周堯許國(guó)洋潘康成王承旭張鈞利

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川成都611130）（2.廣州市中添生物科技有限公司，廣東廣州510470）（3.江蘇無(wú)錫阿爾寶爾生物工程股份有限公司，江蘇無(wú)錫214046）（4.重慶市畜牧科學(xué)研究院獸醫(yī)研究所，重慶榮昌402460）

雞β-防御素-13（Gal-13）成熟肽序列的克隆及表達(dá)

周堯1,2許國(guó)洋1,3潘康成1王承旭2張鈞利2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川成都611130）
（2.廣州市中添生物科技有限公司，廣東廣州510470）
（3.江蘇無(wú)錫阿爾寶爾生物工程股份有限公司，江蘇無(wú)錫214046）
（4.重慶市畜牧科學(xué)研究院獸醫(yī)研究所，重慶榮昌402460）

本研究旨在克隆雞成熟肽cDNA序列并構(gòu)建原核和真核表達(dá)載體，研究其在大腸桿菌和畢赤酵母中誘導(dǎo)后融合蛋白的表達(dá)情況。利用PCR技術(shù)從pDM19-T-Gal-13質(zhì)粒中擴(kuò)增得到成熟肽cDNA序列，將其亞克隆到pGEX-4T-1和pPICZαA質(zhì)粒中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表達(dá)載體pPICZαA-Gal-13，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母X-33，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用進(jìn)行鑒定和誘導(dǎo)表達(dá)，（Tricine）SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)物的表達(dá)情況，以及真核誘導(dǎo)表達(dá)上清液對(duì)雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。結(jié)果顯示，成功克隆得到的成熟肽序列長(zhǎng)為128bp，包含ATG片段和酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿共20bp，共編碼36個(gè)氨基酸；構(gòu)建獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表達(dá)載體pPICZα-A-Gal-13，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21和酵母X-33，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后結(jié)果顯示，Gal-13融合蛋白在大腸桿菌和酵母中得到大量表達(dá)，原核表達(dá)分子量是31ku并以包涵體的形式存在，真核表達(dá)的分子量5.9 ku并分泌到發(fā)酵液中；抑菌試驗(yàn)表明，發(fā)現(xiàn)真核表達(dá)的發(fā)酵無(wú)菌上清對(duì)雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性。

雞；防御素Gal-13；成熟肽；克隆；表達(dá)

防御素是一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，廣泛分布于動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)等體內(nèi)，是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，因其具有高效的抗菌活性和免疫增強(qiáng)作用，以及不會(huì)引起病原菌的耐藥性的問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)而成為目前生物醫(yī)學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)（袁波等，2009；sugiano等，2004）。依據(jù)防御素的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將其分為植物防御素、昆蟲(chóng)防御素、α-防御素、β-防御素和θ-防御素（王新衛(wèi)等，2006）。1994年，Harrwing等（1994）最先從雞的嗜中性粒細(xì)胞中分離提取到了β-防御素，并將其分別命名為Gal-1，Gal-1α，Gal-2。隨著研究技術(shù)方法的不斷成熟，其他種類的防御素也被相繼發(fā)現(xiàn)（E-vans等，1994；Lynn等，2004），張輝華等（2008）研究了雞的Gal-1~Gal-13序列信息及在組織中的分布情況，目前，在NCBI中已注冊(cè)的雞防御素共有14種，且均為β-防御素，國(guó)內(nèi)報(bào)道的雞的防御素主要是從絲羽烏骨雞和三黃雞的組織器官中獲得（張祥斌等，2008；冀君等，2008），Gal-13是近年來(lái)剛發(fā)現(xiàn)的新種類，其被楊玉榮等（2008；2006）用乙酸提取的方法從雞的腸道中分離得到，并證實(shí)了它的抑菌活性和對(duì)雛雞免疫功能的影響，但提取工藝繁瑣耗時(shí)，且提取量有限。而關(guān)于Gal-13在基因工程方面的研究相對(duì)較少，其在大腸桿菌和真核中的表達(dá)情況未見(jiàn)報(bào)道（王璟等，2007），本研究擬構(gòu)建Gal-13成熟肽基因表達(dá)載體，以期望其在大腸桿菌和酵母中大量表達(dá)，彌補(bǔ)Gal-13在基因工程方面的空白，為進(jìn)一步研究其活性奠定基礎(chǔ)，也為其今后在畜牧業(yè)中的生產(chǎn)應(yīng)用奠定一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株和載體

