文/王靜波　賈　麗　曹　歡　徐立蒲　王小亮　張　文　王　姝

引起鱘魚暴發(fā)性死亡病因分析

文/王靜波賈麗曹歡徐立蒲王小亮張文王姝

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專欄

2016年8月，河北省淶源縣一家鱘魚養(yǎng)殖場突發(fā)疾病，且出現(xiàn)大量死亡。為確定病原，從具有典型癥狀的患病魚的肝、腎和脾中進(jìn)行病原菌分離鑒定。經(jīng)28℃培養(yǎng)后，上述三個(gè)組織中均分離獲得大量形態(tài)一致菌落。肝、腎和脾分離的病原菌分別編號(hào)為LY160816L、LY160816K、LY160816S，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化鑒定以及16SrDNA基因序列比對，鑒定結(jié)果為海豚鏈球菌。結(jié)合臨床癥狀，綜合判斷，導(dǎo)致該場鱘魚暴發(fā)性死亡的病因是感染了海豚鏈球菌。

近年來，中國的鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加。隨之而來的是養(yǎng)殖鱘魚的疾病爆發(fā)更加頻繁，嚴(yán)重制約鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。目前，已報(bào)道的鱘魚致病菌有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas carvia）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）和海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）。2016年8月，河北省淶源縣一家鱘魚養(yǎng)殖場鱘魚出現(xiàn)大量死亡，且持續(xù)時(shí)間長，累計(jì)死亡率達(dá)40%以上。其外觀癥狀主要表現(xiàn)為口周圍、腹部兩側(cè)骨板、肛門出血，疑似細(xì)菌感染。為了搞清病因，作者對具典型癥狀患病鱘魚進(jìn)行病原菌分離、生理生化鑒定以及16SrDNA基因序列比對。

一、材料方法

1.材料

患病鱘魚來自河北省淶源縣鱘魚養(yǎng)殖場。鱘魚規(guī)格20cm～30cm。

2.主要試劑

腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購于北京陸橋生物技術(shù)有限公司。革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基和API 20 STREP鑒定試劑條購于北京威泰科生物技術(shù)有限公司。UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒及PCR相關(guān)試劑購于上海生物工程有限公司。

3.病原菌分離、純化

取具典型癥狀的患病鱘魚，無菌操作從肝、脾和腎劃線分離于腦心浸液瓊脂（BHIA）平板和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20小時(shí)。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落于BHIA平板進(jìn)行純化。菌株編號(hào)為編號(hào)LY160816L、LY160816K、LY160816S。

4.分離株的形態(tài)觀察和生理生化特征

純化菌劃線分離于BHIA，28℃培養(yǎng)20小時(shí)觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行氧化酶、觸酶實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色和API 20 STREP細(xì)菌鑒定試劑條鑒定生化特征。

5.分離株的PCR鑒定、16SrDNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

病原菌的DNA模板制備采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取，置于-20℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌16SrDNA序列擴(kuò)增通用引物For：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，Rev：5'-TACGGCTACCTTGTTACGCTT-3'（退火溫度55℃），引物均由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50μ L，包括10×PCR緩沖液5μ L，25 mmol/L氯化鎂5μ L，5U/μ L Taq酶0.25μ L，10 mmol/L dNTP 1μL，模板DNA 2μL，20 pmol/μL上下游引物各2μL，DEPC水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性1分鐘，退火溫度退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，由上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測定。

將分離菌的16SrDNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，從中選取與所獲序列同源性較高的同種菌株的16SrDNA 基因序列，并從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得同屬相關(guān)種的16SrDNA序列，利用MEGA 4.0采用鄰位連接法（Neighbor-Joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)集1000次。

