樊宏亮 ， 郝欣蔚 ， 吳燁挺 ， 張 雪 ， 趙紅霞

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 ；2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010080)

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金烏散對(duì)小鼠免疫功能的影響

樊宏亮1，2， 郝欣蔚1， 吳燁挺1， 張 雪1， 趙紅霞1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 ；2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010080)

為了對(duì)金烏散中藥復(fù)方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室藥效學(xué)評(píng)價(jià)，我們開(kāi)展了金烏散對(duì)小鼠免疫功能影響的研究。本試驗(yàn)采用碳廓清法測(cè)定金烏散對(duì)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響；采用比濁法測(cè)定金烏散對(duì)小鼠血清中溶酶菌含量的影響；采用遲發(fā)型皮膚變態(tài)反應(yīng)法測(cè)定金烏散對(duì)小鼠遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)的影響；采用血清溶血素法測(cè)定對(duì)綿羊紅細(xì)胞所致的小鼠溶血素抗體生成的影響。研究結(jié)果顯示，金烏散對(duì)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著的抑制作用，并能顯著提高溶酶菌的含量，對(duì)遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)也有顯著的抑制作用，而且能增加溶血素的含量。因此，該中藥組方可影響小鼠的非特異性免疫功能和特異性免疫功能。

金烏散免疫作用 ； 小鼠

金烏散中藥復(fù)方是針對(duì)呼和浩特周邊地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌，以體外抑菌強(qiáng)度為測(cè)定指標(biāo)，按照中獸醫(yī)理論，采用正交試驗(yàn)，篩選出的具有良好抗菌作用的中藥處方。其基礎(chǔ)組方主要由金銀花、烏梅、蒲公英等組成，各味中藥相互配伍、協(xié)同，再加上各種輔藥具有較強(qiáng)的抗炎作用。為了更加系統(tǒng)研究金烏散抗炎機(jī)理與免疫調(diào)節(jié)之間的聯(lián)系，本課題從溶酶菌含量、遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)、溶血素抗體、碳廓清能力等方面研究了金烏散對(duì)小鼠非特異性免疫功能和特異性免疫功能的影響，旨在為金烏散的臨床藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 金烏散：以金銀花、烏梅、連翹、蒲公英為主藥并配以其他輔藥、矯正藥組合而成，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室工藝制備，并將該中藥制劑調(diào)整至濃度1.0 g/mL，放到4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；地塞米松磷酸鈉注射液：天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn)，批號(hào)08051211；印度墨汁：北京市西中化工廠，批號(hào)為020809；20%綿羊紅細(xì)胞懸液，由健康綿羊血制備而成。PBS 緩沖液，按文獻(xiàn)[3-4]方法自行配制；Alsever溶液，按文獻(xiàn)[1]方法自行配制。

1.2 動(dòng)物 豚鼠：體重400±50 g，雄性，由內(nèi)蒙古生物制藥廠提供；清潔級(jí)純種昆明系小鼠：體重18±2 g，雌雄各半，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；綿羊：由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。

1.3 菌株 騰黃微壁鏈球菌：代號(hào)為1.634，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所提供。

1.4 方法

1.4.2 金烏散對(duì)小鼠血清中溶菌酶含量的影響 采用比濁測(cè)定法[6]，首先制備試驗(yàn)用騰黃微壁鏈球菌菌懸浮液。接種菌種，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，洗下菌苔，3 000 r/min 離心10 min，棄上清液，菌體用PBS洗3次，于波長(zhǎng)600 nm比色。其次制備溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。配成每毫升緩沖液中含有溶菌酶1 mg的原液，然后稀釋成濃度為1、2、3、4、6 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。最后測(cè)定樣品。分組：給藥劑量、給藥途徑同“1.4.1 分組及給藥”。末次給藥1 h 后，在無(wú)菌條件下采血，分離血清。取溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液及標(biāo)本各0.1 mL，每管加基質(zhì)液4 mL混勻，置40 ℃水浴2 min，立即混懸，用600 nm波長(zhǎng)測(cè)t值，以騰黃溶壁鏈球菌濁度的變化在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出溶菌酶的活性值(即溶菌酶的濃度)。1.4.3 金烏散對(duì)小鼠遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)的影響 采用遲發(fā)型皮膚變態(tài)反應(yīng)法[3]進(jìn)行試驗(yàn)。分組和給藥方法同1.4.1。給藥前用7% 2、4-二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液以0.02 mL/只鼠背部皮內(nèi)注射致敏，連續(xù)給藥11 d。末日給藥1 h 后將1%DNCB 丙酮溶液0.02 mL/只涂于各小鼠右耳，24 h后處死，用直徑為7 mm 的打孔器將兩耳取下，分別稱重，兩耳的重量差為皮膚過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度的觀測(cè)指標(biāo)。同時(shí)取脾臟，稱其鮮重，按公式計(jì)算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重。