大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、攜帶雞β-防御素-13基因質(zhì)粒pMD18-T-Gal-13、表達(dá)載體pGEX-4T-1、分泌表達(dá)載體pPICZaA、畢赤酵母X-33，雞白痢沙門氏菌（CVCC534）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923），由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2酶和試劑

T4DNA連接酶和RNA提取Trizol試劑盒均為Gibco公司產(chǎn)品；Prime Script RT-PCR Kit、2×Taq MasterMix（含染料）購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；EcoR1和BamH1限制性內(nèi)切酶均購(gòu)于寶生物（大連）工程有限公司；Gel DNA Recovery Kit購(gòu)自PUEX公司；Mini PlasmidKit、酵母基因組提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；D-山梨醇、生物素和YNB均購(gòu)自Solarbio公司；博萊霉素（ZeocinTM）為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

參照張輝華等（2008）報(bào)道的Gal-13cDNA序列設(shè)計(jì)引物P1/P2，擴(kuò)增Gal-13成熟肽基因序列。并依據(jù)載體pPICZaA序列合成一對(duì)檢測(cè)重組菌株表型的引物5，AOX/3，AOX，引物由上?；倒竞铣?。

1.4原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Gal-13的構(gòu)建及鑒定

以pMD18-T-Gal-13為模板，P1/P2為引物，擴(kuò)增Gal-13成熟肽序列（擴(kuò)增體系為2×TaqMaster-Mix12.5μL，DNA 2μL，ddH2O10.5μL；反應(yīng)條件為94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min）。PCR產(chǎn)物用1%的凝膠電泳鑒定，回收純化產(chǎn)物，送上海生工公司測(cè)序。將pGEX-4T-1質(zhì)粒與鑒定正確的成熟肽序列，分別用EcoR1和Kpn1雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收純化，連接過(guò)夜，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒，將擴(kuò)增出成熟肽序列和pGEX-4T-1表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并將PCR產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-Gal-13。

1.5原核重組子的誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21，涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基（含Amp+）上，篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的重組菌株（命名為大腸桿菌BL-Gal-13），接種于200ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，在OD值達(dá)到0.3~0.5時(shí)加入終濃度為1.0mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h后，取1mL菌液離心收集菌體，加入100μl電泳緩沖液水煮10min，進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot凝膠電泳分析。

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液4℃下12000r/min離心10min，收集沉淀，離心后用PBS懸浮菌體沉淀，冰水浴中超聲裂解菌懸液（超聲功率為300W，工作4s間歇5s，超聲裂解15min）。取1ml裂解液4℃下12000r/min離心 10min，沉淀和上清分別做SDS-PAGE分析。

1.6真核pPICZαA-Gal-13重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

方法1.4回收鑒定正確的PCR產(chǎn)物與pPICZaA質(zhì)粒用EcoR1與Kpn1酶切消化處理，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有Zeocin（25μg/μl）的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基（含Zeocin）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，構(gòu)建成功的質(zhì)粒送往上海博亞生物公司測(cè)序，重組質(zhì)粒命名為pPICZαA-Gal-13。

表1　引物序列信息

1.7重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Gal-13的電擊轉(zhuǎn)化

提取重組質(zhì)粒pPICZαA-Gal-13，用Sac1內(nèi)切酶線性化處理，取100μl制備好的畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞，與5～20μg線性化的目的片段混合，轉(zhuǎn)移至一冰預(yù)冷無(wú)菌0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰水浴15min，放入電轉(zhuǎn)儀中電擊轉(zhuǎn)化，然后取出電轉(zhuǎn)化皿，立即加入1ml冰預(yù)冷的1mol/L Sorbitol，混勻后轉(zhuǎn)到1.5ml無(wú)菌離心管，取600μl電轉(zhuǎn)化菌體涂布于YPDS平板（含Zeocin），30℃培養(yǎng)3d左右，篩選轉(zhuǎn)化子。

