王鈺婷，李瑞雪，王偉，汪泰初

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，合肥230061）

安徽桑樹品種全基因組DNA提取方法研究

王鈺婷，李瑞雪，王偉，汪泰初

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，合肥230061）

旨在獲得一種高效、穩(wěn)定、廉價的DNA提取方法。以安徽桑樹品種嫩葉為材料，以CTAB法提取其基因組DNA，并用紫外分光光度計、凝膠電泳、PCR擴增等方法進行鑒定。研究結(jié)果表明：提取的DNAA260/A280比值在1.80～1.90之間，DNA得率約為0.187～0.275 μg/mg，以提取的DNA為模版，PCR能夠獲得清晰的目的條帶。證明CTAB法提取的DNA質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)分子生物學(xué)操作的需要。

桑樹；DNA提??；PCR擴增

0 引言

中國是蠶桑生產(chǎn)的發(fā)源地，擁有極其豐富的桑樹種質(zhì)資源。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，從分子水平上對桑樹種質(zhì)資源的遺傳變異進行研究已成為桑樹分子生物學(xué)研究熱點之一。向仲懷等[1]運用RAPD技術(shù)構(gòu)建了桑屬9個種的DNA指紋圖譜，對桑屬的植物分類進行了開創(chuàng)性的研究，開辟了中國分子標(biāo)記技術(shù)研究桑樹種質(zhì)的先例?；蚪MDNA的提取是進行分子標(biāo)記技術(shù)研究的關(guān)鍵步驟之一，高質(zhì)量基因組DNA的獲取是進行桑樹生物學(xué)方面研究的基礎(chǔ)。由于桑樹是多年生木本植物，組織細胞含有大量的多糖、多酚、酯類等復(fù)雜次生代謝產(chǎn)物，因而要從中提取高質(zhì)量的DNA有較大困難[2-5]。

本實驗采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對安徽特色桑樹品種的嫩葉進行DNA的提取，在實驗過程中，優(yōu)化了DNA提取程序，獲得了高得率、高純度的DNA，能成功地應(yīng)用于后續(xù)的分子生物學(xué)反應(yīng)。旨在為桑樹基因組DNA的研究提供理論與技術(shù)參考，也為進一步深入開展其親緣關(guān)系分析、基因組比較、遺傳多樣性分析等分子生物學(xué)研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取5種安徽桑樹地方品種（樣本采自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所桑樹品種選育中心）。以桑嫩葉為實驗材料，品種分別為：‘金寨九龍?！?、‘皖桑1號’、‘紅星5號’、‘皖花?！ⅰ?707’。

1.2 DNA提取方法

桑樹基因組DNA提取采用CTAB法，參照趙衛(wèi)國[2]的方法，稍加改進。

①取0.1～0.2 g嫩葉剪碎，在液氮條件下磨碎成粉末，轉(zhuǎn)入經(jīng)55℃預(yù)熱的600 μL的CTAB提取緩沖液（0.1 mol/LTris·HCl，pH 8.0，0.02 mol/LEDTA，1.4 mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，0.04 mol/Lβ-巰基乙醇）中；②混勻后在65℃水浴裂解30min，期間輕搖數(shù)次以混勻，室溫冷卻，12000 r/min離心15 min；③加入500 μL氯仿:異戊醇(24:1)，抽提細胞殘渣和葉綠體，輕輕顛倒混勻至乳白色；常溫13000 r/min離心10 min；④轉(zhuǎn)移上清液到新離心管中，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇混勻，室溫靜置3～5 min；⑤常溫下，10000 r/min高速離心5 min，棄上清后倒置干燥，加500 μL ddH2O溶解；加入2 μL RNase(10mg/mL)，37℃水浴1 h；⑥加等體積酚抽提1次，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提1次，氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次；⑦加2倍體積無水乙醇沉淀DNA，輕輕混勻，-20℃過夜；⑧13000 r/min離心10 min，棄上清，用70%無水乙醇洗滌DNA2次，每次8000r/min離心10min；倒置干燥后加入200 μL的TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTApH 8.0)溶解DNA，樣品保存于4℃或-20℃。

