邢宏觀,林建國,鐘雪兆,王常高,杜 馨,蔡 俊

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

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響應(yīng)面法優(yōu)化丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝

邢宏觀,林建國,鐘雪兆,王常高,杜 馨,蔡 俊*

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

采用響應(yīng)面法對丁酸梭菌生物量的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響菌體數(shù)的顯著性因素。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)找出CCD實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn),并確定非顯著因素最低添加量來降低生產(chǎn)成本。最后通過響應(yīng)面法分析獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成成份。結(jié)果表明:酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4為影響菌體量的3個顯著性因素;可溶性淀粉2%、酵母浸粉6%、FeSO41.74%、K2HPO40.37%、NaCl 0.2%、MgSO40.024%為最佳培養(yǎng)基組合;優(yōu)化后的菌體數(shù)可達(dá)1.01×109個/mL,與優(yōu)化前(2.3×108個/mL)相比,提高至4.39倍。

丁酸梭菌,生物量,響應(yīng)面法,發(fā)酵工藝

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricumm)即丁酸梭狀芽孢桿菌,又名酪酸菌、宮入菌[1]。根據(jù)2001年聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織的專家們對益生菌的定義,C.butyricum符合益生菌標(biāo)準(zhǔn),其最早于1944年在日本投入臨床應(yīng)用,至今已經(jīng)開發(fā)出多種相關(guān)的微生態(tài)制劑[2]。在臨床應(yīng)用上,丁酸梭菌主要治療各種原因(腸道感染、外科手術(shù)等)所致的腸道菌群紊亂、急慢性腹瀉、腸易激綜合癥、非潰瘍性消化不良等疾病[3-6]。除了能調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌落平衡,提高免疫力外,也有報道稱丁酸梭菌對肝臟損傷有治療和預(yù)防的效果[9]。最新研究表明丁酸梭菌對治療癌癥也有一定功效[10-11]。

目前制約微生態(tài)制劑大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素是在生物菌劑的制備過程中存在菌體生物量偏低的問題。響應(yīng)面法(Response Surface Method),也稱響應(yīng)曲面法,是通過對響應(yīng)曲面及等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù),采用多元二次回歸方程來擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計(jì)方法,其優(yōu)點(diǎn)是在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對實(shí)驗(yàn)因素的各個水平進(jìn)行分析,克服了正交實(shí)驗(yàn)[12-13]只能對一個個孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析和不能給出直觀圖形的缺陷,所以它被廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化和模型建立中[14-15]。徐瑩等[16]利用響應(yīng)面法優(yōu)化丁酸梭菌清液發(fā)酵工藝,使生物量由6.96×107cfu/mL提升到3×108cfu/mL;孔青等[17]利用CCD復(fù)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化丁酸梭菌淀粉培養(yǎng)基,最終生物量達(dá)到2.55×108個/mL;李雯靜等[18]通過PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基,其芽孢數(shù)最終為1.478×108cfu/mL,是優(yōu)化前的2.7倍。

本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對影響丁酸梭菌生物量發(fā)酵液的相關(guān)組分進(jìn)行初步優(yōu)化,最后通過響應(yīng)面法設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵配方,確定了最優(yōu)培養(yǎng)條件,以期為丁酸梭菌大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricumm),本實(shí)驗(yàn)室自行篩選獲得。種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,蛋白胨10 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,酵母浸粉3.0 g/L,NaCl 3.0 g/L,K2HPO42.5 g/L,硫代乙醇酸鈉0.30 g/L,半胱氨酸鹽酸鹽0.30 g/L,pH7.0;初始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,蛋白胨10 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,酵母浸粉3.0 g/L,NaCl 3.0 g/L,K2HPO42.5 g/L,pH7.0;以上試劑均為分析純。

表2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平

Table 2 The factors and levels of variables of CCD

因素編碼值與水平-1682-1011682A：酵母浸粉(g/L)466505560634B：FeSO4(g/L)14641618202136C：K2HPO4(g/L)28963134373904