1.8真核重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（命名為重組酵母X-33-Gal-13）接種于3ml YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250r/min搖床培養(yǎng)至OD600=2～6，2500r/min離心2min，棄上清收集菌體，菌體用BMMY重懸，其中甲醇含量為1%，連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)4d，每24h取樣并補(bǔ)充甲醇，使其終濃度為0.5%。對(duì)樣品進(jìn)行離心收集上清，并用上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳。

1.9 Gal-13的抑菌活性試驗(yàn)

收集重組畢赤酵母X-33甲醇誘導(dǎo)72h后表達(dá)的上清液，以牛津杯法，分析真核表達(dá)的重組蛋白雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

1.10耐熱性分析

取誘導(dǎo)表達(dá)72h的重組酵母X-33-Gal-13菌株表達(dá)上清12mL，分為6管，分別在50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃的溫度下水浴處理15min，參照方法1.9做抑菌試驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以P1/P2為引物擴(kuò)增出其成熟肽序列，經(jīng)測(cè)序共128bp，包括引入ATG片段和酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基。對(duì)構(gòu)建篩選的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序，所擴(kuò)增的序列信息與目的基因一致，結(jié)果表明目的基因成功插入到表達(dá)質(zhì)粒中（圖1）。

圖1　Gal-13成熟肽cDNA序列的擴(kuò)增及菌落PCR鑒定

2.2重組大腸桿菌BL-Gal-13表達(dá)產(chǎn)物的鑒定分析

誘導(dǎo)表達(dá)4h的菌液樣品經(jīng)SDS-PAGE和westernblot凝膠電泳分析顯示，GST標(biāo)簽的分子量大小約為26ku，融合蛋白的分子量大小約為31KD，與預(yù)期結(jié)果一致，電泳結(jié)果如圖2所示。對(duì)融合蛋白的經(jīng)過(guò)表達(dá)形式分析后發(fā)現(xiàn)菌體經(jīng)超聲裂解后，只有在沉淀中檢測(cè)到了目的蛋白。

圖2　表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及western blot分析

2.3真核pPICZαA-Gal-13表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

成熟肽序列經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物與pPICZaA質(zhì)粒用EcoR1與Kpn1酶切，連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化后的DH5a單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)均在約120bp的位置出現(xiàn)預(yù)期條帶，電泳結(jié)果如圖3A所示，提取重組質(zhì)粒后，進(jìn)行雙酶切鑒定，在圖3B中出現(xiàn)了兩個(gè)條帶，結(jié)果表明成功構(gòu)建了Gal-13成熟肽的真核分泌pPICZaA-Gal-13質(zhì)粒。

圖3　pPICZαA-Gal-13陽(yáng)性菌落PCR和重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.4高抗性菌株的篩選鑒定

對(duì)含有Zeocin的抗性平板中長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取酵母基因組進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，以P1/P2為引物擴(kuò)增出了大小約為120bp的條帶；重組菌株基因組用5’AOX1/3’AOX1擴(kuò)增出約700bp和2200bp的條帶，所獲得的菌株，為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，且表型為甲醇利用野生型Mut+，酵母基因組擴(kuò)增出一條2200bp條帶，結(jié)果表明，所獲得的高抗性菌株，為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，且表型為甲醇利用野生型。

圖4　高抗性菌株鑒定

2.5重組酵母X-33-Gal-13的誘導(dǎo)表達(dá)

利用甲醇對(duì)重組酵母X-33-Gal-13進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組菌株在誘導(dǎo)表達(dá)24h，Tricine-SDS-PAGE電泳后在約5.9 ku的位置出現(xiàn)目的條帶，該條帶的蛋白中含有His標(biāo)簽，大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖5）。凝膠薄層灰度掃描結(jié)果顯示，24~72h目的蛋白占菌體自身分泌總蛋白的百分比分別約為18.2%、20.0%、27.2%，誘導(dǎo)表達(dá)72h目的蛋白所占比例明顯升高。

圖5　畢赤酵母X-33-Gal-13誘導(dǎo)表達(dá)上清Tricine-SDS-PAGE

2.6表達(dá)產(chǎn)物的抑菌活性

重組酵母X-33-Gal-13誘導(dǎo)表達(dá)72h的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)雞白痢沙門菌的抑菌圈直徑平均值為11.78mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑平均值為12.56mm，比前者抑菌效果更加明顯，結(jié)果如圖6A,B所示。

