希氏菌在終濃度為0.000 4%～0.000 8%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，菌落顏色較淺呈淡粉色，指示作用不明顯，菌落數(shù)量較對照組無明顯差異；大腸埃希氏菌在終濃度為0.001%～0.010%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，顏色呈粉紅色到紫紅色，有助于菌落辨認(rèn)，且菌落數(shù)量較對照組無明顯差異（lg差小于r，r=0.25）；當(dāng)TTC濃度≥0.02%時菌落生長情況受到了不同程度的抑制，且菌落數(shù)量較對照組明顯減少。

2.2 金黃色葡萄球菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長情況

金黃色葡萄球菌對TTC較敏感，在終濃度為0.000 4%～0.000 8%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，菌落顏色較淺呈淡粉色，指示作用不明顯，菌落數(shù)量較對照組無明顯差異；黃色葡萄球菌在終濃度為0.001%～0.002%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，顏色呈粉色到紅色，菌落清晰可辨，且菌落數(shù)量較對照組無明顯差異（lg差小于r，r=0.25）；當(dāng)TTC濃度在0.004%～0.08%時菌落生長情況受到了明顯的抑制，且菌落數(shù)量較對照組明顯減少，當(dāng)TTC濃度≥0.01%時金黃色葡萄球菌即被完全抑制不能生長。

表2 金黃色葡萄球菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長試驗結(jié)果Table2 Thegrow th of Staphylococcusaureus in different concentration of TTC plate countagar

2.3 糞腸球菌在不同TTC濃度平板計數(shù)瓊脂生長情況

糞腸球菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長情況如表3所示。

表3 糞腸球菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長試驗結(jié)果Table3 Thegrow th of Enterococcus faecalis in different concentration of TTC plate countagar

糞腸球菌與大腸埃希氏菌生長情況相似，在終濃度為0.000 4%～0.000 8%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，菌落顏色較淺呈淡粉色，指示作用不明顯，菌落數(shù)量較對照組無明顯差異；糞腸球菌在終濃度為0.001%～0.01%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，顏色呈粉紅色到紫紅色，菌落清晰可辨，且菌落數(shù)量較對照組無明顯差異（lg差小于r，r=0.25）；當(dāng)TTC濃度≥0.02%時菌落生長情況受到了不同程度的抑制，且菌落數(shù)量較對照組明顯減少。

2.4 枯草芽孢桿菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長情況

枯草芽孢桿菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長情況如表4所示。

枯草芽孢桿菌在終濃度為0.000 4%～0.000 8%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，菌落顏色較淺呈淡粉色，指示作用不明顯，菌落數(shù)量較對照組無明顯差異；枯草芽孢桿菌在終濃度為0.001%～0.01%的TTC平板計數(shù)瓊脂上菌落生長良好，顏色呈粉色到紫紅色，且菌落中心顏色較深更有助于單個菌落的辨認(rèn)，減少由于菌落重疊而引起的計數(shù)誤差，且菌落數(shù)量較對照組無明顯差異（Lg差小于r，r=0.25）；當(dāng)TTC濃度≥0.02%時菌落生長情況受到了不同程度的抑制，且菌落數(shù)量較對照組明顯減少。

表4 枯草芽孢桿菌在不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂生長試驗結(jié)果Table4 Thegrow th of Bacillussubtilis in different concentration of TTC plate countagar

2.5 小結(jié)

通過2.1-2.4試驗，使用TTC平板計數(shù)法對乳及乳制品中大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽胞桿菌分別進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示TTC平板計數(shù)瓊脂終濃度適宜范圍為0.001%～0.002%（含0.001%和0.002%），在該濃度下能很好的使菌落顯色，同時又不會抑制細(xì)菌生長。

2.6 準(zhǔn)確度

使用國標(biāo)方法及TTC法（TTC平板計數(shù)瓊脂終濃度0.002%）分別對25組人工污染的乳及乳制品進(jìn)行菌落總數(shù)測定，利用T檢驗法分析檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，T臨界值=2.06（a=0.05），T計算值=0.054，T計算值＜T臨界值，兩組數(shù)據(jù)無顯著差異，如表5所示。

表5 TTC法與國標(biāo)方法測定乳及乳制品菌落總數(shù)結(jié)果Table5 The determ ination resultsof conloniesnumber of TTC and nationalstandardmethod inm ilk and dairy products CFU/mL（g）