PHS-25 pH計(jì) 上海雷磁;DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子活化 取-20 ℃甘油管保藏的菌種200 μL接種于裝有9 mL種子培養(yǎng)基的厭氧管中,37 ℃條件下靜態(tài)厭氧活化24 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 采用液體深層靜置培養(yǎng):250 mL三角瓶裝液量100 mL,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.3 菌體濃度測定 血球計(jì)數(shù)板法[19]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 最佳除氧劑的篩選實(shí)驗(yàn) 酸梭菌屬于嚴(yán)格厭氧菌,對培養(yǎng)液中溶解氧的濃度有嚴(yán)格要求,添加合適除氧劑可以降低培養(yǎng)液中的溶解氧濃度,利于菌體的生長。故選擇了Fe粉、FeSO4、抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫代乙醇酸鈉和亞硫酸鈉作為除氧劑,初始添加量均為0.1%(注:文中所出現(xiàn)的添加量“%”均為“v/w”)。

1.2.4.2 碳源的優(yōu)選實(shí)驗(yàn) 共選擇了葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖、甘油、蔗糖等7種碳源,初始添加量均為1%。

1.2.4.3 氮源的優(yōu)選實(shí)驗(yàn) 共選擇了蛋白胨、酵母浸膏、酵母浸粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米粉、大豆粉8種氮源,起始添加量均為1%。

1.2.4.4 金屬離子優(yōu)選實(shí)驗(yàn) 選擇了Mg2+、Zn2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+5種金屬離子,起始濃度均為5 mmol/L。

1.2.4.5 CaCO3添加量優(yōu)選實(shí)驗(yàn) 丁酸梭菌在代謝過程中會產(chǎn)生大量有機(jī)酸抑制菌體生長,添加一定量CaCO3有助于解除酸抑制。

1.2.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì) PB設(shè)計(jì)是一種2水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,是以最少量實(shí)驗(yàn)次數(shù)挑選出對丁酸梭菌有顯著性影響的因素的實(shí)驗(yàn)方法[20-21],對于N次實(shí)驗(yàn)至多可研究(N-1)個因素。本實(shí)驗(yàn)選取單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中對菌體生物量影響較大的培養(yǎng)基的5個組分以及初始培養(yǎng)基中的2種無機(jī)鹽共7個因素來進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn),每個因素取高(“+”)、低(“-”)2個水平,以菌體生物量為響應(yīng)值Y,共進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)選取可信度大于95%以上的因素作為影響菌體生物量的主要因素。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素和水平見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素與水平

Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman design

實(shí)驗(yàn)因素水平(g/L)-1+1A可溶性淀粉10003000B酵母浸粉20006000CFeSO46001800DNaCl200400EK2HPO415035FMgSO4012036GCaCO3050150

1.2.6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 依據(jù)PB實(shí)驗(yàn)所得到的顯著性因素,根據(jù)其正負(fù)效應(yīng)設(shè)定各因素的步長及變化方向進(jìn)行實(shí)驗(yàn),從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域,找到最大拐點(diǎn)值,確定下一步中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

1.2.7 最低添加量實(shí)驗(yàn) 在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的不顯著因素基礎(chǔ)上,以培養(yǎng)基最節(jié)省為目的研究不顯著因素的最低添加量。根據(jù)各因素效應(yīng)合理設(shè)計(jì)變化步長,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基成分最優(yōu)最小的用量。

1.2.8 中心組合(CCD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) CCD實(shí)驗(yàn)可利用有限的實(shí)驗(yàn)次數(shù),評價各個因素的影響,并分析各個因素之間的相互作用,分析過程中對實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shù)據(jù)進(jìn)行擬合。根據(jù)PB設(shè)計(jì)及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,通過軟件(Design-Experment 8.0.6)設(shè)計(jì)3因素5水平的實(shí)驗(yàn)來確定丁酸梭菌的最適培養(yǎng)基成份,見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳除氧劑的篩選實(shí)驗(yàn)分析 從圖1可以看出FeSO4的除氧效果最佳,菌體數(shù)可達(dá)2.69×108個/mL,故選擇FeSO4作為除氧劑;從圖2可以看出當(dāng)FeSO4添加量為1.2%時效果最佳,菌體數(shù)達(dá)到4.55×108個/mL,較之空白對照有顯著提高。

圖1 除氧劑對丁酸梭菌的影響Fig.1 The effect of deoxidant on the growth of C. butyricumm

圖2 FeSO4添加量對丁酸梭菌的影響Fig.2 The effect of addition amount of FeSO4 on the growth of C. butyricumm

2.1.2 碳源的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)分析 從圖3中可以看出,可溶性淀粉效果最佳,菌體量可達(dá)5.73×108個/mL,故選擇可溶性淀粉作為最佳碳源;從圖4可以看出當(dāng)添加量為2%時,菌體數(shù)達(dá)到最大為6.26×108個/mL,繼續(xù)增加其添加量菌體濃度開始下降,故選擇2%作為最適氮源添加量。

