羋肖肖嚴(yán)健李圓施軍平

1杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺（杭州310015）

2杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（杭州310015）

·基礎(chǔ)研究·

順鉑誘導(dǎo)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞損傷及再生模型的建立

羋肖肖1嚴(yán)健1李圓2施軍平1

1杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺（杭州310015）

2杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（杭州310015）

目的 建立順鉑誘導(dǎo)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞損傷及再生模型。方法 采用順鉑溶液直接孵育斑馬魚方法，通過免疫組化、熒光特異性標(biāo)記側(cè)線細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚活體成像、原位雜交等方法統(tǒng)計分析順鉑處理前后斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞剩余情況以及藥物撤除后毛細(xì)胞再生情況。結(jié)果順鉑引起斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞丟失具有劑量依賴效應(yīng)，相同的孵育時間較高濃度的順鉑孵育后幾乎可殺死全部側(cè)線毛細(xì)胞；毛細(xì)胞再生與順鉑的毒性積累程度有關(guān)，較低濃度孵育較短時間毛細(xì)胞再生速度較快。毛細(xì)胞再生數(shù)目隨著時間的延長不斷增加，72小時后可再生原有數(shù)目的90%以上。結(jié)論 斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞經(jīng)不同濃度順鉑孵育不同時間后，其毛細(xì)胞丟失與再生具有劑量和時間依賴效應(yīng)。

順鉑，毛細(xì)胞損傷，毛細(xì)胞再生,劑量依賴效應(yīng)

感音神經(jīng)性聾是全球性問題，目前約有6億人單側(cè)或雙側(cè)聽力出現(xiàn)受損現(xiàn)象[1]，其中由藥物誘發(fā)的聽力受損問題正越發(fā)嚴(yán)重。順鉑是廣譜的實體癌癥治療藥物，特別是對頭頸癌、肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、睪丸癌等實體癌癥療效顯著[2]。耳毒性是順鉑治療癌癥患者過程中呈現(xiàn)的一個不容忽視的副作用，順鉑的耳毒性主要表現(xiàn)為耳蝸毒性，研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸的外毛細(xì)胞是順鉑首要的攻擊對象[3-5]。模式生物斑馬魚擁有研究毛細(xì)胞丟失和再生科學(xué)問題的獨有優(yōu)勢，如其體積小、產(chǎn)卵量高、身體透明以及側(cè)線毛細(xì)胞位于其身體表面等優(yōu)勢。斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞在形態(tài)和功能上與哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞高度相似，已有研究發(fā)現(xiàn)，一些哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞敏感的耳毒性刺激同樣可引起斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的損傷[6-8]。因此，我們的研究利用斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞探討耳毒性藥物順鉑殺死毛細(xì)胞后，后續(xù)毛細(xì)胞的再生情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：實驗所用野生型魚系均為Tübingen（簡稱TU），標(biāo)記側(cè)線細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚系來自北大張博教授饋贈，所有斑馬魚均飼養(yǎng)在恒溫28.5℃的水循環(huán)環(huán)境中，本研究所進(jìn)行的斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞損傷與再生的研究均以5天大斑馬魚幼魚為實驗起點[9]。順鉑（美國，Sigma,479306）；抗體rabbit anti-Myosin VI（美國，Proteus BioSciences,256791）；麻醉劑Tric?aine（美國，Sigma,E10521）；堿性磷酸酶抗地高辛抗體（瑞士，Roche,11093274910）。

1.2 順鉑溶液的配制：稱取粉末用養(yǎng)魚水配制成1mM儲液，避光室溫保存。使用時，按一定比例用養(yǎng)魚水稀釋到所用濃度，直接浸泡5天大斑馬魚幼魚，28.5℃避光放置。

1.3 斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞免疫組化標(biāo)記：參照Harris等報道的方法[6],10-15條斑馬魚用4%多聚甲醛室溫固定2小時或4℃過夜固定。取出后，經(jīng)PBS和ddH2O先后潤洗2次，加入丙酮-20℃處理10分鐘，后加入封閉液室溫封閉1小時左右。加入抗體rab?bit anti-Myosin VI（1:500）4℃過夜。第二天取出后用封閉液潤洗樣本，加入二抗Alexa Fluor?488 goat anti-rabbit IgG（H+L）（Invitrogen，1:200）室溫孵育6小時，再用封閉液潤洗，保存于PBS溶液中，Zeiss Axio A1倒置熒光顯微鏡成像。

1.4 斑馬魚側(cè)線特異性標(biāo)記轉(zhuǎn)基因魚活體成像：用0.016%質(zhì)量體積比的Tricaine麻醉，在Zeiss Axio A1倒置熒光顯微鏡成像，先用20倍物鏡觀察體表側(cè)線神經(jīng)丘的分布，后用40倍物鏡放大觀察單個神經(jīng)丘情況。