圖1　口周圍出血

圖2　肝、性腺出血，脾腫大

二、結(jié)果

1.臨床癥狀

患病魚外觀主要癥狀為口周圍、腹部兩側(cè)骨板、肛門出血，解剖后發(fā)現(xiàn)肝、性腺和腹腔內(nèi)膜有出血點(diǎn)，脾腫大。

2.分離株的形態(tài)特征與生化特征

分離菌在BHIA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24小時(shí)的菌落特征為：白色、圓形、邊緣齊整、扁平、直徑約0.3mm～0.5mm。在血瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24小時(shí)，菌落為圓形，中心白色，周邊半透明，形成β溶血環(huán)。氧化酶陰性，觸酶反應(yīng)陰性，革蘭氏染色陽性，卵圓形，呈鏈狀或雙排鏈狀（見圖3）。

圖3　鱘腎臟分離菌的革蘭氏染色形態(tài)

采用API 20 STREP 系統(tǒng)鑒定，菌株編號(hào)為LY160816L、LY160816K、LY160816S的三個(gè)樣品與Buller等報(bào)道的國外分離株的生化特征在β-葡萄糖醛酸酶、核糖和甘露醇項(xiàng)不同，而與Zhou等報(bào)道的中國分離株的生化特征完全一致。具體見表1。

表1　分離菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

3.16SrDNA 基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

PCR擴(kuò)增分離株LY160816K的16SrDNA 基因片段約1500bp。PCR經(jīng)Blast同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與海豚鏈球菌的同源性最高，在99.2%以上；與副乳房鏈球菌的同源性為97.6%，與停乳鏈球菌的同源性為97.2%，與無乳鏈球菌的同源性為97.0%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示其與海豚鏈球菌聚為一支。

圖4　菌株LY160816K的16s DNA系統(tǒng)發(fā)育樹

三、討論

通過對具有典型臨床癥狀的發(fā)病鱘進(jìn)行病原菌初次分離，獲得大量形態(tài)一致的菌落。純化菌株的生化特征與從中國其它魚類分離的海豚鏈球菌一致，其16SrDNA基因序列與海豚鏈球菌的同源性在99.2%以上，綜合確定分離株為海豚鏈球菌。

海豚鏈球菌自1976年從亞馬遜河豚（Inia geoffrensis）皮膚膿腫處分離，目前在全世界范圍內(nèi)流行，可感染海水、半咸水和淡水的二十多種養(yǎng)殖或野生魚類，每年對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失超過100億美元。但鏈球菌感染鱘魚的相關(guān)報(bào)道非常少。1993年，Kitao等暗示鱘魚也是鏈球菌感染的敏感對象。2006年，Roy和Ruth發(fā)現(xiàn)鏈球菌感染鱘魚病例，未確認(rèn)鏈球菌種類。2009年，潘厚軍等和楊五名等證實(shí)停乳鏈球菌分別是西伯利亞鱘和施氏鱘的致病菌。2013年，王小亮等在北京懷柔某漁場鱘魚體內(nèi)分離到海豚鏈球菌。但至今還未見鱘魚因感染海豚鏈球菌出現(xiàn)暴發(fā)性死亡病例的報(bào)道。

鏈球菌在水體中普遍存在，屬于條件致病菌。當(dāng)養(yǎng)殖密度大，水質(zhì)環(huán)境差，水溫高時(shí)會(huì)引起養(yǎng)殖魚類感染。本漁場使用河道水進(jìn)行鱘魚養(yǎng)殖，在本次病害發(fā)生前，河道上游曾下暴雨，造成河道水出現(xiàn)渾濁，此水未經(jīng)沉淀直接進(jìn)入養(yǎng)殖池，隨后養(yǎng)殖鱘魚出現(xiàn)死亡，而且越發(fā)嚴(yán)重，累計(jì)死亡率達(dá)40%以上。同時(shí)，在發(fā)病后轉(zhuǎn)移到虹鱒魚養(yǎng)殖池的鱘魚體內(nèi)也分離到海豚鏈球菌，但是鱘魚未出現(xiàn)死亡。因此，根據(jù)檢測結(jié)果和結(jié)合臨床癥狀綜合分析，引起此漁場鱘魚暴發(fā)死亡原因?yàn)楦腥竞ｋ噫溓蚓?，同時(shí)水質(zhì)環(huán)境變差，最終導(dǎo)致鱘魚出現(xiàn)大量死亡。

作者單位：北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站