圖3 不同碳源對丁酸梭菌的影響Fig.3 The effect of carbon source on the growth of C. Butyricumm

圖4 可溶性淀粉添加量對丁酸梭菌的影響Fig.4 The effect of addition amount of soluble starch on the growth of C. butyricumm

2.1.3 氮源的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)分析 從圖5可看出酵母浸粉效果明顯優(yōu)于其它,菌體數(shù)可達(dá)4.10×108個/mL,玉米粉和大豆粉效果最差,故選酵母浸粉為最佳氮源;從圖6可以看出菌體數(shù)隨著酵母浸粉添加量的增加而升高,當(dāng)添加量為4%時達(dá)到最高,為6.86×108個/mL,故選擇4%作為最適氮源添加量。

圖6 酵母浸粉添加量對丁酸梭菌的影響Fig.6 The effect of addition amount of Yeast extract powder on the growth of C. butyricumm

圖7 不同金屬離子對丁酸梭菌的影響Fig.7 The effect of ions on the growth of C. butyricumm

2.1.4 金屬離子優(yōu)選實(shí)驗(yàn)分析 從圖7可看出Mg2+對丁酸梭菌生長有促進(jìn)作用,Zn2+、Ca2+、Mn2+則對其有抑制作用,Cu2+完全抑制其生長,故選Mg2+作為最佳金屬離子;其添加量由圖8可以看出為2 mmol/L時最佳,菌體數(shù)可達(dá)8.01×108個/mL。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸分析

Table 4 Regression analysis for the Plackett-Burman design

項(xiàng)效應(yīng)系數(shù)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差Tp常量674580196034410000?可溶性淀粉-02483-0124201960-0630561酵母浸粉1365006825019603480025?FeSO41831709158019604670010?NaCl0368301842019600940401K2HPO41195005975019603050038?MgSO40475002375019601210292CaCO30135000675019600340748

注:模型在5%水平時差異顯著,“*”代表顯著因素;表4與表8同。

表5 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

Table 5 Analysis of variable(ANOVA)for Plackett-Burman design

來源自由度SeqSSAdjSSAdjMSFp主效應(yīng)72126221262303756590044?殘差誤差41844184404611合計(jì)1123107R2=9202%R2Adj=7805%

圖8 Mg2+濃度對丁酸梭菌的影響Fig.8 The effect of concentration of Mg2+ on the growth of C. Butyricumm

2.1.5 CaCO3添加量優(yōu)選實(shí)驗(yàn)分析 從圖9中可以看出,CaCO3添加量為0.1%時效果最佳,菌體數(shù)達(dá)到8.45×108個/mL。

圖9 CaCO3添加量對丁酸梭菌的影響Fig.9 The effect of addition amount of CaCO3 on the growth of C. Butyricumm

2.2 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。對表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和回歸分析,分析結(jié)果見表4和表5。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 3 The Plackett-Burman experiment design and results

實(shí)驗(yàn)號ABCDEFG菌體數(shù)(×108個/mL)111-111-117032-1-1111-118253-11-1-1-11161641-1-1-1111566511-11-1-1-15646111-111-194271-111-11-16568-1-1-1-1-1-1-147591-11-1-1-1154210-111-11-1-179611-1-1-1111-157412-1111-111836

由表4可看出,該回歸模型的p值(prob>F)為<0.0001,為高度顯著,表明該模型在所得回歸區(qū)域擬合很好。且酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4的p分別為0.025、0.010和0.038,均小于0.05,表明酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著,是影響丁酸梭菌菌體量的三個主要因素,且全為正效應(yīng);其余因素的p值均大于0.05,表明在95%的置信區(qū)間內(nèi)是不顯著,對菌體量影響不大,可以通過后面的最低添加量實(shí)驗(yàn)來確定這些非顯著因素的添加量,以降低成本。由表5看出,該回歸模型的p值在95%的置信區(qū)間內(nèi)是顯著的,其決定系數(shù)R2=92.02%,表示模型中92.02%的數(shù)據(jù)都能用此模型來解釋。

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)的回歸分析和方差分析,按照各因素的正負(fù)效應(yīng)來設(shè)定最陡爬坡實(shí)驗(yàn):酵母浸粉、FeSO4、K2HPO4均為正效應(yīng),步長分別設(shè)為5、2、0.3 g/L，詳見表6。