1.5 斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞特異性基因原位雜交方法：參照J(rèn)iang等報道的方法[10]，10-15條斑馬魚樣本用PFA固定過夜，體外合成slc17a8反義探針，將該探針加入雜交液中，70℃孵育樣本過夜。第二天樣本經(jīng)潤洗后，加入堿性磷酸酶抗地高辛抗體孵育4至5小時，加入底物顯色即可。

1.6 統(tǒng)計分析：實驗中斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的統(tǒng)計方法為計數(shù)后側(cè)線前三個神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)目取平均值，統(tǒng)計數(shù)據(jù)均表示為±s，采用student t檢驗進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑殺死斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞及后續(xù)毛細(xì)胞再生的劑量依賴效應(yīng)

0.5 mM～0.8 mM順鉑處理6小時后，側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)目平均僅剩余1-2個。當(dāng)順鉑的濃度提高到1mM，側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞剩余數(shù)目幾乎減少至零。其次用0.5 mM順鉑分別浸泡斑馬魚6小時和8小時后，發(fā)現(xiàn)兩者都可殺死大約80%左右的毛細(xì)胞，但是后續(xù)的毛細(xì)胞再生的情況卻不一樣：6小時處理后，后續(xù)再生的毛細(xì)胞數(shù)目在去除藥物24小時后有顯著升高；而8小時處理后，毛細(xì)胞數(shù)目在24小時后仍沒有顯著的升高（圖1B和1C）。最后用1 mM順鉑浸泡斑馬魚6小時后，發(fā)現(xiàn)48小時再生的毛細(xì)胞數(shù)目與24小時再生毛細(xì)胞數(shù)目沒有顯著差異，且顯著低于0.5 mM順鉑浸泡斑馬魚同等時間的實驗組24小時毛細(xì)胞再生數(shù)目（圖1B和1D）。

圖1 毛細(xì)胞丟失及再生與順鉑處理濃度與時間的關(guān)系Fig.1 Cisplatin induced hair cell loss and regeneration in a dose-dependent manner.

2.2 順鉑處理后斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞再生的時間依賴效應(yīng)

0.5 mM順鉑處理野生型魚6小時后，利用毛細(xì)胞特異性抗體anti-myosin VI來觀察側(cè)線毛細(xì)胞的再生情況。結(jié)果顯示，順鉑處理后，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞平均剩余3個左右，去除順鉑24小時后，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞增加到平均6個左右，到回復(fù)的60小時，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)目增加到10個左右（圖2A、2A’、2A’’）。利用斑馬魚側(cè)線細(xì)胞特異性標(biāo)記GFP的轉(zhuǎn)基因魚mp189b，也觀察到順鉑撤除60小時后，側(cè)線神經(jīng)丘呈實心狀態(tài)，暗示著側(cè)線毛細(xì)胞重新長回（圖2B，B’為放大的單個側(cè)線神經(jīng)丘）。利用毛細(xì)胞特異性基因slc17a8的反義探針原位雜交技術(shù)，也可觀察到順鉑處理后側(cè)線神經(jīng)丘slc17a8信號顯著減少（圖2C），去除順鉑60小時后，slc17a8信號回復(fù)（圖2C’）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示了順鉑處理后斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞減少80%左右；去除藥物24小時后，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)目開始顯著升高；隨著時間的推移到回復(fù)的72小時，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)目可達(dá)到未處理前90%左右（圖2D）。

圖2 斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞再生情況Fig.2 Characterization of hair cell regeneration

3 討論

成年的哺乳動物在自身器官受到損害后喪失了再生能力，如大腦、肌肉和聽覺器官等在受到創(chuàng)傷后都不可完全恢復(fù)。目前主要采取通過外源細(xì)胞整合到已有組織或誘導(dǎo)內(nèi)源細(xì)胞啟動再生程序兩種研究策略達(dá)到哺乳動物相應(yīng)器官在損傷后恢復(fù)其功能的目的。

斑馬魚是高度可再生模式生物，其身體的魚鰭、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺和腎臟等器官都可再生[11-14]。在斑馬魚全基因組測序工程結(jié)果顯示，斑馬魚共享了人類70%的蛋白編碼基因，而且人類疾病相關(guān)基因中有84%可以在斑馬魚中找到對應(yīng)基因[15-16]這說明用斑馬魚作為模式生物進(jìn)行相關(guān)研究與哺乳動物具有更高的保守性。本研究利用模式動物斑馬魚探討了順鉑誘導(dǎo)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞丟失及其后續(xù)毛細(xì)胞再生情況，說明了本研究利用斑馬魚進(jìn)行毛細(xì)胞丟失及再生的研究具有一定先進(jìn)性及應(yīng)用價值。