1.4.4 金烏散對(duì)綿羊紅細(xì)胞所致的小鼠溶血素抗體生成的影響 采用血清溶血素法測(cè)定[1,6]。分組和給藥方法同1.4.1。首先，制備綿羊紅細(xì)胞懸液(SRBC)和豚鼠補(bǔ)體血清，按文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行。其次，給小鼠免疫及給藥。連續(xù)給藥7 d，于第2次給藥后腹腔注射20%SRBC0。2 mL/鼠。于免疫后5 d，眼球取血，離心分離血清。最后測(cè)定溶血量。將血清稀釋，在本試驗(yàn)中以1∶ 400 倍稀釋作為正式試驗(yàn)的血清稀釋度。吸取1∶ 400 倍稀釋的血清各0.5 mL，依次加入其他試劑，混勻，溫育1 h，冰浴5 min 終止反應(yīng)，3 000 r/min 離心10min，取上清液于540 nm 處測(cè)定OD值，并按下列公式計(jì)算出溶血素含量。溶血素含量=樣本血清的OD值×稀釋倍數(shù)

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行分析比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 金烏散對(duì)小鼠體內(nèi)的單核—巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 采用碳廓清法[3-5]測(cè)定金烏散對(duì)小鼠體內(nèi)的單核—巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金烏散對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

組別劑量(g/kg)碳廓清指數(shù)K吞噬系數(shù)α陰性對(duì)照組200.0254±0.00132a4.805±0.4036a陽(yáng)性對(duì)照組0.0050.0143±0.00105c4.117±0.3913c高劑量組200.0246±0.00194a4.768±0.3745a低劑量組100.0205±0.00213b4.451±0.2056b

注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)；相間字母表示差異極顯著(P<0.01)，下表同

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量的金烏散對(duì)小鼠體內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有顯著地抑制作用，而高劑量的金烏散則無(wú)明顯作用。

2.2 金烏散對(duì)小鼠血清中溶菌酶含量的影響 采用比濁測(cè)定法[7]檢測(cè)各組小鼠血清中溶菌酶含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 金烏散對(duì)小鼠血清溶菌酶含量的影響 ±s)

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量的金烏散能極顯著的提高小鼠血清中溶菌酶含量，而低劑量的金烏散也可提高小鼠血清中溶菌酶的含量，但是其作用不顯著。

2.3 金烏散對(duì)小鼠遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)的影響

采用變態(tài)反應(yīng)法[3]檢測(cè)各組小鼠耳殼腫脹度，計(jì)算脾指數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 金烏散對(duì)小鼠兩耳重量差和脾指數(shù)的影響±s)

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，高、低劑量的金烏散對(duì)小鼠遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)均有顯著抑制作用，而且高劑量的金烏散對(duì)小鼠遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)有極顯著的抑制作用。

2.4 金烏散對(duì)綿羊紅細(xì)胞所致的小鼠溶血素抗體生成的影響 采用血清溶血素分光光度法[3-4]。檢測(cè)各組小鼠血清抗綿羊紅細(xì)胞抗體，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

以上試驗(yàn)表明，高、低劑量的金烏散均能顯著增加小鼠血清中溶血素的含量；而作為陽(yáng)性對(duì)照的地塞米松則可導(dǎo)致小鼠血清溶血素含量顯著降低。

表4 金烏散對(duì)小鼠血清溶血素含量的影響 ±s)

3 小結(jié)和討論

巨噬細(xì)胞的吞噬、殺傷、抗原加工和呈遞、合成和分泌各種活性因子的功能使得巨噬細(xì)胞在免疫方面起著相當(dāng)重要的作用。另外巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫的標(biāo)志物之一[2]。碳粒廓指數(shù)可以很好的反映機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬功能。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小劑量的金烏散對(duì)小鼠碳粒清水平有一定的抑制作用，而隨劑量增加，抑制作用減弱甚至消失。溶菌酶作為機(jī)體非特異性免疫因子之一，參與機(jī)體多種反應(yīng)，本試驗(yàn)結(jié)果表明，金烏散能提高小鼠血清中溶菌酶含量，且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是第Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)又稱接觸過(guò)敏反應(yīng)。研究表明，金烏散對(duì)小鼠遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)有顯著抑制作用，且隨著劑量的增加呈現(xiàn)顯著的增強(qiáng)作用。血清溶血素的測(cè)定可以反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)[8]，用藥后，高、低劑量的金烏散均可使小鼠血清溶血素生成增多，表明機(jī)體體液免疫功能增強(qiáng)。綜上所述，金烏散對(duì)單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著的抑制作用，并能顯著提高溶酶菌的含量，對(duì)遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)也有顯著的抑制作用，而且能增加溶血素的含量。因此，該中藥組方可影響小鼠的非特異性免疫功能和特異性免疫功能，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。

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2015-07-14

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金

樊宏亮(1972-)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事獸醫(yī)臨床學(xué)研究，E-mail：fanhongliang@yili.com

趙紅霞，E-mail：bluehongxia@126.com

S853.72

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0529-6005(2016)10-0057-03