3 結(jié)論與討論

在食品的加工、貯藏、運(yùn)輸過程中被污染的細(xì)菌種類很多，包括致病菌，條件致病菌和非致病性細(xì)菌[9]試驗選取革蘭氏陰性菌代表種-大腸埃希氏菌及革蘭氏陽性菌代表種-金黃色葡萄球菌（代表葡萄球菌屬）、糞腸球菌（代表鏈球菌屬）、枯草芽孢桿菌（代表芽孢桿菌屬）。試驗結(jié)果表明TTC指示劑對革蘭氏陽性菌的抑制性較革蘭氏陰性菌略強(qiáng)。其中金黃色葡萄球菌對TTC最為敏感，當(dāng)TTC平板計數(shù)瓊脂終濃度在0.000 2%～0.002%時生長良好，當(dāng)TTC平板計數(shù)瓊脂終濃度≥0.004%時即會對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生不同程度的抑制[7]。大腸埃希氏菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌在TTC平板計數(shù)瓊脂終濃度0.000 2%～0.01%時生長良好，當(dāng)TTC平板計數(shù)瓊脂終濃度≥0.02%時產(chǎn)生不同程度的抑制[10]。本次試驗證明在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的TTC能夠易于鑒別菌落，并且不影響細(xì)菌本身的生長繁殖[11]。

TTC平板計數(shù)法檢測乳及乳制品中大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽胞桿菌，TTC指示劑終濃度適宜范圍為0.001%～0.002%（含0.001%和0.002%），在該濃度下能很好的使菌落顯色，同時又不會抑制細(xì)菌生長。

本方法與測試片一類的商品化快速培養(yǎng)基相比，其檢測流程更接近于傳統(tǒng)的國標(biāo)方法，能夠為菌落提供足夠的生長空間，更有利于對菌落形態(tài)的觀察。成本低廉，操作簡便，且靈敏度高，菌落在TTC平板計數(shù)瓊脂上呈粉紅色至紅色，部分芽孢菌落還會產(chǎn)生紅色中心，在檢測成分復(fù)雜的乳及乳制品樣品時有助于菌落的辨認(rèn)，能夠提高檢驗人員菌落計數(shù)的準(zhǔn)確性，可用于檢測乳及乳制品中菌落總數(shù)。

[1]張倩.食品微生物檢驗中菌落總數(shù)測定的分析[J].食品工程,2011 (1):13-14

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB4789.2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010: 1-5

[3] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T1897-2007食品中菌落總數(shù)的測定PetrifilmTM測試片法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007:1-14

[4]盛長江,李金強(qiáng).TTC-指示劑在菌落計數(shù)中應(yīng)用的探討[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,1994,17(5):91-92

[5] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellgrowth andsurvival:application toproliferation and cytotoxicity assays[J].JImmunolMethods,1983,65(2):55-63

[6] Ignacio MV,Felipe G,Luciano R,etal.Aromatic-Aromatic interaction between 2,3,5-Triphenyl－2H-tetrazolium chloride and poly (sodium 4-styrenesulfonate)[J].Phys Chem B,2007,111(22):6146－6150

[7] 趙同剛.化妝品衛(wèi)生規(guī)范[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2007: 268

[8]楊慶文,國譯丹,周惠新,等.不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂細(xì)菌生長試驗觀察[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22(1):62-63

[9] 郁慶福,楊均培.衛(wèi)生微生物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1984: 28－30

[10]劉曉穎,馮二凱,吳洪超,等.細(xì)菌菌落計數(shù)培養(yǎng)基TTC濃度的篩選研究[J].特產(chǎn)研究,2015(2):1-4

[11]劉弋青,呂維敏,劉魁武,等.基于濾膜上細(xì)菌直接計數(shù)法的細(xì)菌總數(shù)快速檢測[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,2009(1):60-62

The Application of TTC in the Detection of Conlonies Number of M ilk and Dairy Products

LIUSheng-tao，QINSi-wen，BAOXiao-feng，GUANYun-jie，GAORan，LIYan-ling，ZHU Lu
（Mengniu Dairy Industrial（Shenyang）Co.Ltd.，Shenyang110122，Liaoning，China）

In order to achieve the clear colony in themedium，we detect the totalnumberof coloniesofmilk and dairy products by adding 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloridechloride（TTC）into plate count agar culture medium supplemented.Compared with the national standard method，we use the same samples.This experimentused sterilizationmilk，fermentedmilk，ice cream as the samplematrix，and added appropriate contentof Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis，bacillus coli bacteriasuspensionrespectively，which is aim to the preparation of appropriate concentration of TTC Plate Count Agar.At the same time，the plate countagarwithout TTCwasused as the controlgroups in this test.The concentration of TTC plate countagarbetween 0.001%and 0.002%，canmake the colony color，and the resultswere consistentwith the control groupwhich did notadd TTC.Theappropriate concentration of TTC indicatorwasapplied to the detection of totalbacterial count inmilk and dairy products，which isnotonly helpful to identify the colony，butalso can improve theaccuracy of the countof the colony count.

2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride；milk and milk products；the total number of colonies；detection；plate countagar

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.032

2016-08-29

劉勝桃（1986—），女（漢），本科，研究方向：乳及乳制品微生物學(xué)。