本研究發(fā)現(xiàn)順鉑殺死斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的時間和劑量依賴效應(yīng)，當(dāng)順鉑濃度在0.5 mM至1 mM之間時，隨著濃度的增加，孵育相同時間后斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞幾乎可被全部殺死，這暗示著順鉑在殺死斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞過程中具有毒性累積的現(xiàn)象。其次本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用同一濃度的順鉑孵育斑馬魚不同的時間后，較長時間的孵育會延遲后續(xù)毛細(xì)胞再生；而不同濃度的順鉑孵育斑馬魚相同時間后，高濃度的順鉑相比較于低濃度的順鉑孵育后其后續(xù)毛細(xì)胞的再生能力較弱，這暗示著由于藥物毒性積累不同所導(dǎo)致的毛細(xì)胞死亡程度會影響后續(xù)毛細(xì)胞的再生。研究發(fā)現(xiàn)再生的毛細(xì)胞主要是通過神經(jīng)丘外周區(qū)域助細(xì)胞的增殖分化而來[17]；而不同的耳毒性刺激處理毛細(xì)胞后，助細(xì)胞的增殖分化程度有所不同[18]。目前研究認(rèn)為氨基糖苷類抗生素在殺死斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞過程中主要引起線粒體腫脹和胞內(nèi)Ca2+濃度的瞬時增加[19-20]重金屬離子銅以細(xì)胞凋亡和壞死結(jié)合的方式殺死側(cè)線毛細(xì)胞[21]；順鉑類藥物在殺死側(cè)線毛細(xì)胞過程中可使毛細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，斷裂成核小片段[22]；而在這幾種不同的耳毒性刺激后出現(xiàn)了助細(xì)胞增殖再生毛細(xì)胞數(shù)目的差異[18]，暗示著毛細(xì)胞死亡形式對后續(xù)毛細(xì)胞再生方式的影響，而對于這一假設(shè)，目前仍需要更詳實的實驗論證。Wil?liams等研究發(fā)現(xiàn)，增加神經(jīng)丘中心毛細(xì)胞的死亡數(shù)目可增加周圍助細(xì)胞發(fā)生增殖的數(shù)目；反之如果用特定的抑制劑減少神經(jīng)丘中心毛細(xì)胞的死亡，則周圍助細(xì)胞的增殖也隨之減少[23]。由此推測毛細(xì)胞再生不僅與耳毒性刺激所導(dǎo)致的毛細(xì)胞死亡形式相關(guān)，還與耳毒性刺激所導(dǎo)致的毛細(xì)胞死亡數(shù)目密切相關(guān)，當(dāng)然對于這一科學(xué)問題，目前還需進(jìn)行進(jìn)一步的實驗論證。Namdaran研究組利用新霉素?fù)p傷/再生側(cè)線毛細(xì)胞系統(tǒng)篩選了1680種FDA批準(zhǔn)的化合物，結(jié)果得到了兩種有臨床應(yīng)用價值的可增強毛細(xì)胞再生的小分子化合物，糖皮質(zhì)激素-地塞米松（glucocorticoids dexamethasone）和脫氫皮質(zhì)醇（pred?nisolone）[24]。本研究利用毛細(xì)胞特異性抗體的免疫組化、轉(zhuǎn)基因斑馬魚活體觀察、原位雜交等方法系統(tǒng)性建立的順鉑誘導(dǎo)的斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞損傷與再生模型，將為探究這些有醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值的小分子化合物在順鉑致聾的群體患者中如何誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生提供了在體動物模型，為發(fā)現(xiàn)藥物性耳聾的治療靶點提供了有力的研究平臺，同時對于探討毛細(xì)胞再生來源方式在本模型研究基礎(chǔ)之上也可作更深層次的探討。

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Cisplatin-induced zebrafish lateral line hair cell loss and regeneration

MI Xiaoxiao1，YAN Jian1，LI Yuan2，SHI Junping1
1 Centre for Translational Medicine,Hangzhou Normal University Affiliated Hospital,Hangzhou,Zhejiang,310015,China
2 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Hangzhou Normal University Affiliated Hospital, Hangzhou,Zhejiang,310015,China

Objective To establish a model of cisplatin-induced hair cell loss and regeneration in zebrafish.Methods Zebrafish larval were incubated in cisplatin solution.Using antibody staining,transgenic fish live imaging and in situ hybridization,hair cell numbers before and after cisplatin treatment were characterized.Results Higher concentration cisplatin incubation caused more hair cell loss than lower concentration cisplatin when incubated for the same duration.Hair cells regeneration after lower concentration cisplatin incubation was also faster(P＜0.001).Conclusion Cisplatin induced zebrafish lateral line hair cell loss and regeneration show dose and time-dependent patterns.

Cisplatin;Hair cell injury;Hair cell regeneration;Dose-dependent manner.

R764.1

A

1672-2922（2016）05-670-4

2016-06-01審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.05.023

羋肖肖，博士，檢驗技師，研究方向:聽力損傷和修復(fù)

施軍平，Email:13957121199@126.com