表6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 6 Experiment design and results of the steepest ascent design

項(xiàng)目酵母浸粉(g/L)(+)FeSO4(g/L)(+)K2HPO4(g/L)(+)菌體數(shù)(×108個/mL)原點(diǎn)401225步長5203實(shí)驗(yàn)運(yùn)行140122578524514288333501631876455183490356020378136652240795

由表6可知,隨著實(shí)驗(yàn)序的進(jìn)行,第4組丁酸梭菌的菌體數(shù)最高,即酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4的用量分別為55、18 g/L和3.4 g/L時,菌體數(shù)為9.03×108個/mL,隨著運(yùn)行序的進(jìn)一步增加,丁酸梭菌的菌體數(shù)逐漸降低。故選酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4的添加量分別為55、18 g/L和3.4 g/L作為中心復(fù)合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖10 最低添加量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Fig.10 The design and result of minimum amount

2.4 最低添加量實(shí)驗(yàn)

由PB實(shí)驗(yàn)得到的4個不顯著因素可溶性淀粉、NaCl、MgSO4和CaCO3做最低添加量實(shí)驗(yàn),以期達(dá)到培養(yǎng)基成分最優(yōu)最小的用量。

由圖10a可知,隨著可溶性淀粉添加量的增加，丁酸梭菌菌體密度逐漸增加,當(dāng)添加量為20 g/L時,菌體數(shù)達(dá)到最大值9.03×108個/mL;由圖10b可知,NaCl的添加量為2 g/L時,丁酸梭菌菌體密度達(dá)到最大值9.01×108個/mL,而繼續(xù)增加NaCl用量后菌體數(shù)開始下降,故選擇NaCl的添加量為2 g/L;由圖10c可知,隨著MgSO4添加量的逐漸增加,其菌體數(shù)也隨著升高,在0.24 g/L時達(dá)到最大;由圖10d可知,隨著CaCO3含量的增加,丁酸梭菌菌體密度基本趨于平衡,為節(jié)省成本,故選擇CaCO3添加量為0 g/L。故最終確定可溶性淀粉、NaCl、MgSO4、CaCO3的添加量分別為20、2、0.24、0 g/L。

2.5 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn):選酵母浸粉55 g/L、FeSO418 g/L、K2HPO43.4 g/L。以此為中心點(diǎn),以丁酸梭菌菌體數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行3因素5水平的中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。其設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

表7 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 7 Design and result of Central composite design

實(shí)驗(yàn)號ABC菌體數(shù)(×108個/mL)111-1892-1-11931-1-19524-1-1-181250-1680818600093470009448-168009391680010881000094511-1119611200-168828131118941400010115000998160016889417-11-1801181-111021900010232001680787

響應(yīng)面分析中對CCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合二次模型方差分析如表8,模型的p值(prob>F)小于0.05,說明模型具有顯著性,該二次模型多元相關(guān)系數(shù)R2=90.17%,表明該模型能解釋90.17%的菌體密度變化;失擬項(xiàng)p值為0.6415大于0.05,表明失擬項(xiàng)不顯著,沒有失擬現(xiàn)象。A、C、B2、C2的p值均小于0.05表明對菌體密度的影響呈顯著性,AB之間的交互影響顯著。

根據(jù)軟件分析,以Y為菌體數(shù),A為酵母浸粉,B為FeSO4,C為K2HPO4,用多項(xiàng)式回歸技術(shù)對此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合所得二次多項(xiàng)式回歸方程為:Y(×108)=9.75+0.40A-0.14B+0.32C-0.30AB-0.22AC+0.010BC+0.16A2-0.57B2-0.37C2,該二次多項(xiàng)式方程的三維響應(yīng)面圖見圖11～圖13。

由圖11可知,當(dāng)FeSO4添加量不變時,隨著K2HPO4含量的增加,菌體數(shù)出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。同樣,當(dāng)K2HPO4含量不變時,隨著FeSO4添加量的增加,菌體數(shù)也出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。由圖12可知,當(dāng)酵母浸粉添加量不變時,FeSO4添加量對菌體數(shù)存在二次效應(yīng),其曲面呈現(xiàn)拋物面。由圖13可以看出K2HPO4和酵母浸粉之間的交互作用不是很明顯。

