王新杰1，許 欣，黃 磊2，魏金葉1

(1.濰坊市公安局，山東 濰坊 261061；2.山東省公安廳，濟(jì)南 250001)

山東漢族人群63個Y-STR基因座突變觀察及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

王新杰1，許 欣1,*，黃 磊2，魏金葉1

(1.濰坊市公安局，山東 濰坊 261061；2.山東省公安廳，濟(jì)南 250001)

目的 調(diào)查分析山東漢族人群63個Y-STR基因座的突變情況，并評價其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。方法 收集山東漢族人群1020對父子共2040份男性血樣，采用自行設(shè)計引物，對63個Y-STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測，統(tǒng)計各基因座的突變情況。對DYS481基因座使用PowerPlexY23引物與自行設(shè)計引物分別擴(kuò)增，進(jìn)行分型一致性檢驗。結(jié)果 1020對父子在其中53個基因座上共檢出 244 次等位基因突變，平均突變率為3.8×10-3（95 % CI 3.3×10-3～4.3×10-3）,其中突變率最高的DYS713為18.6×10-3（95 % CI 11.3×10-3～28.9×10-3），突變率最低的DYS438等10個基因座為0.98×10-3（95% CI 0～5.5×10-3），絕大多數(shù)突變?yōu)橐徊酵蛔儯?1.8 %），符合逐步突變的遺傳規(guī)律，等位基因增加突變與等位基因減少突變比接近1:1。1020對父子中有214對父子在53個基因座上共觀察到244次突變，其中一步突變224次，二步突變9次，三步突變2次，其他突變類型9次；176對父子僅1個基因座發(fā)生突變。使用兩套引物，DYS481基因座在1020對父子中有1018對得到一致的分型結(jié)果，一致性為99.8 %。結(jié)論 本文63個Y-STR基因座中的高突變基因座在近親個體識別時有一定作用，但在Y-STR數(shù)據(jù)庫家系查詢與父系鑒定應(yīng)用中應(yīng)予以注意。進(jìn)行同一認(rèn)定及親緣鑒定時，同一案件應(yīng)使用相同的引物序列。

法醫(yī)物證學(xué)；Y-STR；突變率

Y染色體STR的單倍型父系遺傳特點(diǎn)在諸如父系家族的親權(quán)鑒定、男女混合或多人份男性混合斑中男性個體分型以及追溯父系遷移歷史等方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價值。Y染色體的檢驗已被廣泛應(yīng)用于各類刑事案件，Y-STR基因座多態(tài)性及突變情況逐漸受到重視[1-4]。本文針對山東漢族人群，采用自行設(shè)計引物，調(diào)查了63個Y-STR基因座的基因突變情況，為法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定、數(shù)據(jù)庫建設(shè)和家系排查等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本及DNA提取

1020對父子共2040份男性血樣本，為山東地區(qū)用于落戶的三聯(lián)體親子鑒定中的父-子樣本，且父-子均通過常染色體STR檢驗確定了親子關(guān)系。

1.2 引物及標(biāo)記

Y-STR基因座命名及堿基序列查自NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）及相關(guān)文獻(xiàn)[1-8]。設(shè)定所選目標(biāo)基因座的片段大小范圍后，在目標(biāo)重復(fù)序列兩側(cè)用Primer Express?Software Version 3.0設(shè)計引物，引物由上海生物工程有限公司合成,正向引物標(biāo)記。經(jīng)單基因座引物篩選和復(fù)合擴(kuò)增參數(shù)優(yōu)化，使各基因座擴(kuò)增產(chǎn)物基本達(dá)到平衡、特異的要求，最終建立YI、YII兩個多重復(fù)合擴(kuò)增體系。為檢驗不同引物的分型一致性，兩個復(fù)合擴(kuò)增體系均選擇了DYS481基因座，其中YI體系中的引物為自行設(shè)計，YII體系中的引物與Promega公司PowerPlexY23中的該基因座引物一致，YI體系中擴(kuò)增片段比YII體系中長300bp。

YI：DYS456、DYS389I、DYS437、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS522、DYS549、DYS576為6-FAM，DYS460、DYS458、、DYS622、DYS390、DYS392、DYS448、DYS449、DYS643為 HEX，DYS391、Y-GATA-H4、DYS388、DYS19、DYS385a/b、DYS527a/b 、DYS533為 TAMRA，DYS393、DYS459a/b、DYS635、DYS439、DYS570、DYS627、DYS444、DYS481為ROX。