圖6　Gal-13抑菌活性分析結(jié)果

2.7耐熱性分析

圖7　耐熱性分析

通過(guò)對(duì)不同溫度處理重組酵母X-33-Gal-13誘導(dǎo)表達(dá)的上清液，處理Gal-13抑菌活性的分析，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)Gal-13的抑菌效果無(wú)明顯影響。圖7表明Gal-13在100℃的條件下，處理15min后，對(duì)雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌依然具有抑菌活性，雖然均有所下降，但幅度較小，表現(xiàn)出較好耐熱性。

3　討論

防御素作為一種新型的生物活性肽，其抗菌譜廣泛，與抗生素阻斷大分子生物合成的作用機(jī)制完全不同，防御素能夠快速殺滅廣譜病原微生物，而且作為機(jī)體本身的一種活性物質(zhì)，相對(duì)不具有免疫原性，對(duì)其具有抵抗性的細(xì)菌較少，病原菌也不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，因此可以替代抗生素發(fā)揮廣譜高效的抗菌作用（Risso等，2000）。但防御素天然產(chǎn)量低，合成或從機(jī)體中提取步驟復(fù)雜、產(chǎn)量低，價(jià)格相當(dāng)昂貴，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)防御素具有現(xiàn)實(shí)意義（馮興軍等，2006）。

從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的雞pDM-19-T-Gal-13的質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)引物的設(shè)計(jì)，去掉其序列中的信號(hào)肽、前導(dǎo)肽序列，成功獲得成熟肽序列，將其亞克隆到Gal-13的原核表達(dá)質(zhì)粒中，首次實(shí)現(xiàn)了Gal-13大腸桿菌中得到高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，有利于避免其被宿主菌蛋白酶的降解，同時(shí)避免防御素對(duì)表達(dá)菌株的損傷。另外，Gal-13含有GST標(biāo)簽，便于目的蛋白的篩選、鑒定和純化（吳靜等，2013；王海英，2008）。同時(shí)，通過(guò)分離純化目標(biāo)蛋白并對(duì)雞源大腸桿菌和金色葡萄球菌進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)，結(jié)果純化的目標(biāo)蛋白對(duì)兩株病原菌具有一定的抑制作用（另文報(bào)道）。結(jié)果為進(jìn)一步研究重組蛋白Gal-13的生物學(xué)特性和其作為一種新型抗菌肽藥物制劑在畜牧業(yè)中的應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有易于操作，發(fā)酵密度高，表達(dá)量高等優(yōu)勢(shì)，被越來(lái)越多的應(yīng)用于外源基因蛋白的表達(dá)，并且已經(jīng)成功表達(dá)了多種外源蛋白（Gil de Los Santos等，2012）。本試驗(yàn)以畢赤酵母X-33為宿主菌，用分泌表達(dá)載體pPICZαA構(gòu)建了重組表達(dá)系統(tǒng)，目的蛋白以分泌形式表達(dá)于培養(yǎng)基中，這樣不僅避免了產(chǎn)物被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解和因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)堆積所造成的毒性作用而影響細(xì)胞代謝，而且大大簡(jiǎn)化了產(chǎn)物的分離純化過(guò)程，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了便利條件。該成熟肽的抑菌活性試驗(yàn)表明，其對(duì)雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌具有一定的抑制作用，抑菌活性雖然較弱，但其對(duì)溫度有較好的耐受性。本研究初步證實(shí)了其具有生物活性，彌補(bǔ)了Gal-13在真核表達(dá)系統(tǒng)方面的空缺，為防御素Gal-13生產(chǎn)工藝的建立提供了依據(jù)，也為進(jìn)一步研究Gal-13的作用機(jī)制以及在生物體內(nèi)的生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表達(dá)載體 pPICZα-A-Gal-13及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21和酵母X-33，Gal-13融合蛋白在大腸桿菌和酵母中得到大量表達(dá)，原核表達(dá)分子量是31ku并以包涵體的形式存在，真核表達(dá)的分子量5.9 ku并分泌到發(fā)酵液中，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)病原菌具有抑菌活性和具有較好的耐熱性。

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2016-9-6