表8 響應(yīng)面二次式模型的方差分析表

Table 8 ANOVA Table of response surface quadratic model

項(xiàng)目平方和自由度均方F值p值顯著性Model11929132101900006顯著A酵母浸粉2212216900021?BFeSO402610262040184Ck2HPO41361136104700089?AB071107154500418?AC03910392980115BC800E-041800E-04616E-030939A203510352701315B24751475365500001?C21941194149600031?殘差1310013失擬項(xiàng)054501107106415非顯著純誤差0765015總離差132219R2=9017% R2Adj=8132%

對圖11～圖13分析可知,菌體數(shù)達(dá)到最大時,三個因素的編碼值分別為1.00(A)、-0.38(B)、0.13(C),即酵母浸粉6%、FeSO41.74%、K2HPO40.34%,得到此模型的一個最大響應(yīng)值為1.04×109個/mL,為了驗(yàn)證此模型預(yù)測的準(zhǔn)確性,在優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證,共進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn),其平均值為1.01×109個/mL,實(shí)測值與回歸方程預(yù)測值相對誤差很小。由此可見,用該回歸模型優(yōu)化丁酸梭菌發(fā)酵工藝進(jìn)行的分析和預(yù)測是可行的,且具有實(shí)用價值。最終優(yōu)化后丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基為:可溶性淀粉2%,酵母浸粉6%,FeSO41.74%,K2HPO40.34%,NaCl 0.2%。

圖11 磷酸氫二鉀和硫酸亞鐵的交互作用對菌體數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface for interaction effects of K2HPO4 and FeSO4 on cells

圖12 硫酸亞鐵和酵母浸粉的交互作用對菌體數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface for interaction effects of FeSO4 and Yeast extract powder on cells

圖13 磷酸氫二鉀和酵母浸粉的交互作用對菌體數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.13 Response surface for interaction effects of K2HPO4 and Yeast extract powder on cells

3 結(jié)論

本研究首先采用單因素實(shí)驗(yàn)對丁酸梭菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了最佳培養(yǎng)基組份:可溶性淀粉2%,酵母浸粉4%,FeSO41.2%,NaCl 0.3%,K2HPO40.25%,MgSO40.024%,CaCO30.1%,在此基礎(chǔ)上利用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出了影響丁酸梭菌生長的3個顯著性因素即:酵母浸粉、FeSO4、K2HPO4,隨后進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)找出CCD實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn),最后利用響應(yīng)面法分析確定丁酸梭菌最佳培養(yǎng)成份為:可溶性淀粉2%,酵母浸粉6%,FeSO41.74%,K2HPO40.34%,NaCl 0.2%,MgSO40.024%,菌體數(shù)達(dá)到1.01×109個/mL,較之初始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了4.39倍,為工業(yè)上丁酸梭菌微生態(tài)制劑大規(guī)模生產(chǎn)提供了有價值的參考。

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Optimization of fermentation process forClostridiumbutyricumusing response surface methodology

XING Hong-guan,LIN Jian-guo,ZHONG Xue-zhao,WANG Chang-gao,DU Xin,CAI Jun*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Responsesurfacemethodology(RSM)wasemployedtooptimizefermentationprocessforimprovingthebiomassofClostridium butyricumm.Onthebasisofsinglefactorexperiment,factorswhichinfluencedthebiomassofClostridium butyricummsignificantlywerescreenedbyPlackett-Burmandesign.Onthisbasis,thesteepestascentexperimentwasappliedtofindoutthecenterpointofcentralcompositedesignandtheminimumamountexperimentwasusedtoreducethecostofnon-significantfactors.Finally,themaximumresponsevaluewasidentifiedbyCCD.Theresultsshowedthat:Yeastextractpowder,FeSO4andK2HPO4werethethreefactorsinfluencingthebiomassofC. Butyricummsignificantly,solublestarch2%,yeastextractpowder6%,FeSO41.74%,K2HPO40.37%,NaCl0.2%andMgSO40.024%werethebestcombinationofmediumcomponent,thebiomassofClostridium butyricumreached1.01×109cells/mLwhichwas4.39timesthatofthebiomassbeforeoptimization.

Clostridium butyricumm;biomass;RSM;fermentationprocess

2016-03-14

邢宏觀(1989-)，男，碩士，研究方向:發(fā)酵過程優(yōu)化與放大，E-mail:759211628@qq.com。

*通訊作者:蔡俊(1968-)，男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵過程優(yōu)化與放大，E-mail:hgcaijun@126.com。

TS201.3

B

1002-0306(2016)19-0237-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.038