YII：DYS426、DYS481、DYS630、YPENTA1＊、DYS518II、YPENTA2＊、DYS443為6-FAM，DYS531、Y-GATA-A10、DYS587、DYS593、DYS722、DYS713、DYS645、DYF411S1＊＊為HEX，DYS446、DYS505、DYS607、DYS708、DYS557、DYS707、DYS520為 TAMRA，DYS434、DYS510、 DYS709、DYS552、DYS596、DYS508為ROX。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物分型檢測

PCR直擴(kuò)程序同STRtyper-27Y?試劑盒（海爾施基因科技有限公司）?？傮w積10 μ L，其中2×Buffer 5 μ L，引物混合物2 μL，bufferII(酶混合物)2 μL，純水1 μ l，0.5 mm血卡一片。使用STRtyper-27Y?試劑盒matrix標(biāo)準(zhǔn)品對3130XL測序儀進(jìn)行光譜校正，以007、9948的分型結(jié)果作為對照，自行制備Ladder并編寫panel及Bin，用GeneMapperID3.2軟件進(jìn)行基因分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

分析1020對父子對樣本Y-STR基因座分型，統(tǒng)計等位基因傳遞次數(shù)與出現(xiàn)突變次數(shù)，其中多拷貝基因座的等位基因傳遞次數(shù)則統(tǒng)計為相應(yīng)拷貝數(shù)，用網(wǎng)站（http://statpages.org/ confi nt.html)方法計算突變率以及95 % CI（可信區(qū)間）值。

2 結(jié)果

DYS481基因座核心重復(fù)序列為[CTT]n，本研究在YI、YII兩個復(fù)合擴(kuò)增體系中均選用了此基因座，但長度相差300 bp,目的是為了檢測不同引物分型結(jié)果的一致性。結(jié)果1020對父子中有1018對在兩個體系中均得到一致的分型結(jié)果，一致性為99.8 %，與文獻(xiàn)[9]報道相似；有兩對父子在同一體系中分型一致、但在不同體系中分型不一致，YII復(fù)合體系分型為22，YI復(fù)合體系分型為23.1，分析YI復(fù)合體系的DYS481擴(kuò)增片段在引物結(jié)合區(qū)之間的重復(fù)區(qū)側(cè)翼序列上有4個堿基插入，有待測序證實(shí)。這提示我們在進(jìn)行同一認(rèn)定及親緣鑒定時，同一案件應(yīng)使用相同的引物序列。

1020對父子樣本中，806對父子未觀察到突變（79.019 %），214對父子觀察到突變（20.98 %）。在1020對父子中， 176對表現(xiàn)為一個基因座出現(xiàn)一步突變，占17.255 %，與未突變父子對累計占總觀察數(shù)的96.275 %。在另外38對父子突變中，有19對觀察到2個基因座出現(xiàn)一步突變，一對觀察到3個基因座出現(xiàn)一步突變，7對觀察到1個基因座出現(xiàn)二步突變，3對觀察到2個基因座一步、二步突變各出現(xiàn)一次， 2對觀察到1個基因座出現(xiàn)三步突變，其他突變形式見表1，沒有觀察到四個以上基因座同時出現(xiàn)突變。

1020對父子樣本除DYS392等10個基因座未發(fā)現(xiàn)基因突變外，在其他53個基因座上共檢出 244次等位基因突變，平均突變率為3.8×10-3（95 % CI3.3×10-3～4.3×10-3）。其中突變率最高的DYS713為18.6×10-3（95 % CI 11.3×10-3～28.9×10-3），突變率最低的DYS438等10個基因座為0.98×10-3（95% CI 0～5.5×10-3）。在檢測出的244 次突變中，絕大多數(shù)突變?yōu)橐徊酵蛔儯?1.8 %），符合逐步突變的遺傳規(guī)律?？傮w上一步突變中n+1突變（50.9 %）略高于n-1突變（49.1 %），但在每個基因座中表現(xiàn)差異很大，如高突變基因座DYS576中n-1突變占75 %，而DYS449基因座n+1突變則占75 %，所發(fā)現(xiàn)的二步、三步突變均為減少重復(fù)單位突變（表2）。實(shí)驗中在單拷貝基因座上發(fā)現(xiàn)了單帶→雙帶突變、雙帶→單帶突變、單帶→譜帶缺失突變，雙拷貝基因座發(fā)現(xiàn)了單帶→雙帶以及雙帶→單帶、三帶突變甚至雙帶→譜帶缺失突變。DYS385a/b、DYS527a/b、DYS459a/ b、DYF411S1＊＊等雙拷貝基因座，在所檢驗樣本中，發(fā)現(xiàn)有些個體出現(xiàn)了三、四個擴(kuò)增片段，有些個體出現(xiàn)譜帶缺失。除上述4個雙拷貝基因座外，55個單拷貝基因座有部分基因座在一些個體檢出兩個擴(kuò)增片段，而DYS448等多個基因座檢出譜帶缺失，類似情況已有文獻(xiàn)報道[10-11]，上述現(xiàn)象均可經(jīng)遺傳傳遞，但其發(fā)生原因有待染色體分析或測序證實(shí)。