1.3 DNA質(zhì)量檢測方法

1.3.1 D(λ)法DNA完全溶解后，吸取5 μL DNA溶液，加95 μL TE，稀釋100倍后，在DU-70紫外分光光度計上測定OD260和OD280值。

1.3.2 電泳分析取DNA樣品3 μL與1 μL 6×Loading buffer混勻，在1%瓊脂糖凝膠（含EB）上電泳檢測DNA質(zhì)量，反應(yīng)混合物在1×TAE緩沖液中120V電泳30min。電泳結(jié)果在Tanon(Gis-2008)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.3 PCR分析參照文獻[6]設(shè)計擴增引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：2*Master Mix 12.5 μL；模板DNA 1.0 μL；引物各1.0 μL（濃度為10 ng/μL）；ddH2O 11.5 μL。PCR擴增程序如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min；PCR產(chǎn)物于4℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA樣品純度及得率

5種樣品A260/A280比值均在1.80～1.90之間。說明以桑嫩葉為材料所提取的5種DNA樣品中蛋白質(zhì)、植物色素、多糖和酚類物含量較低，DNA的得率和純度均較高，能夠滿足進一步分子生物學(xué)操作的需要。

表1 5種DNA樣品的測定結(jié)果

2.2 DNA樣品的電泳

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取到的DNA總帶清晰整齊，無雜帶、無拖尾現(xiàn)象（圖1），表明DNA提取純度較高。

圖1 桑樹DNA凝膠電泳圖譜

圖2 提取DNA的PCR擴增結(jié)果

2.3 DNA的PCR分析

提取DNA進行PCR分析，結(jié)果顯示能夠獲得清晰穩(wěn)定的產(chǎn)物條帶（圖2），說明提取的DNA完全可用于PCR分析，可為桑樹的后續(xù)分子生物學(xué)實驗操作奠定基礎(chǔ)。

3 討論與結(jié)論

制備較完整、純度較高的基因組DNA是進行植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提，是進一步試驗的最關(guān)鍵因素[7-10]。植物組織與動物細胞不同，含有較高的多酚、多糖、色素和脂類物質(zhì)等干擾物質(zhì)，在多年生木本植物中含量更高，高質(zhì)量DNA的提取更為困難[11-13]。

桑樹是多年生木本植物，桑葉中含大量的多糖及多酚類物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量也高于其他植物[14-15]。有研究者用氯化銫密度梯度離心法分離桑葉總DNA[16]，費時且價格昂貴。本實驗對傳統(tǒng)的CTAB法進行改進和完善，盡量減少多酚、多糖、色素、果膠和脂類物質(zhì)等的干擾。結(jié)果表明，采取CTAB法提取供試樹種基因組DNA，結(jié)果均獲得了較高質(zhì)量的DNA（圖1，圖2）。在實驗過程中，對CTAB法進行了如下改進：①在條件允許的情況下，優(yōu)先選取新鮮采摘的幼嫩植物組織作為DNA提取的材料；②采集的樣品及時放入液氮中凍存，減少DNA的降解；③如植物組織較老，為減少組織的褐變情況，可適當(dāng)加大β-巰基乙醇的用量（可達2.5%～3%）；④在組織裂解水浴加熱期間添加RNaseA，有效去除了其中的RNA，而且所添加的RNase A在純化的過程可以得到進一步的去除；⑤加入異丙醇后離心過程中，降低離心速度、縮短離心時間，能防止多酚、多糖、單寧、果膠等次生代謝物質(zhì)與DNA一起被沉淀。紫外線檢測、凝膠電泳及PCR鑒定分析，說明本實驗采用CTAB法提取的桑樹DNA可以用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

[1]向仲懷,張孝勇,余茂德,等.采用隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)在桑屬植物系統(tǒng)學(xué)研究的應(yīng)用初報[J].蠶業(yè)科學(xué),1995,21 (4):203-208.

[2]林強,邱長玉,趙衛(wèi)國,等.32份廣東桑類型桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP標(biāo)記分析[J].蠶業(yè)科學(xué),2011,37(3):373-379.