表1 山東地區(qū)漢族人群1020對父子63個Y-STR基因座突變分布情況Table 1 Allele mutations distribution of 1020 father-son pairs at 63 Y-STR loci in Shandong Han population

表2 山東地區(qū)漢族人群63個Y-STR基因座突變情況及基因多樣性對照表(n代表父親的重復(fù)單位數(shù))Table 2 Mutations of 63 Y-STR loci and their comparison of gene diversity in Shandong Han population (n=number of repeat units of father)

3 討論

本文63個基因座中除10個基因座未檢出突變外，其余53個基因座共檢出 244 次等位基因突變。53個突變基因座中DYS713突變率最高，為18.6×10-3（95 % CI 11.3×10-3～ 28.9×10-3）； 其次 是DYS576， 為15.7×10-3（95 % CI 9.0×10-3～25.3×10-3）；DYS438等10個基因座突變率最低，為 0.98×10-3（95 % CI 0～ 5.5×10-3）。63個 基 因座的平均突變率為3.8×10-3（95 % CI 3.3×10-3～4.3×10-3），與相關(guān)文獻(xiàn)報道的[12-16]美國白人突變率1.7×10-3（95 % CI 1.1×10-3～2.5×10-3）、黑人突變率3.0×10-3（95 % CI 2.2×10-3～4.0×10-3）及廣東漢族人群2.2×10-3（95 % CI 1.6×10-3～3.0×10-3）相比均要高，顯示不同人群間突變率可能有一定差異，也可能與本文涉及的高突變基因座較多有關(guān)。對山東漢族人群與廣東漢族人群突變調(diào)查所采用的共有的24個基因座分析發(fā)現(xiàn)，DYS630、DYS622、DYS449、DYS570、DYS481、DYS522、DYS557、Y-GATA-A10、DYS446、DYS459a/b等基因座在二個人群中突變率有明顯差異，如山東漢族人群的突變率分別為14.71×10-3、5.88×10-3、13.73×10-3、7.84×10-3、2.94×10-3、2.94×10-3、2.94×10-3、5.88×10-3、5.88×10-3、1.47×10-3，而在廣東漢族人群中，突變率[14]分別為7.5×10-3、0.0×10-3、2.5×10-3、3.75×10-3、5.0×10-3、0.0×10-3、0.0×10-3、2.5×10-3、2.5×10-3、0.0×10-3，此差異來自不同人群還是與抽樣有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究。

本文244次突變分析顯示，絕大多數(shù)突變?yōu)橐徊酵蛔儯?1.8 %），符合逐步突變的遺傳規(guī)律?？傮w上一步突變中n+1突變（50.9 %）略高于n-1突變（49.1%），但在每個基因座中表現(xiàn)差異很大，如高突變基因座DYS576中n-1突變占75 %，而DYS449基因座n+1突變則占75 %，具體原因尚不清楚。所發(fā)現(xiàn)的二步、三步突變均為減少重復(fù)單位突變，與復(fù)制時模板DNA鏈易發(fā)生滑脫有關(guān)。實(shí)驗中在單拷貝基因座發(fā)現(xiàn)的單帶→雙帶突變、雙拷貝基因座發(fā)現(xiàn)的單帶→雙帶、雙帶→單帶、三帶突變?yōu)閅染色體復(fù)制異常所致。而單帶、雙帶→譜帶缺失突變應(yīng)與引物結(jié)合區(qū)變異或大片段缺失有關(guān)，需染色體分析或測序證實(shí)。

在1020對父子中，由于基因突變，214對父子（20.98 %）可以用本研究使用的Y-STR基因座進(jìn)行區(qū)分，這一研究為一些涉及男性近親而只能檢出Y-STR分型的特殊案件提供了新思路。53個突變基因座中，DYS576(15.67 ‰)、DYS449(13.73 ‰)、DYS630(14.71 ‰)、DYS713(18.63 ‰)等突變率均超過10 ‰，此類基因座更適合于父子、兄弟等近親的同一認(rèn)定，而不宜用于親緣關(guān)系鑒定及Y-STR數(shù)據(jù)庫建設(shè)。而本次實(shí)驗沒有觀察到突變且GD值較高（如＞0.5）的DYS392、DYS448、DYS643、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596等基因座應(yīng)與商業(yè)化試劑盒選用的突變率低于或接近常染色體STR平均突變率（2‰）且GD值較高（如＞0.5）的DYS456、DYS437、DYS447、 DYS522、DYS460、DYS390、Y_GATA_H4、DYS19、DYS385a/b、DYS533、DYS393、DYS444、DYS481、DYS587、DYS557等基因座作為親緣關(guān)系鑒定及Y-STR數(shù)據(jù)庫建設(shè)的首選，并可增加符合上述要求的非商業(yè)化試劑盒中的DYF411S1＊＊、DYS505、DYS607、DYS708、DYS707、DYS520、DYS510等基因座。

綜上所述，本文63個Y-STR基因座中大多數(shù)基因座適合山東漢族人群法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中53個基因座觀察到突變，在Y-STR數(shù)據(jù)庫查詢及親緣關(guān)系鑒定中應(yīng)引起重視。該研究提供的多個多態(tài)性好、突變率低的基因座可用于Y-STR數(shù)據(jù)庫建設(shè)及親緣鑒定，同時確立了一批多態(tài)性好、突變率高的基因座用于特殊案件的個體識別。

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Mutations at 63 Y-STR Loci in Shandong Han Population and the Forensic Applicability

WANG Xinjie1, XU Xin1,*, HUANG Lei2, WEI Jinye1
(1. Weifang Public Security Bureau, Shandong, Weifang 261061 China; 2. Shandong Provincial Public Security Department, Jinan 250001, China)

Objective To investigate the mutations at 63 Y-STR loci in Shandong Han population and evaluate their forensic applicability. Methods Bloodstain samples of 1020 father-son pairs in Shandong Han population were DNA-typed by conducting YI and YII PCR multiplex amplification with a five-color fluorescence labeling 35 and 29 Y-STR loci. The mutations were calculated and the typing accuracy was checked by comparing the typing result of DYS481 from PowerPlexY23 primers with that of the designed primers. Results Among the 1020 father-son pairs, 244 mutations were detected from 53 genetic loci of 63 ones, the average mutation rate was 3.8×10-3(95 % CI 3.3×10-3～4.3×10-3) per locus. The highest mutation rate at DYS713 was 18.6×10-3(95% CI 11.3×10-3～28.9×10-3), the lowest mutation rate of ten loci was 0.98×10-3(95 % CI 0～5.5×10-3), and the vast majority of mutations was one-step mutation (91.8 %), in consistency with the gradual mutation of the genetic law, and the allele increase or decrease from the mutation was 1:1. 224 mutations were onestep event, 9 mutations were the two-step's, 2 mutations were three-step's, other mutations occurred 9 times. The mutat ions in 176 father-son pairs happened at single locus. 1018 pairs of 1020 father-son pairs got the consistent results using two sets of primers in DYS481 loci, the consistency was 99.8 %. Conclusion The loci of high mutation rate is effective for the individual identifi cation but should be cautious when the Y-STR database searching and patrilineal identifi cation are recruited. During the parentage determination and individual identifi cation, the same primers should be used for the same case.

forensic biological evidence; Y-STR; mutation rate

DF795.2

B

1008-3650(2016)05-0424-05

2015-08-03

格式：王新杰，許欣, 黃磊，等. 山東漢族人群63個Y-STR基因座突變觀察及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(5):424-428.

10.16467/j.1008-3650.2016.05.020

王新杰（1973—），男，山東昌邑人，學(xué)士，副主任法醫(yī)師，研究方向為法醫(yī)物證學(xué)。E-mail: wfxjfy@aliyun.com

* 通訊作者：許欣（1982—），男，山西太原人，學(xué)士，法醫(yī)師，研究方向為法醫(yī)物證學(xué)。E-mail:uiruir@aliyun.com