[3]趙衛(wèi)國,潘一樂.從桑樹營養(yǎng)組織中提取高純度DNA的方法[J].江蘇蠶業(yè),2001,28(1):19-20.

[4]林強,朱方容,邱長玉,等.廣西桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,42(4):358-363.

[5]田智得,趙衛(wèi)國,甘麗紅,等.廣西桑樹品種全基因組DNA提取方法研究[J].廣西蠶業(yè),2006,43(2):7-10.

[6]Zhao W G,Fang R J,Pan Y L,et al.Analysis of genetic relationships of mulberry(L.)germplasm using sequence-related amplified polymorphism(SRAP)markers[J].African Journal of Biotechnology,2009,8(11):2604-2610.

[7]李軍集,廖和發(fā),劉海龍.藥用植物六角蓮基因組DNA提取方法[J].廣西林業(yè)科學(xué),2007,36(2):89-92.

[8]戴瑞強.華桑遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)構(gòu)建[D].鎮(zhèn)江:江蘇科技大學(xué),2010.

[9]White T J,Bruns T,Lee S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenctics[M]. California:Academic Press,1990:315-322.

[10]李金璐,王碩,于婧,等.一種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報,2013,48(1):72-78.

[11]丁浩,鄭唐春,梁德洋,等.一種簡易高效提取多種植物純凈DNA的方法[J].植物研究,2015,35(3):457-461.

[12]趙衛(wèi)國.桑種質(zhì)資源的遺傳多樣性及分子系統(tǒng)學(xué)研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2005.

[13]趙衛(wèi)國,潘一樂.從桑樹營養(yǎng)組織中提取高純度DNA的方法[J].江蘇蠶業(yè),2001,28(1):19-20.

[14]林強,邱長玉,朱方容,等.桑樹二倍體及其人工誘導(dǎo)同源四倍體遺傳差異的RAPD分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,42(1):11-15.

[15]孫璐宏,魯周民,張麗.植物基因組DNA提取與純化研究進展[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2010,25(6):102-106.

[16]町井博明.桑全DNA的分離[J].國外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè),1990(2):60-61.

Genomic DNA Extraction Method of Mulberry Varieties in Anhui

Wang Yuting,Li Ruixue,Wang Wei,Wang Taichu
(The Sericultural Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Science,Hefei 230061,Anhui,China)

The aim is to explore an efficient,stable,low-cost DNA extraction method.The total genomic DNA was extracted from mulberry leaves with CTAB in Anhui.Ultraviolet spectrophotometer,agarose gel electrophoresis and PCR methods were used to test the DNA quality.The results showed that the value of A260/ A280was 1.80-1.90,DNA yield was 0.187-0.275 μg/mg.The extracted DNA was used as templates,the clear target bands were obtained by PCR amplification.It indicated that CTAB method was suitable to extract the total genomic DNA from leaves of mulberry,which could meet the need of subsequent analysis of molecular biology.

Mulberry；DNA Extraction；PCR Amplification

S-186

A論文編號：cjas16050018

安徽省農(nóng)科院院長青年創(chuàng)新基金“安徽省地方桑樹種質(zhì)資源ITS序列及進化分析研究”(15B0634)；國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系合肥綜合試驗站“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項”(CARS-22-SYZ09)；安徽省農(nóng)科院創(chuàng)新團隊項目“多功能生態(tài)桑樹品種的選育與利用”(11C0610)。

王鈺婷，女，1985年出生，安徽岳西人，助理研究員，碩士，研究方向：分子遺傳學(xué)。通信地址：230061安徽省合肥市蜀山區(qū)霍山路15號安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，Tel：0551-62842195，E-mail：wyt@ahaas.com。

汪泰初，男，1970年出生，安徽池州人，研究員，碩士，研究方向：桑樹栽培育種。通信地址：230061安徽省合肥市蜀山區(qū)霍山路15號安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，Tel：0551-62842195，E-mail：18949853828@126.cn。

2016-05-30，

2016-08-11。